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Résumé

La capacité du bactériophage à déplacer l’ADN entre les cellules bactériennes en fait des outils efficaces pour la manipulation génétique de leurs hôtes bactériens. Présenté ici est une méthodologie pour induire, récupérer et utiliser φBB-1, un bactériophage de Borrelia burgdorferi, pour transduire l’ADN hétérologue entre différentes souches du spirochète de la maladie de Lyme.

Résumé

L’introduction d’ADN étranger dans le spirochète Borrelia burgdorferi a été presque exclusivement réalisée par transformation par électroporation. Ce processus a une efficacité nettement inférieure dans le spirochète de la maladie de Lyme par rapport à d’autres bactéries à Gram négatif mieux caractérisées. Le taux de réussite de la transformation dépend fortement de la concentration de quantités d’ADN de haute qualité provenant de milieux spécifiques et est sujet à une variabilité importante d’une souche à l’autre. D’autres moyens d’introduire de l’ADN étranger (c.-à-d. vecteurs navettes, rapporteurs fluorescents et marqueurs de résistance aux antibiotiques) dans B. burgdorferi pourraient constituer un ajout important à l’arsenal d’outils utiles pour la manipulation génétique du spirochète de la maladie de Lyme. Les bactériophages ont été bien reconnus comme des mécanismes naturels pour le mouvement de l’ADN entre les bactéries dans un processus appelé transduction. Dans cette étude, une méthode a été développée pour utiliser le phage borrélial omniprésent φBB-1 pour transduire l’ADN entre les cellules de B. burgdorferi de même fond génétique et de milieux génétiques différents. L’ADN transduit comprend à la fois de l’ADN borrélial et de l’ADN hétérologue sous forme de petits vecteurs navette. Cette démonstration suggère une utilisation potentielle de la transduction médiée par les phages comme complément à l’électroporation pour la manipulation génétique du spirochète de la maladie de Lyme. Ce rapport décrit les méthodes d’induction et de purification du phage φBB-1 de B. burgdorferi, l’utilisation de ce phage dans les essais de transduction, ainsi que la sélection et le criblage de transductants potentiels.

Introduction

Le développement d’outils pour la manipulation génétique de la bactérie spirochétale Borrelia burgdorferi a ajouté une valeur incommensurable à la compréhension de la nature de la maladie de Lyme 1,2,3,4. B. burgdorferi possède un génome exceptionnellement complexe composé d’un petit chromosome linéaire et de plasmides linéaires et circulaires 5,6. La perte plasmidique spontanée, le réarrangement intragénique (mouvement des gènes d’un plasmide à un autre au sein d’un même organisme) et le transfert horizontal de gènes (HGT, le mouvement de l’ADN entre deux organismes) ont donné lieu à une hétérogénéité génétique vertigineuse chez B. burgdorferi (pour un exemple, voir Schutzer et al.7). Les génotypes (ou « souches ») qui en résultent sont tous membres de la même espèce, mais présentent des différences génétiques qui influencent leur capacité à transmettre et à infecter différents mammifères hôtes 8,9,10,11. Dans le présent rapport, le terme « souche » sera utilisé pour désigner B. burgdorferi ayant un bagage génétique naturel particulier; Le terme « clone » sera utilisé pour désigner une souche qui a été génétiquement modifiée dans un but particulier ou à la suite d’une manipulation expérimentale.

La boîte à outils moléculaire disponible pour une utilisation chez B. burgdorferi comprend des marqueurs sélectionnables, des rapporteurs de gènes, des vecteurs navettes, une mutagénèse par transposon, des promoteurs inductibles et des marqueurs contre-sélectionnables (pour une revue, voir Drektrah et Samuels12). L’utilisation efficace de ces méthodologies nécessite l’introduction artificielle d’ADN hétérologue (étranger) dans une souche d’intérêt de B. burgdorferi. Chez B. burgdorferi, l’introduction de l’ADN hétérologue est réalisée presque exclusivement par électroporation, une méthode qui utilise une impulsion électrique pour rendre une membrane bactérienne transitoirement perméable à de petits morceaux d’ADN introduits dans le milieu1. La majorité des cellules (estimées à ≥99,5%) sont tuées par le pouls, mais les cellules restantes ont une fréquence élevée de rétention de l’ADN hétérologue13. Bien que considérée comme l’une des méthodes les plus efficaces pour introduire de l’ADN dans les bactéries, la fréquence d’électroporation dans B. burgdorferi est très faible (allant de 1 transformant sur 5 × 104 à 5 × 106 cellules)13. Les obstacles à l’obtention de fréquences de transformation plus élevées semblent être à la fois techniques et biologiques. Les obstacles techniques à une électroporation réussie de B. burgdorferi comprennent à la fois la quantité d’ADN (>10 μg) nécessaire et l’exigence que les spirochètes soient exactement dans la phase de croissance correcte (log moyen, entre 2 × 10 7 cellules·mL−1 et 7 × 107 cellules·mL−1) lors de la préparation de cellules électrocompétentes12,13. Ces obstacles techniques, cependant, peuvent être plus faciles à surmonter que les obstacles biologiques.

