Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

المفصل المعقد الكاحل تحت الكاحل (ASCJ) هو جوهر القدم ويلعب دورا رئيسيا في التحكم في التوازن في الأنشطة اليومية. غالبا ما تؤدي الإصابات الرياضية إلى عدم الاستقرار في هذا المفصل. هنا ، نصف نموذج فأر لعدم الاستقرار الناجم عن قطع الرباط في ASCJ.

Abstract

ربما تكون التواءات الكاحل أكثر الإصابات الرياضية شيوعا في الحياة اليومية ، وغالبا ما تؤدي إلى عدم استقرار المفصل المعقد تحت الكاحل (ASCJ) ، ويمكن أن تؤدي في النهاية إلى هشاشة العظام بعد الصدمة (PTOA) على المدى الطويل. ومع ذلك ، نظرا لتعقيد آلية الإصابة والمظاهر السريرية ، مثل الكدمات أو الورم الدموي أو الرقة في القدم الجانبية ، لا يوجد إجماع سريري على تشخيص وعلاج عدم استقرار ASCJ. نظرا لأن البنية العضلية الهيكلية لعظام وأربطة مؤخرة الفأر يمكن مقارنتها بتلك الموجودة في البشر ، فقد تم إنشاء نموذج حيواني لعدم استقرار ASCJ في الفئران عن طريق قطع الأربطة حول ASCJ. تم التحقق من صحة النموذج بشكل جيد من خلال سلسلة من الاختبارات السلوكية والتحليلات النسيجية ، بما في ذلك اختبار شعاع التوازن ، وتحليل البصمة (تقييم مستوى التمرين والقدرة على التوازن في الفئران) ، وتقييم استشعار الألم الحراري (تقييم الوظيفة الحسية للقدم في الفئران) ، والتصوير المقطعي المحوسب الدقيق (CT) ، وتلطيخ مقطع الغضروف المفصلي (تقييم تلف الغضروف المفصلي وانحطاطه في الفئران). سيوفر الإنشاء الناجح لنموذج فأر لعدم استقرار ASCJ مرجعا قيما للبحث السريري حول آلية الإصابة ويؤدي إلى خيارات علاج أفضل لالتواء الكاحل.

Introduction

التواء الكاحل هي واحدة من أكثر الإصابات الرياضية شيوعا في جميع أنحاء العالم. تشير التقديرات إلى أن 10000 شخص يصابون يوميا في الولايات المتحدة1 ، منهم إصابات مرتبطة بالرياضة تمثل 15٪ -45٪2. التكاليف الطبية المرتبطة بعلاج التواء الكاحل في الولايات المتحدة تصل إلى 4.2 مليار دولار سنويا3،4،5. يعد عدم استقرار القدم المزمن مشكلة شائعة بعد التواء الكاحل ويحدث في حوالي 74٪ من التواء الكاحل6 ، بما في ذلك عدم استقرار الكاحل أو تحت الكاحل. ومع ذلك ، نظرا للأعراض والعلامات السريرية المماثلة ، يصعب على الطاقم الطبي التمييز بين ما إذا كان عدم استقرار الكاحل المزمن مصحوبا أيضا بعدم استقرار المفصل تحت الكاحل المزمن في العيادة ، ونتيجة لذلك ، يمكن بسهولة تفويت عدم الاستقرار المزمن تحت الكاحل. لذلك ، قد يكون معدل الإصابة الحقيقي لعدم استقرار المفصل المعقد المزمن في الكاحل (ASCJ) (نوع معين من عدم استقرار القدم المزمن الذي يشمل كلا من عدم استقرار الكاحل المزمن وعدم الاستقرار المزمن تحت الكاحل) أعلى منالمبلغ عنه 7،8،9. إذا تركت دون علاج ، يمكن أن يسبب عدم استقرار المفصل المعقد المزمن في الكاحل تحت الكاحل التواء متكرر في الكاحل ، مما يؤدي إلى حلقة مفرغة من التواء الكاحل وعدم الاستقرار المزمن المعقد الكاحل تحت الكاحل. يمكن أن يؤدي عدم الاستقرار المزمن المعقد في الكاحل والكاحل على المدى الطويل إلى تنكس ASCJ وهشاشة العظام بعد الصدمة ، والتي يمكن أن تؤثر على المفاصل المجاورة في الحالات الشديدة10. بالنسبة لهذه الأمراض ، فإن العلاج السريري الحالي محافظ بشكل أساسي ، بالإضافة إلى طرق العلاج الجراحي مثل إصلاح الأربطة وإعادة بناء الأربطة11,12.