Les chercheurs sur la maladie de Lyme reconnaissent que les clones de B. burgdorferi peuvent être divisés en deux grandes catégories en ce qui concerne leur capacité à être manipulés génétiquement13,14. Les isolats à passage élevé adaptés au laboratoire sont souvent facilement transformés, mais ont généralement perdu les plasmides essentiels à l’infectiosité, se comportent de manière physiologiquement aberrante et ne sont pas capables d’infecter un hôte mammifère ou de persister dans un vecteurde tiques 12,13. Bien que ces clones aient été utiles pour disséquer la biologie moléculaire du spirochète en laboratoire, ils sont de peu de valeur pour étudier le spirochète dans le contexte biologique du cycle enzootique. Les isolats infectieux à faible passage, en revanche, se comportent d’une manière physiologique reflétant un état infectieux et peuvent compléter le cycle infectieux, mais sont généralement récalcitrants à l’introduction d’ADN hétérologue et sont, par conséquent, difficiles à manipuler pour l’étude12,13. La difficulté de transformer les isolats à faible passage est liée à au moins deux facteurs différents : (i) les isolats à faible passage s’agglutinent souvent étroitement, en particulier dans les conditions de haute densité requises pour l’électroporation, empêchant ainsi de nombreuses cellules d’appliquer pleinement la charge électrique ou d’accéder à l’ADN dans le milieu13,15; et ii) B. burgdorferi code pour au moins deux systèmes différents de restriction-modification (R-M) transmis par plasmide qui peuvent être perdus dans les isolats à passage élevé14,16. Les systèmes R-M ont évolué pour permettre aux bactéries de reconnaître et d’éliminer l’ADN étranger17. En effet, plusieurs études sur B. burgdorferi ont démontré que l’efficacité de la transformation augmente lorsque la source de l’ADN est B. burgdorferi plutôt qu’Escherichia coli13,16. Malheureusement, l’acquisition de la concentration élevée requise d’ADN pour l’électroporation de B. burgdorferi est une perspective coûteuse et chronophage. Une autre préoccupation potentielle lors de l’électroporation et de la sélection d’isolats à faible passage est que le processus semble favoriser les transformants qui ont perdu le plasmide critique associé à la virulence, lp2514,18,19; ainsi, l’acte même de manipuler génétiquement des isolats de B. burgdorferi à faible passage par électroporation peut sélectionner des clones qui ne conviennent pas à une analyse biologiquement pertinente dans le cycle enzootique20. Compte tenu de ces problèmes, un système dans lequel l’ADN hétérologue pourrait être électrotransformé en clones de B. burgdorferi à passage élevé, puis transféré dans des isolats infectieux à faible passage par une méthode autre que l’électroporation pourrait être un ajout bienvenu à la collection croissante d’outils moléculaires disponibles pour une utilisation dans le spirochète de la maladie de Lyme.

En plus de la transformation (l’absorption de l’ADN nu), il existe deux autres mécanismes par lesquels les bactéries absorbent régulièrement l’ADN hétérologue : la conjugaison, qui est l’échange d’ADN entre bactéries en contact physique direct les unes avec les autres, et la transduction, qui est l’échange d’ADN médié par un bactériophage21. En effet, la capacité du bactériophage à médier HGT a été utilisée comme outil expérimental pour disséquer les processus moléculaires dans un certain nombre de systèmes bactériens22,23,24. B. burgdorferi n’est pas naturellement compétent pour l’absorption de l’ADN nu, et il y a peu de preuves que B. burgdorferi code l’appareil nécessaire pour favoriser une conjugaison réussie. Des rapports antérieurs ont décrit, cependant, l’identification et la caractérisation préliminaire de φBB-1, un bactériophage tempéré de B. burgdorferi25,26,27,28. φBB-1 regroupe une famille de plasmides de 30 kb trouvés dans B. burgdorferi25; Les membres de cette famille ont été désignés CP32. Conformément au rôle de φBB-1 dans la participation au HGT parmi les souches de B. burgdorferi, Stevenson et al. ont rapporté un cp32 identique trouvé dans deux souches avec des cp32 autrement disparates, suggérant un partage récent de ce cp32 entre ces deux souches, probablement par transduction29. Il existe également des preuves d’une recombinaison significative via HGT parmi les cp32 dans un génome 30,31,32,33 par ailleurs relativement stable. Enfin, la capacité de φBB-1 à transduire à la fois cp32s et l’ADN vectoriel navette hétérologue entre cellules de la même souche et entre cellules de deux souches différentes a été démontrée précédemment27,28. Compte tenu de ces résultats, φBB-1 a été proposé comme un autre outil à développer pour la dissection de la biologie moléculaire de B. burgdorferi.

L’objectif de ce rapport est de détailler une méthode pour induire et purifier le phage φBB-1 de B. burgdorferi, ainsi que de fournir un protocole pour effectuer un test de transduction entre clones de B. burgdorferi et sélectionner et cribler des transducteurs potentiels.

Protocole

Toutes les expériences utilisant de l’ADN recombinant et des organismes BSL-2 ont été examinées et approuvées par le comité institutionnel de biosécurité de l’Université Quinnipiac.

1. Préparation de la culture de B. burgdorferi pour la production de φBB-1

  1. Préparer le milieu Barbour-Stoenner-Kelly complété par 6,6 % de sérum normal de lapin (BSK)15. Pour 1 L de 1x BSK, combiner les composants énumérés au tableau 1 dans 900 mL d’eau, ajuster le pH à 7,6 en utilisant 1 N d’hydroxyde de sodium et mélanger lentement à 4 °C pendant 2-4 h. Une fois le mélange terminé, vérifiez et réajustez le pH à 7,6 si nécessaire, et augmentez le volume à 1 L avec de l’eau. Stériliser le milieu en passant à travers un filtre de 0,22 μM (voir le tableau des matières) et l’utiliser frais ou conserver à 4 °C pendant ≤2 mois.
  2. Trois à cinq jours avant le début du protocole de transduction, inoculer 150 μL du ou des clones appropriés de B. burgdorferi dans 15 mL de 1x BSK dans des tubes centrifugés coniques stériles hermétiquement coiffés (voir le tableau des matériaux). Compléter le milieu avec la concentration appropriée d’antibiotiques ou de combinaison d’antibiotiques pour la sélection et le maintien de l’ADN hétérologue dans le(s) clone(s) de B. burgdorferi (tableau 2).
    REMARQUE : B. burgdorferi est un organisme de niveau de biosécurité 2. Prenez toutes les précautions appropriées lorsque vous travaillez avec cet organisme. Effectuer tous les travaux avec des cultures vivantes de B. burgdorferi dans une enceinte de biosécurité de classe II certifiée et correctement désinfectée. Éliminer correctement tout le matériel qui entre en contact avec B. burgdorferi et les organismes eux-mêmes conformément aux directives34 du CDC.
  3. Incuber les cultures à 33 °C sans les agiter jusqu’à ce qu’elles atteignent une densité de ≥5 × 107 spirochètes·mL−1, ce qui prend environ 3-5 jours.

2. Déterminer la densité de la ou des cultures de B. burgdorferi (modifiées à partir de Samuels)15

  1. Pour les densités prévues supérieures à 5 × 106 cellules·mL−1, déterminer la densité cellulaire par spectroscopie.
    1. Transvaser 1 mL de culture dans un tube microcentrifuge de 1,7 mL et centrifuger à 8 000 x g pendant 5 min à température ambiante.
    2. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 1 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4 et 1,8 mM KH2PO4). Transférer la suspension cellulaire entière dans une cuvette transparente semi-micro UV.
    3. Déterminer la densité optique de l’échantillon remis en suspension à une longueur d’onde de 600 nm (A600). Remettre à zéro le spectrophotomètre (voir le tableau des matériaux) par rapport au PBS.
    4. Pour calculer la concentration de spirochètes·mL−1 dans la culture d’origine, multiplier la densité optique à A600 par 1,4 × 109.
  2. Pour les densités prévues comprises entre 5 × 104 cellules·mL−1 et 5 × 106 cellules·mL−1, déterminer la densité cellulaire à l’aide d’une chambre de comptage Petroff-Hausser (voir Tableau des matériaux) pour compter directement le nombre de spirochètes. Cette méthode peut également être utilisée pour des densités plus élevées après une dilution appropriée.
    REMARQUE: La visualisation de spirochètes vivants nécessite un microscope modifié avec un condenseur à fond noir.
    1. Appliquer 10 μL d’échantillon sur la chambre de comptage et couvrir avec le verre de couverture approprié. Pour les densités supérieures à 1 × 107, diluer l’échantillon dans du PBS pour obtenir 50 à 100 spirochètes par champ.
    2. Comptez les cellules à l’aide d’un microscope à fond noir à un grossissement de 200x-400x. Comptez tout le champ de 25 groupes de 16 petits carrés dans tous les plans.
    3. Multiplier le nombre compté par le facteur de dilution (le cas échéant) et 5 × 104 pour obtenir des cellules·mL−1 de culture originale.

3. Induction du phage φBB-1 de B. burgdorferi

NOTE: Stériliser toute la verrerie et la plastifice par autoclavage; stériliser toutes les solutions par autoclavage ou filtration à travers un filtre de 0,22 μM. Les étapes ci-dessous sont présentées en fonction de volumes de 15 mL, mais la méthode est évolutive à des volumes plus ou moins grands en fonction des besoins individuels de l’expérience.