ASCJ هو الهيكل الأساسي للقدم ويحافظ على توازن الجسم أثناء الحركة13. تم إجراء بحث مكثف حول بنية مفصل الكاحل والمفصل تحت الكاحل بشكل منفصل14،15،16،17. ومع ذلك ، فإن البحث عن مفصل الكاحل تحت الكاحل بأكمله أمر نادر الحدوث. يرتبط حوالي ربع حالات إصابة الكاحل بإصابة المفصل تحت الكاحل18. نظرا لآلية الإصابة المعقدة لعدم استقرار ASCJ ، لا يوجد إجماع على تشخيصها وعلاجها في الإعداد السريري. بالنظر إلى الوضع الحالي لإصابات الكاحل في العيادة ، هناك حاجة إلى طريقة أكثر علمية لدراسة الكاحل والمفصل تحت الكاحل ككل ، وبالتالي توفير فهم جديد لدراسة أمراض القدم.

نظرا لأن التركيب التشريحي للفأر الخلفي على المستوى العضلي الهيكلي يمكن مقارنته بالقدم البشرية 19 ، في العديد من الدراسات ، تم بالفعل تنفيذ نماذج الفئران لأبحاث القدم / الكاحل10,19. نجح Chang et al.19 في تطوير ثلاثة نماذج مختلفة من الفئران من هشاشة العظام في الكاحل. مستوحاة من التأسيس الناجح لعدم استقرار الكاحل في نموذج الفأر ، أنشأنا نموذجا للفأر لعدم الاستقرار المعقد في الكاحل تحت الكاحل ، وافترضنا أن قطع الأربطة الجزئية في مؤخرة القدم للفأر سيؤدي إلى عدم الاستقرار الميكانيكي ل ASCJ ، مما قد يؤدي إلى هشاشة العظام بعد الصدمة (PTOA) من ASCJ. يمكن استخدام النموذج الحيواني لعدم الاستقرار ASCJ لعلاج كل من عدم استقرار الكاحل وعدم الاستقرار تحت الكاحل ، وهو أكثر انسجاما مع الوضع السريري الفعلي من نموذج عدم استقرار الكاحل البسيط المستخدم حاليا7،8،9،19. لاختبار هذه الفرضية ، تم تصميم نموذجين للفأر لعدم الاستقرار الناجم عن استئصال الرباط في ASCJ. تم استخدام نتائج الوظيفة الحسية الحركية - اختبار شعاع التوازن ، وتحليل البصمة ، وتقييم nociception الحراري - لتقييم جدوى النموذج ، وتم استخدام التصوير المقطعي المحوسب الدقيق (CT) والتلوين النسيجي لتقييم تلف وانحطاط الغضروف المفصلي للفأر. إن الإنشاء الناجح لنموذج الفئران لعدم استقرار ASCJ لا يوفر فهما جديدا لدراسة أمراض القدم فحسب ، بل يوفر أيضا مرجعا قيما للبحث السريري حول الآليات المرتبطة بالإصابة ، ويوفر خيارات علاجية أفضل لالتواء الكاحل ، ومفيد لمزيد من الدراسات حول المرض.

Protocol

تم إجراء جميع الدراسات على وفقا للمبادئ التوجيهية لرعاية واستخدام المختبر وتمت الموافقة عليها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام بجامعة سوشو.