  1. Pour la culture de B. burgdorferi à partir de laquelle le phage sera produit (le donneur), utiliser la concentration calculée par l’une ou l’autre méthode à l’étape 2 pour déterminer le volume de culture de démarrage nécessaire pour donner 4 mL de 2 × 108 spirochètes·mL−1. Cela donnera une concentration finale de 5 × 107 spirochètes·mL−1 dans 15 mL pendant la phase de récupération (étape 3.6 ci-dessous).
  2. Centrifuger le volume de culture calculé à l’étape 3.1 à 6 000 x g pendant 10 min. Décanter le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 4 mL de BSK frais. Transférer l’échantillon dans le plus petit tube stérile disponible pour contenir l’échantillon avec un minimum d’espace pour la tête.
  3. Ajouter la quantité appropriée d’agent inducteur à la concentration recommandée (tableau 3) en fonction d’un volume de culture de 4 mL pour induire la production de phages. Boucher hermétiquement le tube et bien mélanger.
  4. Incuber l’échantillon à 33 °C pendant 2-4 h.
  5. Après l’incubation, transférer l’échantillon dans un tube à centrifuger de 15 mL. Centrifuger l’échantillon à 6 000 x g pendant 10 min. Décanter le surnageant.
  6. Remettez en suspension la pastille de cellule dans 15 mL de 1x BSK.
    REMARQUE: Après l’induction du phage, il existe deux façons différentes de procéder au test de transduction. Ces méthodes sont présentées à la figure 1 et aux étapes 4 et 6.

4. Transduction au cours de la co-culture suivant l’exposition du donneur à l’agent inducteur (Figure 1A)

REMARQUE : Ce protocole ne peut être utilisé que lorsque la souche productrice de phages (donneur) est résistante à un antibiotique particulier et que la souche à transduire (receveur) est résistante à un autre antibiotique.

  1. Préparer une culture de B. burgdorferi à utiliser comme receveur dans les essais de transduction, comme décrit pour la souche donneuse à l’étape 1 ci-dessus. Sur la base de la densité déterminée à l’étape 2, calculer le volume nécessaire pour obtenir 15 mL de 1 × 107 spirochètes·mL−1.
  2. Centrifuger le volume de culture calculé à l’étape 4.1 à 6 000 x g pendant 10 min. Décanter le surnageant.
  3. Remettez en suspension la pastille dans 1 mL de culture à partir de l’étape 3.6 (donneur de phage remis en suspension). Ajoutez le receveur remis en suspension dans la culture avec le donneur. Ne pas compléter avec des antibiotiques. Le volume total contenant les deux cultures est de 15 mL.
  4. Incuber à 33 °C pendant 72-96 h.
  5. Effectuer la sélection des transducteurs par placage en phase solide après co-culture comme décrit à l’étape 7.

5. Précipitation du polyéthylèneglycol (PEG) pour récupérer le phage en vue de son utilisation dans les essais de transduction

REMARQUE : Ce protocole peut être utilisé dans les cas où la souche productrice de phages (donneur) est résistante à un antibiotique particulier et que la souche à transduire (receveur) n’a aucune résistance aux antibiotiques ou une résistance à un autre antibiotique.

  1. Compléter la culture de l’étape 3.6 avec l’antibiotique approprié à la concentration indiquée dans le tableau 2. Incuber l’échantillon à 33 °C pendant 72-96 h.
  2. Préparer des solutions pour les précipitations PEG.
    1. Préparer 500 mL de NaCl 5 M. Stériliser à l’autoclave et laisser refroidir avant utilisation. Conserver à température ambiante.
    2. Préparer 500 mL de PEG à 40 % en dissolvant 200 g de PEG8000 dans 400 mL d’eau; Chauffer doucement en remuant jusqu’à ce que la solution soit bien mélangée. Porter le volume à 500 mL avec de l’eau. Pour dissoudre complètement le PEG8000 et stériliser la solution, autoclaver la solution et la laisser refroidir avant utilisation. Conserver à température ambiante.
    3. Préparer 100 mL de milieu suspension (SM; 100 mM NaCl, 10 mMMgSO4 et 50 mM Tris-HCl [pH 7,5]). Stériliser à l’autoclavage. Conserver à 4 °C.
  3. Pour la précipitation PEG du phage du clone donneur de B. burgdorferi (à partir de l’étape 3.6), après 72-96 h d’incubation, centrifuger les échantillons à 8 000 x g pendant 20 min à 4 °C.
  4. Décanter le surnageant dans un tube conique propre de 50 mL; Jetez la pastille de cellule. Ajouter 5 M de NaCl à une concentration finale de 1 M. Bien mélanger. Rock doucement à température ambiante pendant 1 h.
  5. Centrifuger les échantillons à 8 000 x g pendant 10 min à 4 °C. Décanter le surnageant dans un tube conique propre de 50 mL; La pastille peut être petite ou absente. Ajouter la solution de PEG8000 à 40% au surnageant jusqu’à une concentration finale de 10%. Bien mélanger et mettre sur la glace pendant plus de 1 h jusqu’à toute la nuit.
    REMARQUE: Des temps plus longs ne semblent pas corréler avec une augmentation significative de la récupération des phages.
  6. Centrifuger les échantillons à 8 000 x g pendant 20 min à 4 °C. Jetez le surnageant et retirez autant de liquide en excès que possible sans perdre aucune pastille, qui contient les particules de phage.
  7. Remettez la pastille en suspension dans un volume minimal de SM, en utilisant le SM pour laver le côté de la bouteille et recueillir toutes les particules de phage potentielles. Le rapport recommandé est de 400 μL de SM par 10 mL de surnageant d’origine, mais selon la taille de la pastille, plus ou moins de SM peut être nécessaire pour une remise en suspension complète.
  8. Traiter l’échantillon de phage récupéré avec un volume égal de chloroforme en fonction du volume de remise en suspension. Bien mélanger l’échantillon, puis centrifuger à 8 000 x g pendant 10 min. Retirez la couche aqueuse (supérieure) dans un tube propre, en évitant toute couche d’interface épaisse.
    NOTE: φBB-1 est un bactériophage non enveloppé et n’est pas sensible au traitement au chloroforme25. Cette étape est effectuée pour perturber davantage toutes les structures liées à la membrane (c.-à-d. les cellules ou les blebs) et pour tuer tout contaminant cellulaire potentiel. Le chloroforme est un organique volatil et ne doit être utilisé que dans une hotte bien ventilée; jeter les matières contenant du chloroforme en tant que déchets organiques.
  9. Déterminer le volume récupéré après le premier traitement au chloroforme et traiter à nouveau l’échantillon avec une quantité de chloroforme égale à 10 % de ce volume. Bien mélanger et centrifuger à 8 000 x g pendant 10 min. Retirez la couche aqueuse (supérieure), en prenant soin d’éviter toute couche d’interface ou organique. Transférer la couche aqueuse dans un tube propre.
  10. Utilisez le phage immédiatement (comme décrit à l’étape 6) ou conservez à 4 °C.
    REMARQUE : La congélation d’échantillons de phages φBB-1 n’est pas recommandée. Bien que la stabilité de φBB-1 à 4 °C n’ait pas été rigoureusement étudiée, des échantillons conservés à 4 °C jusqu’à 1 mois après la récupération ont été utilisés avec succès dans des essais de transduction.

6. Essai de transduction après précipitation PEG de φBB-1 (Figure 1B)

  1. Préparer des cultures de B. burgdorferi à utiliser comme receveur dans les essais de transduction, comme décrit pour la souche donneuse à l’étape 1 ci-dessus. Sur la base de la densité déterminée à l’étape 2, calculer le volume de culture du receveur nécessaire pour produire 15 mL de 1 × 107 spirochètes·mL−1.
  2. Centrifuger le volume de culture calculé à l’étape 6.1 à 6 000 x g pendant 10 min. Décanter le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 14,5 mL de BSK frais.
  3. Ajouter ≤ 500 μL d’échantillon de phage précipité au PEG (à partir de l’étape 5) à la culture du clone receveur. Bien mélanger et incuber à 33 °C pendant 72-96 h.
    REMARQUE : La quantité de phage récupérée lors de la précipitation de PEG peut être variable, en fonction d’un certain nombre de facteurs. Cependant, à partir d’une culture de 15 mL de la souche CA-11.2A induite de B. burgdorferi , 500 μL contient généralement 50 à 1 000 phages28 viables. Les volumes de récupération des phages ≥ 500 μL nuisent à la croissance de B. burgdorferi , probablement en raison de l’augmentation du rapport entre le SM et la BSK.
  4. Effectuer la sélection des transducteurs par placage en phase solide après mélange avec un phage précipité de PEG comme décrit à l’étape 7.

7. Sélection des transductants

NOTE: Le placage en phase solide des transducteurs potentiels est effectué en utilisant une modification monocouche du protocole décrit pour la première fois par Samuels15. Les colonies de B. burgdorferi se développent dans l’agar-agar, de sorte que pour la sélection des transducteurs par placage en phase solide, les échantillons doivent être ajoutés au milieu pendant que les plaques sont versées. Une autre méthode de sélection des transformants utilisant une méthode de dilution dans des plaques à 96 puits a également été décrite précédemment35. Cette technique pourrait également être efficace pour la sélection des transducteurs, mais n’a pas encore été essayée à cette fin.