1. العمليات الجراحية

  1. قسم ذكور الفئران C57BL / 6 البالغة من العمر 21 أسبوعا إلى ثلاث مجموعات: الرباط العنقي المستعرض ومجموعة الرباط الأنبوبي الأمامي ، والرباط العنقي المستعرض ومجموعة الرباط الدالي ، ومجموعة الجراحة الوهمية. تأكد من تربية جميع الفئران في بيئة تلبي معايير محددة خالية من مسببات الأمراض (SPF).
  2. تأقلم الفئران مع بيئة التربية الجديدة (دورة الضوء / الظلام من 12 ساعة / 12 ساعة ، ودرجة حرارة ثابتة ورطوبة من 18-22 درجة مئوية و 40٪ -70٪ على التوالي) لمدة أسبوعين قبل التجربة. إخضاع الفئران لموازنة شعاع وتدريب المشي ، والانتقال من أحد طرفي عارضة التوازن أو الأنبوب على شكل حرف U إلى الطرف الآخر دون توقف ، قبل 1 أسبوع من التجربة.
  3. في عمر 8 أسابيع ، قم بتخدير الفأر باستخدام استنشاق الأيزوفلوران عن طريق ترطيب كرة قطنية مع 2 مل من الأيزوفلوران ووضعها في حاوية محكمة الإغلاق للتطاير الكامل. راقب نشاط الماوس واستمر في الاستنشاق حتى ينخفض نشاط الماوس بشكل كبير. تحديد عمق التخدير عن طريق الضغط على أصابع الفئران لمراقبة ردود أفعالهم. استنشق الأيزوفلوران المتبخر (2٪) من خلال قناع الوجه للحفاظ على التخدير في الفئران أثناء العمليات اللاحقة. استخدم مرهم العين البيطري أثناء التخدير لمنع جفاف العينين.
  4. بعد التخدير ، قم بإزالة الشعر الموجود على مفصل الكاحل للأطراف الخلفية اليمنى للفأر باستخدام ماكينة حلاقة ، وقم بتطهير الجلد المكشوف ثلاث مرات بجولات متناوبة من كرات قطن اليود وكرات القطن الكحولية. تطبيق 5 ملغ/ كغ كاربروفين عن طريق الحقن تحت الجلد. انقل الفأر إلى غرفة عمليات المجهرية باستخدام وسادة جراحية معقمة.
  5. بالنسبة لمجموعة الرباط العنقي المستعرض والرباط التلوفي الأمامي (CL + ATFL) ، قم بعمل شق طولي مائل لأسفل 7 مم مع مشرط على الجلد فوق مفصل الكاحل الأيمن ، والتحقيق باستخدام ملقط مستقيم مجهري أمام مفصل الكاحل.
  6. تأكد من تعرض ATFL عند الحد السفلي لجسم الكاحل والشظية بعد فحصها وقطعها برفق بمشرط. افصل الأوتار الشظوية الطويلة والقصيرة وأوتار الباسطة الرقمية الطويلة ، واكشف CL ، واقطعها بمشرط.
  7. بالنسبة لمجموعة الرباط الدالي CL + المستعرض (DL) ، قم بعمل شق عمودي 8 مم على الجلد الإنسي لمفصل الكاحل الأيمن وافصل DL بصراحة عن المليولوس الإنسي لقطعه أخيرا. ثم قم بقص CL كما هو موضح في الخطوة 1.5.
  8. بالنسبة للمجموعة الوهمية (مجموعة الجراحة الوهمية) ، قم بإجراء جراحة وهمية على مفصل الكاحل الأيمن ولكن لا تقطع أي أربطة.
  9. اغسل الشق بمحلول ملحي طبيعي معقم وخيطه بخيط نايلون جراحي 5-0. أخيرا ، قم بتطهير الشق المخيط بكرة قطنية من اليود.
  10. أبق الفأر تحت الملاحظة حتى يتمكن من الحفاظ على الاستلقاء القصي ، والإشراف حتى يصبح واعيا تماما. تطهير شق الكاحل مرتين يوميا مع كرة القطن اليود وإدارة كاربروفين (5 ملغ / كغ، الحقن تحت الجلد)، مرة واحدة في اليوم لمدة 1 أسبوع. الخلفية وحدها بعد العملية ، وإيلاء اهتمام وثيق لحالة ما بعد الجراحة من الماوس.
  11. بعد أسبوعين من الجراحة وعندما ينخفض تورم مفصل الكاحل ، ابدأ في ممارسة الفئران في آلة التعب الدوار للفأر لمدة 1 ساعة كل يوم.

2. اختبار شعاع التوازن

  1. قم بتثبيت شعاع خشبي دائري بطول 1 متر وقطر 20 مم ، يميل عند 15 درجة في أحد طرفيه ، مع مشبك ثلاثي القوائم للتصوير الفوتوغرافي ، وضع الطرف الآخر على سطح عمل متصل بشريط كاسيت مغلق.
  2. أداء التدريب شعاع التوازن 1 أسبوع قبل الجراحة لضمان أن الفئران تتحرك بسلاسة من نهاية شعاع إلى آخر. ضع في اعتبارك أن الفأر قد اجتاز الاختبار عندما يمر عبر الحزمة مرتين في 60 ثانية دون توقف.
  3. قم بإجراء تجربتين متتاليتين لكل فأر ورش عارضة التوازن بنسبة 75٪ كحول بعد كل تجربة لمنع الرائحة المتبقية للفأر السابق من التأثير على الماوس التالي.
  4. قم بإجراء اختبار عارضة التوازن قبل الجراحة ، 3 أيام ، 1 أسبوع ، 4 أسابيع ، 8 أسابيع ، و 12 أسبوعا بعد الجراحة. سجل متوسط الوقت لكل فأر يمر بعارضة التوازن مرتين متتاليتين وعدد المرات التي تنزلق فيها القدم الخلفية اليمنى من العارضة كمتغيرات تابعة.

3. تحليل البصمة

  1. ضع قناة بلاستيكية على شكل حرف U بطول 50 سم وعرض 10 سم وارتفاع 10 سم على الطاولة التجريبية وقم بتوصيل أحد طرفي القناة البلاستيكية بشريط كاسيت مغلق.
  2. ضع ورقة صبغية عادية بشكل مسطح في القناة ، ثم أمسك الماوس بكلتا يديه وقم بطلاء أقدامهما الأمامية والخلفية بالتساوي باستخدام صبغة حمراء وخضراء غير سامة.
  3. ضع الماوس المطلي برفق في أحد طرفي القناة واتركه ينتقل إلى الطرف الآخر من الكاسيت. أخرج الورق المصطبغ مع آثار الأقدام ، وقم بتمييزه ، وضعه على رف حتى يجف في مكان جيد التهوية ومظلل.
  4. بعد مرور كل ماوس ، قم برش القناة البلاستيكية على شكل حرف U بنسبة 75٪ كحول لمنع الرائحة المتبقية للفأر السابق من التأثير على الماوس التالي.
  5. حدد ثلاث آثار أقدام متتالية واضحة للماوس على كل ورقة ، واستخدم مسطرة لقياس طول خطوة بصمة القدم اليمنى للماوس ، بالإضافة إلى عرض الخطوة بين آثار الأقدام اليمنى واليسرى.