  1. Déterminer le nombre de plaques nécessaires pour la sélection des transducteurs en fonction du nombre d’échantillons provenant des essais de transduction et des témoins à plaquer.
    REMARQUE : En règle générale, deux plaques sont versées par échantillon, l’une équivalant à environ 10 % du volume de culture et l’autre comprenant le reste de la culture. De plus, versez des plaques qui servent de témoins négatifs pour vérifier individuellement que la préparation de phage et/ou les clones parents utilisés comme donneur et receveur ne se développent pas en présence de l’antibiotique ou des antibiotiques utilisés lors de la sélection. La préparation du matériel de placage pour au moins deux plaques supplémentaires est également recommandée. Par exemple, si le nombre d’échantillons et de témoins à plaquer est de huit, préparer suffisamment de mélange de placage pour 10 plaques.
  2. Préparer les solutions pour le placage comme décrit ci-dessous.
    REMARQUE : Chaque plaque sera de 30 mL, composée de 20 mL de 1,5x BSK pour le placage et de 10 mL d’agarose à 2,1 % (rapport 2:1). Cela donnera une plaque avec des concentrations finales de 1x BSK et 0,7% d’agarose. Par exemple, pour 10 plaques, préparer un mélange de placage total de 300 mL, composé de 200 mL de 1,5x BSK et de 100 mL d’agarose à 2,1%.
    1. Préparer 1 L de 1,5x BSK comme décrit pour 1x BSK à l’étape 1.1 en utilisant les quantités de chaque composant indiqué pour 1,5x BSK dans le tableau 1. Conserver comme décrit pour 1x BSK.
    2. Préparer 2,1% d’agarose dans l’eau et l’autoclave. Utilisez la solution d’agarose fraîche ou conservez-la à température ambiante. S’il est conservé à température ambiante, cuire au micro-ondes avec le couvercle lâchement jusqu’à ce qu’il soit complètement fondu avant le placage.
    3. Déterminer le volume d’antibiotique(s) nécessaire(s) pour atteindre la concentration appropriée (tableau 2) en fonction de l’ensemble du mélange de placage.
      REMARQUE : Si le volume total de la solution finale de placage est de 300 mL, mélanger 200 mL de 1,5x BSK et suffisamment d’antibiotique pour s’assurer que la totalité des 300 mL a la concentration finale correcte d’antibiotiques. Si le donneur et le receveur de l’essai de transduction ont des gènes de résistance aux antibiotiques différents, le mélange de placage doit contenir les deux antibiotiques. Si le phage précipité par PEG du donneur (tel que préparé à l’étape 5) code pour un marqueur de résistance aux antibiotiques et que le receveur n’en a aucun, le mélange de placage ne doit contenir qu’un seul antibiotique.
  3. En fonction du nombre d’assiettes à verser, transférer la quantité appropriée de 1,5x BSK et d’antibiotique(s) dans un flacon stérile suffisamment grand pour contenir tout le mélange de placage. Équilibrer au bain-marie à 56 °C pendant ≥15 min.
  4. Équilibrer l’agase fondue de l’autoclave ou du micro-ondes dans un bain-marie à 56 °C pendant ≥15 min.
  5. Après l’équilibre, ajouter la quantité déterminée d’agarose à 2,1% dans le flacon avec le BSK 1,5x (avec antibiotique) et remettre la solution de placage au bain-marie à 42 °C pendant 10-15 min.
    NOTE: Des températures plus élevées peuvent endommager ou tuer les spirochètes36. Si vous utilisez le même bain-marie que ci-dessus, refroidissez le bain-marie à 42-45 °C avant de démarrer la minuterie pour l’équilibre. Ne laissez pas la solution de placage s’équilibrer à 42 °C pendant plus de 20 minutes, sinon elle commencera à se solidifier en versant les plaques.
  6. Pendant l’équilibration, préparer les échantillons de B. burgdorferi à plaquer. Transférer la quantité à plaquer dans un tube centrifuge conique stérile de 50 ml (voir le tableau des matières).
    1. Si vous plaquez une quantité inférieure à 1,5 ml (<5 % du volume final de 30 ml de la plaque), transférer l’échantillon dans le nouveau tube et ajouter le mélange de placage directement à l’échantillon pendant le placage.
    2. Pour des volumes plus importants, transférer le volume de culture souhaité dans le nouveau tube, puis centrifuger à 6 000 x g pendant 10 min à température ambiante. Décanter tout sauf 100-500 μL du surnageant et utiliser le reste pour remettre complètement en suspension la pastille avant le placage.
    3. Pour les plaques témoins après co-culture, ajouter ≥10à 7 cellules des clones donneurs ou receveurs dans des tubes centrifugés coniques stériles de 50 mL. Si le volume est supérieur à 1,5 mL, centrifuger et remettre en suspension la pastille comme indiqué à l’étape 7.6.2. Si un essai de transduction a été effectué à l’aide du phage précipité par PEG, en plus du clone receveur, ajouter 100 à 250 μL de l’échantillon de phage dans un tube conique stérile de 50 mL pour le placage.
  7. Une fois que la solution de placage s’est équilibrée à 42-45 °C pendant 10-15 min, transférer 30 mL de la solution de placage dans un tube avec l’échantillon approprié; Distribuer immédiatement le mélange de placage et l’échantillon dans une plaque étiquetée. Répéter avec une pipette fraîche pour chaque échantillon à plaquer.
  8. Laisser les plaques se solidifier pendant 15-20 min, puis les placer dans un incubateur à 33 °C supplémenté en 5% de CO2. Ne pas retourner les plaques pendant au moins 48 heures après avoir été versées.
  9. En fonction des antécédents du clone receveur, vérifier que les colonies apparaissent dans l’agarose sur les plaques de sélection après 10 à 21 jours d’incubation. Prélever au moins 5 à 10 colonies qui poussent dans l’assiette en présence des deux antibiotiques à l’aide d’une pipette en borosilicate stérilisée à bouchon de coton 5,75 (voir le tableau des matériaux) et inoculer 1,5 ml de 1x BSK avec le ou les antibiotiques appropriés.
  10. Cultiver les colonies inoculées à 33 °C comme à l’étape 1.3 pendant 3 à 5 jours ou jusqu’à ce qu’elles atteignent une densité d’environ 20 à 40 spirochètes par champ à un grossissement de 200x en utilisant la microscopie à fond noir.
    NOTE: Une fois criblés (voir étape 8), les spirochètes peuvent être congelés pour un stockage à long terme à −80 ° C en mélangeant un volume égal de culture avec un mélange de 60% de glycérol et 40% 1x BSK stérilisé par filtration à travers un filtre de 0,22 μm.

8. Vérification des transducteurs potentiels

REMARQUE : Criblez les clones qui poussent sur des plaques en présence de deux antibiotiques pour vérifier qu’ils représentent de vrais transducteurs dans le contexte prévu (receveur). Ces méthodes sont basées sur l’amplification, et potentiellement le séquençage, de régions spécifiques par la réaction en chaîne de la polymérase. Les protocoles et pratiques détaillés de la PCR chez B. burgdorferi sont décrits ailleurs (pour un exemple récent, voir Seshu et al.37). Sélectionnez les amorces utilisées pour le dépistage des transducteurs en fonction des souches utilisées. Certaines suggestions sur la façon d’aborder le dépistage des transducteurs sont décrites ci-dessous.

  1. Préparer les lysats de B. burgdorferi pour le dépistage par PCR.
    NOTE: Le protocole suivant est utilisé pour produire des lysats de B. burgdorferi lavés à partir de cellules cultivées comme à l’étape 7.9 pour une analyse immédiate de l’ADN par PCR. Cette méthode est conçue pour minimiser l’interférence des inhibiteurs potentiels dans la BSK, mais n’est pas recommandée pour la production d’ADN de haute qualité pour le séquençage ou le stockage. À cette fin, utilisez un protocole ou une trousse pour l’extraction totale du génome (voir le tableau des matériaux). Il est fortement recommandé que les lysats des clones parents (souches donneuse et receveuse) soient également préparés en même temps pour être inclus dans chaque analyse.
    1. Transvaser 500 μL de chaque transducteur potentiel sélectionné et mis en culture comme à l’étape 7.10 dans un tube microcentrifuge propre.
    2. Centrifuger les cultures pendant 10 min à 8 000 x g à température ambiante.
    3. Retirer le surnageant et remettre en suspension chaque pastille dans 500 μL de TE (10 mM Tris Cl, pH 8,0; 1 mM EDTA, pH 8,0). Centrifuger pendant 5 min à 8 000 x g à température ambiante.
    4. Retirer le surnageant et remettre en suspension chaque pastille dans 50 μL d’eau de qualité PCR. Faire bouillir les échantillons pendant 10 min. Laisser refroidir brièvement, puis centrifuger à 8 000 x g pendant 10 min à température ambiante.
    5. Pour chaque PCR, utiliser immédiatement 2 μL à partir du haut de l’échantillon centrifugé; Évitez de déranger le granulé.
  2. Cribler les transducteurs potentiels pour les gènes spécifiques codant pour la résistance aux antibiotiques par PCR. Voir le tableau 4 pour les amorces pour le dépistage des marqueurs de résistance aux antibiotiques couramment utilisés dans les essais de transduction.
    NOTE: Bien que rare dans notre expérience, une mutation spontanée des antibiotiques aminoglycosides utilisés pour la sélection de l’ADN hétérologue chez B. burgdorferi peut se produire.
  3. Examiner les transducteurs potentiels à l’aide d’un autre marqueur de souche ou de clone pour confirmer que le fond est celui du receveur. Inclure à la fois les clones parents donneurs et receveurs dans ces analyses. Dépistage des marqueurs spécifiques à la souche à l’aide de séquences basées sur les souches utilisées et de protocoles de laboratoire individuels pour déterminer l’intégrité de la souche.
  4. Si vous tentez de transduire en clones virulents pour une utilisation dans le vecteur tique ou l’hôte mammifère ou pour une comparaison directe avec un autre clone, déterminer la teneur complète en plasmides des transducteurs et des clones parents. Ceci est fait pour assurer le même contenu plasmidique que celui de la souche comparative ou la présence des éléments génétiques nécessaires à la propagation dans le cycle enzootique, comme il est décrit ailleurs 18,19,37,38,39.