4. تقييم الإحساس الحراري بالألم

  1. أثناء التجربة ، استخدم الاختبار الأخمصي لتسجيل وقت تفاعل الإحساس الحراري لقدم الفأر ووقت رد فعل الماوس أثناء النشاط والراحة ، على التوالي. سجل بيانات القياس في ثوان.
  2. ضع الماوس في أداة القياس ، وقم بمحاذاة الجهاز بقدمه اليمنى ، وابدأ في تسخين الجهاز مع زيادة درجة الحرارة ببطء. راقب استجابة الماوس. عندما ترتفع درجة الحرارة فوق التسامح ، سوف ينسحب الماوس بسرعة أو يلعق قدمه اليمنى. سجل الوقت باستخدام الأداة وحدد الوقت على أنه وقت رد الفعل أثناء النشاط.
  3. لقياس وقت رد الفعل أثناء الراحة ، اترك الماوس يجلس لمدة 30 دقيقة على طاولة الراحة دون تسخين ، ثم احصل على بيانات الوقت كما هو موضح في الخطوة 4.2. استخدم هذه البيانات الزمنية المكتسبة للتحليل اللاحق.

5. التصوير المقطعي المحوسب الدقيق

  1. القتل الرحيم للفئران البالغة من العمر 12 أسبوعا مع ثاني أكسيد الكربون بعد الجراحة ، وتقشير جلد كاحليها الأيمن ، ثم قطع الساق الوسطى والشظية بمقص جراحي للحصول على عينات كاملة من الكاحل. ضع العينات في أنابيب طرد مركزي 15 مل تحتوي على 10٪ فورمالين محايد لمدة 48 ساعة.
  2. بعد التثبيت ، ضع العينات على دفعات (أربع عينات لكل دفعة) في خزان إسفنجي خاص للمسح بالأشعة المقطعية الدقيقة. اضبط معلمات الماكينة على النحو التالي: الجهد = 50 كيلو فولت ، التيار = 200 مللي أمبير ، المرشح = 0.5 مم ، والدقة = 9 ميكرومتر. قم بتشغيل الماسح الضوئي الدقيق بالتصوير المقطعي المحوسب.
  3. بعد المسح ، استخدم برنامج إعادة البناء لتحديد نطاق الصورة ، وحدد موضع زاوية معين بعد ضبط محور XYZ للصورة المحددة باستخدام برنامج تحليل البيانات التجارية ، كما هو موضح في Liu et al.10.
  4. استخدم برنامج تحليل التصوير المقطعي المحوسب الدقيق لتحديد مناطق الاهتمام المستمرة المكونة من 10 طبقات في الصور المعاد هيكلتها المعدلة بواسطة محاور XYZ ، وتحليل المفاصل المطلوبة كميا لتحديد جزء حجم العظام (BV / TV) ، كما هو موضح في Liu et al.10.
  5. أخيرا ، استخدم برنامج معالجة الصور الطبية ثلاثي الأبعاد لإجراء معالجة صور التصوير المقطعي المحوسب ثلاثية الأبعاد لمفاصل كاحل الفأر ، كما هو موضح في Liu et al.10. بعد إعادة الإعمار ، لاحظ تآكل وتشكيل الخلايا العظمية في ASCJ.

6. قسم تلطيخ الغضروف المفصلي

ملاحظة: يتم تنفيذ جميع خطوات التلوين في غطاء دخان ، ويتم ارتداء قناع أثناء العملية.

  1. استخدم ملاقط ومقص مجهري لإزالة الأنسجة الرخوة الزائدة حول عينات الكاحل ، ثم ضع العينات في أنبوب طرد مركزي يحتوي على 10٪ محلول إزالة الكلس EDTA محضر ب 44 جم من هيدروكسيد الصوديوم ، وعبوتين من PBS ، و 400 جم من EDTA-2Na ، مع تعديل الرقم الهيدروجيني إلى 7.35-7.45 مع حمض الهيدروكلوريك ، وتحديد المجموعات المختلفة.
  2. بعد ذلك ، ضع أنبوب الطرد المركزي على طاولة اهتزاز (ضبط السرعة على 20 دورة في الدقيقة) لإزالة الكلس وتغيير محلول إزالة الكلس مرة واحدة يوميا. تحديد إزالة الكلس من العينات.
  3. بعد 1 شهر من إزالة الكلس ، قم بتجفيف العينات بالكحول المتدرج ثم استخدم n-butanol لمدة 8 ساعات لأغراض التطهير. أخيرا ، اغمر العينات التي تم تطهيرها في البارافين في وضع إكليلي للتضمين.
  4. ضع عينات البارافين في ثلاجة 4 درجات مئوية لاستخدامها لاحقا. قبل التقسيم ، خذ العينات من الثلاجة 4 درجة مئوية وضعها في فريزر -20 درجة مئوية لمدة 10 دقائق تقريبا لتسهيل قطع المستوى الكامل.
  5. إصلاح العينات على microtome وتقسيمها بسمك 6 ميكرومتر. في الوقت نفسه ، استخدم المجهر لمراقبة ما إذا كانت العينات قد تم قطعها عند المستوى المتوقع من اختراق سهل لإبرة حقنة في الأنسجة العظمية.
  6. اضبط درجة حرارة الماء في الجهاز اللوحي على 40 درجة مئوية مقدما. بعد ذلك ، قم بقص قسمين إلى ثلاثة أقسام كاملة من البارافين على التوالي ونقلها إلى الجهاز اللوحي للتوسع الكامل. ثم قم بإزالة أقسام البارافين بشريحة زجاجية واستنزاف الماء. أخيرا ، قم بتمييز الشرائح بالمجموعات والأرقام.

7. تلطيخ الهيماتوكسيلين ويوزين (H&E & E)

  1. ضع الأقسام في حاضنة 60 درجة مئوية بطريقة يمكن من خلالها ملاحظة هيكل مفصل ASCJ السليم تحت المجهر واخبز الأقسام لمدة 40-50 دقيقة. بعد ذلك ، قم بإزالة الشمع من المقاطع باستخدام الزيلين 3x ، المرقمة ك I و II و III لسهولة التعرف عليها ، لمدة 15 دقيقة و 15 دقيقة و 10 دقائق على التوالي.
  2. ضع المقاطع منزوعة الشمع في إيثانول 100٪ 2x ، مرقمة ك I و II لسهولة التعرف عليها ، و 90٪ إيثانول ، و 80٪ إيثانول لمدة 3 دقائق و 3 دقائق و 5 دقائق و 5 دقائق على التوالي. بعد ذلك ، اغسل الأقسام بالماء المقطر المزدوج (ddH2O) لمدة 5 دقائق.
  3. بعد النقع مع الهيماتوكسيلين لمدة 1 دقيقة ، اغسل الأقسام ب ddH2O حتى تصبح عديمة اللون. انقع المقاطع في محلول تمايز الإيثانول الحمضي بنسبة 1٪ لمدة 30 ثانية واغسلها 3x لمدة دقيقة واحدة باستخدام ddH2O. بعد ذلك ، قم بتلطيخ الأقسام بمحلول الأمونيا بنسبة 1٪ لمدة دقيقة واحدة ، ثم اغسل 3x لمدة دقيقة واحدة لكل منها ddH2O.
  4. بعد ذلك ، قم بتلطيخ العينات بمحلول تلطيخ eosin لمدة 1 دقيقة ، ثم ضعها في 95٪ إيثانول و 100٪ إيثانول لمدة 1 دقيقة لكل منهما على التوالي. أخيرا ، عالج الأقسام بالزيلين الوريدي لمدة 1 دقيقة.
  5. جفف الأقسام في الهواء ، والصق قطرة من الراتنج المحايد على العينات الموجودة على الشرائح ، وقم بتغطيتها بقسيمة غطاء. بعد ذلك ، التقط صورا باستخدام مجهر مضان عمودي في برايت فيلد بمعدل 5x و 20x.