Résultats

L’utilisation de bactériophages pour déplacer l’ADN entre des souches ou des clones de B. burgdorferi plus facilement transformables qui sont récalcitrants à l’électrotransformation représente un autre outil pour l’étude moléculaire continue des déterminants de la maladie de Lyme. Le test de transduction décrit ici peut être modifié au besoin pour faciliter le mouvement de l’ADN entre les clones d’intérêt en utilisant un ou deux antibiotiques pour la sélection de transducteurs potentie...

Discussion

L’utilisation de la transduction pourrait représenter une méthode pour surmonter au moins certaines des barrières biologiques et techniques associées à l’électrotransformation de B. burgdorferi 1,4,13,37. Dans de nombreux systèmes, le bactériophage peut déplacer l’ADN de l’hôte (non prophage) entre les cellules bactériennes par transduction généralisée ou spécial...

Déclarations de divulgation

L’auteur n’a rien à divulguer.

Remerciements

L’auteur tient à remercier Shawna Reed, D. Scott Samuels et Patrick Secor pour leur discussion utile, ainsi que Vareeon (Pam) Chonweerawong pour leur assistance technique. Ce travail a été soutenu par le Département des sciences biomédicales et des subventions de recherche du corps professoral à Christian H. Eggers de l’École des sciences de la santé de l’Université Quinnipiac.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
1 L filter units (PES, 0.22 µm pore size)Millipore SigmaS2GPU10RE
12 mm x 75 mm tube (dual position cap) (polypropylene)USA Scientific1450-0810holds 4 mL with low void volume (for induction)
15 mL conical centrifuge tubes (polypropylene)USA Scientific5618-8271
1-methyl-3-nitroso-nitroguanidine (MNNG)Millipore SigmaCAUTION: potential carcinogen; no longer readily available, have not tested offered substitute
5.75" Pasteur Pipettes (cotton-plugged/borosilicate glass/non-sterile)Thermo Fisher Scientific13-678-8Aautoclave prior to use
50 mL conical centrifuge tubes (polypropylene)USA Scientific1500-1211
Absolute ethanol
Agarose LEDot Scientific inc.AGLE-500
Bacto NeopeptoneGibcoDF0119-17-9
Bacto TC YeastolateGibco255772
Bovine serum albumin (serum replacement grade)Gemini Bio-Products700-104P
Chloroform (for molecular biology)Thermo Fisher ScientificBP1145-1CAUTION: volatile organic; use only in a chemical fume hood
CMRL-1066 w/o L-Glutamine (powder)US BiologicalC5900-01cell culture grade
ErythromycinResearch Products International CorpE57000-25.0
Gentamicin reagent solutionGibco15750-060
Glucose (Dextrose Anhydrous)Thermo Fisher ScientificBP350-500
HEPESThermo Fisher ScientificBP310-500
Kanamycin sulfateThermo Fisher Scientific25389-94-0
Millex-GS (0.22 µM pore size)Millipore SigmaSLGSM33SSto filter sterilize antibiotics and other small volume solutions
Mitomycin CThermo Fisher ScientificBP25312CAUTION: potential carcinogen; use only in a chemical fume hood
N-acetyl-D-glucosamineMP Biomedicals, LLC100068
Oligonucleotides (primers for PCR)IDT DNA
OmniPrep (total genomic extraction kit)G Biosciences786-136
Petri Dish (100 mm × 15 mm)Thermo Fisher ScientificFB0875712
Petroff-Hausser counting chamberHausser scientificHS-3900
Petroff-Hausser counting chamber cover glassHausser scientificHS-5051
Polyethylene glycol 8000 (PEG)Thermo Fisher ScientificBP233-1
Rabbit serum non-sterile trace-hemolyzed young (NRS)Pel-Freez Biologicals31119-3heat inactivate as per manufacturer's instructions
Semi-micro UV transparent cuvettesUSA Scientific9750-9150
Sodium bicarbonateThermo Fisher ScientificBP328-500
Sodium chlorideThermo Fisher ScientificBP358-1
Sodium pyruvateMillipore SigmaP8674-25G
Spectronic Genesys 5Thermo Fisher Scientific
Streptomycin sulfate solutionMillipore SigmaS6501-50G
Trisodium citrate dihydrateMillipore SigmaS1804-500Gsodium citrate for BSK

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