8. سافرانين يا فاست تلطيخ أخضر

  1. ضع الأقسام المحددة في حاضنة 60 درجة مئوية واخبز الأقسام لمدة 40-50 دقيقة. بعد ذلك ، قم بإزالة الشمع من المقاطع باستخدام الزيلين الأول والثاني والثالث لمدة 15 دقيقة و 15 دقيقة و 10 دقائق على التوالي.
  2. ضع الأجزاء منزوعة الشمع في 100٪ إيثانول I و II و 90٪ إيثانول و 80٪ إيثانول لمدة 3 دقائق و 3 دقائق و 5 دقائق و 5 دقائق على التوالي. بعد ذلك ، اغسل الأقسام باستخدام ddH2O لمدة 5 دقائق.
  3. بعد النقع مع الهيماتوكسيلين لمدة 1 دقيقة ، اغسل الأقسام ب ddH2O حتى تصبح عديمة اللون. انقع المقاطع في محلول تمايز الإيثانول الحمضي بنسبة 1٪ لمدة 30 ثانية واغسلها 3x لمدة دقيقة واحدة باستخدام ddH2O. بعد ذلك ، قم بتلطيخ الأقسام بمحلول الأمونيا بنسبة 1٪ لمدة دقيقة واحدة ، واغسلها 3 مرات لمدة دقيقة واحدة لكل منها باستخدام ddH2O.
  4. انقع المقاطع في 0.05٪ أخضر سريع لمدة دقيقتين ، متبوعا بنقع الأقسام في محلول حمض الخليك 1٪ لمدة 30 ثانية وفي 0.1٪ سافرانين لمدة 5 دقائق. ضع العينات الملطخة في 95٪ إيثانول و 100٪ إيثانول لمدة 1 دقيقة ، واحدة تلو الأخرى.
  5. أخيرا ، عالج الأقسام بالزيلين الوريدي لمدة 1 دقيقة. جفف الأقسام في الهواء ، والصق قطرة من الراتنج المحايد على العينات الموجودة على الشرائح ، وقم بتغطيتها بقسيمة غطاء. بعد ذلك ، التقط صورا باستخدام مجهر مضان عمودي في برايت فيلد بمعدل 5x و 20x.

9. الكيمياء الهيستولوجية المناعية

  1. اليوم 1: ضع الأقسام المحددة في حاضنة 60 درجة مئوية ، واخبز الأقسام لمدة 40-50 دقيقة ، ثم قم بإزالة الشمع منها بالزيلين الأول والثاني والثالث لمدة 15 دقيقة و 15 دقيقة و 10 دقائق على التوالي. ضع الأجزاء منزوعة الشمع في 100٪ إيثانول I و II و 90٪ إيثانول و 80٪ إيثانول لمدة 3 دقائق و 3 دقائق و 5 دقائق و 5 دقائق على التوالي. بعد ذلك ، اغسل الأقسام باستخدام ddH2O لمدة 5 دقائق ، واستخدم قلما كيميائيا لوضع دائرة حول منطقة العينة ، ووضعها في صندوق مظلم.
  2. استرجاع المستضد: قم بإسقاط 20-50 ميكرولتر من 0.25٪ تربسين في منطقة العينة المحاطة بدائرة ، واحتضانها في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة ، ثم اغسل العينات 3x لمدة 2 دقيقة لكل منها باستخدام برنامج تلفزيوني. منع البيروكسيديز الداخلي عن طريق إضافة 3 ٪ H 2 O 2 ، واحتضان العينات لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام ، ثم غسلها 3x لمدة2دقيقة لكل منهما مع برنامج تلفزيوني. قم بإجراء حجب المصل عن طريق إضافة 10٪ من مصل الماعز في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة ، ثم احتضانه بالجسم المضاد الأساسي (الكولاجين المضاد للفأر من النوع الثاني ، المخفف 1000 مرة) عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
  3. اليوم 2: أعد تدفئة الأقسام في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. استعادة الجسم المضاد الأساسي وغسل الأقسام 3x لمدة 2 دقيقة لكل منها مع برنامج تلفزيوني. احتضان مع الجسم المضاد الثانوي لمدة 40 دقيقة في حاضنة عند 37 درجة مئوية ، ثم اغسل الأقسام 3x لمدة 2 دقيقة لكل منها مع برنامج تلفزيوني.
  4. تطوير لون DAB: أضف 5 مل من ddH 2 O ، وقطرتين من المخزن المؤقت ، وأربع قطرات من DAB ، وقطرتين من H 2O2لتحضير كاشف DAB. أضف 20-50 ميكرولتر من الكاشف إلى الأقسام ، واحتفظ بالعينات محمية من الضوء لمدة 5 دقائق ، ثم اغسل الأقسام لمدة دقيقتين باستخدام ddH2O.
  5. بعد النقع مع الهيماتوكسيلين لمدة 1 دقيقة ، اغسل الأقسام ب ddH2O حتى تصبح عديمة اللون. انقع الأقسام في محلول تمايز الإيثانول الحمضي بنسبة 1٪ لمدة 30 ثانية واغسلها 3 مرات لمدة دقيقة واحدة لكل منها باستخدام ddH 2O. قم بتلطيخ الأقسام لمدة دقيقة واحدة بمحلول الأمونيا 1٪ ، ثم اغسلها 3x لمدة دقيقة واحدة لكل منها ddH2O.
  6. بعد ذلك ، ضع الأقسام في 95٪ إيثانول و 100٪ إيثانول ، على التوالي ، لمدة 1 دقيقة لكل منهما. أخيرا ، احتضان الأقسام لمدة 1 دقيقة باستخدام الزيلين الوريدي. جفف الأقسام في الهواء ، والصق قطرة من الراتنج المحايد على العينات الموجودة على الشرائح ، وقم بتغطيتها بقسيمة غطاء. بعد ذلك ، التقط صورا باستخدام مجهر مضان عمودي في برايت فيلد بمعدل 5x و 20x.

النتائج

تم إجراء التحليل الإحصائي لبيانات الارتباط باستخدام أدوات التحليل الإحصائي عبر الإنترنت. واستخدمت البيانات التي استوفت اختباري التوزيع الطبيعي وتجانس التباين لإجراء مزيد من التحليل الإحصائي عن طريق تحليل التباين في اتجاه واحد. إذا لم تستوف البيانات الاختبارين ، تم استخدام اختبار Kruskal-Wa...

Discussion

في هذه الدراسة ، تم بناء نموذجين للفأر لعدم استقرار ASCJ بنجاح عن طريق عبور CL + ATFL أو CL + DL. زاد وقت مرور الفئران عبر عارضة التوازن بشكل ملحوظ في 8 أسابيع و 12 أسبوعا بعد الجراحة ، وهو ما يشبه النتائج التي حصل عليها فريق Hubbard-Turner عن طريق قطع الرباط الجانبي لمفصل الكاحل23,24

Disclosures

ليس لدى أي من المؤلفين أي مصالح متضاربة.

Acknowledgements

تم دعم هذه الدراسة من قبل برنامج المنح الدراسية لحكومة مقاطعة جيانغسو وتطوير البرنامج الأكاديمي ذي الأولوية لمؤسسات التعليم العالي في جيانغسو (PAPD).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
5-0 Surgical Nylon SutureNingbo Medical Needle Co., Ltd.191104
Acidic ethanol differentiation solution (1%)Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.R20778
Adhesive slidesJiangsu Shitai Company
Ammonia solution (1%)Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.R20788
Anhydrous ethanolShanghai Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd.
Aqueous acetic acid (1%)Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.R20773
Black cube cassetteShanghai Yizhe Instrument Co., Ltd.
Centrifuge tube 15mlBeijing Soleibo Technology Co., Ltd.YA0476
Centrifuge tube 50mlBeijing Soleibo Technology Co., Ltd.YA0472
Cover glassJiangsu Shitai Company
CTAn softwareBlue scientificmicro-CT analysis software
Dataview softwareAEMC instrumentscommercial data analysing software
Disodium ethylenediaminetetraacetate (EDTA-2Na)Beijing Soleibo Technology Co., Ltd.E8490
Electric incubatorSuzhou Huamei Equipment Factory
Embedding paraffinLeica, Germany39001006
Eosin staining solution (alcohol soluble, 1%)Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.R30117
Fast green staining solutionSigma-Aldrich, USAF7275
Gait paperBaoding Huarong Paper Factory
GraphPad Prism 8.0Graphpad softwareonline statistical analysis tools
Iodophor cotton ballsQingdao Hainuo Bioengineering Co., Ltd.
Leica 818 bladeLeica, Germany
Micro-CTSkyscan, BelgiumSkyScan 1176
Micromanipulation microscopeSuzhou Omet Optoelectronics Co., Ltd.
Mimics softwareMaterialise 3D medical image processing software 
Modified Harris Hematoxylin StainShanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.R20566
Mouse anti-mouse type II collagenAmerican Abcam Company
NaOHShanghai Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd.
N-butanolShanghai Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd.
Neutral formalin fixative (10%)Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.
Neutral resinSigma-Aldrich, USA
Nrecon reconstrcution software Micro Photonics Inc.
Oaks hair clipperOaks Group Co., Ltd.
Paraffin Embedding MachineLeica, Germany
PH meterShanghai Leitz Company
Phosphate Buffered Saline (PBS)American Biosharp
Physiological saline (for mammals, sterile)Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.R22172
Safranin O-staining solutionSigma-Aldrich, USAHT90432
Saline (0.9%)Shanghai Baxter Medical Drug Co., Ltd.309107
ShakerHaimen Qilin Bell Instrument Manufacturing Co., Ltd.2008779
SPSS 23IBMonline statistical analysis tools
Tablet machineLeica, Germany
Tissue slicerLeica, Germany
Ugo BasileUgo Basile Biological Research Company
Upright fluorescence microscopeZeiss Axiovert, Germany
U-shaped plastic channelShanghai Yizhe Instrument Co., Ltd.
Veterinary eye ointmentPfizer
XyleneShanghai Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd.
YLS-10B Wheel Fatigue TesterJinan Yiyan Technology Development Co., Ltd.

References

  1. Waterman, B. R., Belmont, P. J., Cameron, K. L., Deberardino, T. M., Owens, B. D. Epidemiology of ankle sprain at the United States Military Academy. American Journal of Sports Medicine. 38 (4), 797-803 (2010).
  2. Fong, D. T., Chan, Y. Y., Mok, K. M., Yung, P. S., Chan, K. M. Understanding acute ankle ligamentous sprain injury in sports. Sports Medicine Arthroscopy Rehabilitation Therapy & Technology. 1 (1), 14 (2009).
  3. Herzog, M. M., Kerr, Z. Y., Marshall, S. W., Wikstrom, E. A. Epidemiology of ankle sprains and chronic ankle instability. Journal of Athletic Training. 54 (6), 603-610 (2019).
  4. Medina McKeon, J. M., Hoch, M. C. The ankle-joint complex: A kinesiologic approach to lateral ankle sprains. Journal of Athletic Training. 54 (6), 589-602 (2019).
  5. Jones, M. H., Amendola, A. S. Acute treatment of inversion ankle sprains: immobilization versus functional treatment. Clinical Orthopaedics and Related Research. 455 (463), 169-172 (2007).
  6. Anandacoomarasamy, A., Barnsley, L. Long term outcomes of inversion ankle injuries. British Association of Sport and Medicine. 39 (3), 14 (2005).
  7. Ringleb, S. I., Dhakal, A., Anderson, C. D., Bawab, S., Paranjape, R. Effects of lateral ligament sectioning on the stability of the ankle and subtalar joint. Journal of Orthopaedic Research. 29 (10), 1459-1464 (2011).
  8. Mittlmeier, T., Wichelhaus, A. Subtalar joint instability. European Journal of Trauma and Emergency Surgery. 41 (6), 623-629 (2015).
  9. Barg, A., et al. Subtalar instability: Diagnosis and treatment. Foot & Ankle International. 33 (02), 151-160 (2012).
  10. Liu, P., et al. A mouse model of ankle-subtalar joint complex instability induced post-traumatic osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 16 (1), 541 (2021).
  11. Lui, T. H. Modified arthroscopic Brostrom procedure with bone tunnels. Arthroscopy Techniques. 5 (4), 775-780 (2016).
  12. Wang, W., Xu, G. H. Allograft tendon reconstruction of the anterior talofibular ligament and calcaneofibular Ligament in the treatment of chronic ankle instability. BMC Musculoskeletal Disorders. 18 (1), 150 (2017).
  13. Yang, N., Waddington, G., Adams, R., Han, J. Age-related changes in proprioception of the ankle complex across the lifespan. Journal of Sport and Health Science. 8 (6), 548-554 (2019).
  14. Michels, F., et al. Searching for consensus in the approach to patients with chronic lateral ankle instability: Ask the expert. Knee Surgery Sports Traumatology Arthroscopy. 26 (7), 2095-2102 (2017).
  15. Kamada, K., Watanabe, S., Yamamoto, H. Chronic subtalar instability due to insufficiency of the calcaneofibular ligament: A case report. Foot & Ankle International. 23 (12), 1135-1137 (2002).
  16. Kato, T. The diagnosis and treatment of instability of the subtalar joint. The Journal of Bone and Joint Surgery. 77 (3), 400-406 (1995).
  17. Meyer, J. M., Garcia, J., Hoffmeyer, P., Fritschy, D. The subtalar sprain. A roentgenographic study. Clinical Orthopaedics and Related Research. (226), 169-173 (1988).
  18. Mittlmeier, T., Rammelt, S. Update on subtalar joint instability. Foot and Ankle Clinics. 23 (3), 397-413 (2018).
  19. Chang, S. H., et al. Comparison of mouse and human ankles and establishment of mouse ankle osteoarthritis models by surgically-induced instability. Osteoarthritis & Cartilage. 24 (4), 688-697 (2016).
  20. Naito, K., et al. Evaluation of the effect of glucosamine on an experimental rat osteoarthritis model. Life Sciences. 86 (13-14), 538-543 (2010).
  21. Pritzker, K. P. H., et al. Osteoarthritis cartilage histopathology: Grading and staging. Osteoarthritis Cartilage. 14 (1), 13-29 (2006).
  22. Glasson, S. S., et al. The OARSI histopathology initiative - Recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 18, 17-23 (2010).
  23. Hubbard-Turner, T., Wikstrom, E. A., Guderian, S., Turner, M. J. Acute ankle sprain in a mouse model. Medicine & Science in Sports & Exercise. 45 (8), 1623-1628 (2013).
  24. Wikstrom, E. A., Hubbard-Turner, T., Guderian, S., Turner, M. J. Lateral ankle sprain in a mouse model: Lifelong sensorimotor dysfunction. Journal of Athletic Training. 53 (3), 249-254 (2018).
  25. Bell-Krotoski, J. A., Fess, E. E., Figarola, J. H., Hiltz, D. Threshold detection and Semmes-Weinstein monofilaments. Journal of Hand Therapy. 8 (2), 155-162 (1995).
  26. Wieland, H. A., Michaelis, M., Kirschbaum, B. J., Rudolphi, K. A. Osteoarthritis - An untreatable disease. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (4), 331-344 (2005).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved