Um Modelo de Instabilidade Articular do Complexo Tornozelo-Subtalar em Camundongos

Resumo

A articulação do complexo tornozelo-subtalar (JSCA) é o núcleo do pé e desempenha um papel fundamental no controle do equilíbrio nas atividades diárias. Lesões esportivas muitas vezes levam à instabilidade nessa articulação. Aqui, descrevemos um modelo murino de instabilidade induzida por transecção ligamentar da JSCA.

Resumo

As entorses de tornozelo são talvez as lesões esportivas mais comuns na vida diária, muitas vezes resultando em instabilidade da articulação do complexo tornozelo-subtalar (ASCS), e podem eventualmente levar à osteoartrite pós-traumática (ATP) a longo prazo. No entanto, devido à complexidade do mecanismo de lesão e às manifestações clínicas, como equimose, hematoma ou sensibilidade na lateral do pé, não há consenso clínico sobre o diagnóstico e tratamento da instabilidade da ASJS. Uma vez que a estrutura musculoesquelética dos ossos e ligamentos do retropé de camundongo é comparável à dos seres humanos, um modelo animal de instabilidade da JSCA em camundongos foi estabelecido pela transecção dos ligamentos ao redor da JSCA. O modelo foi bem validado por meio de uma série de testes comportamentais e análises histológicas, incluindo um teste de feixe de equilíbrio, uma análise de pegadas (uma avaliação do nível de exercício e da capacidade de equilíbrio em camundongos), uma avaliação de nocicepção térmica (uma avaliação da função sensorial do pé em camundongos), microtomografia computadorizada (TC) e coloração de corte da cartilagem articular (uma avaliação de dano e degeneração da cartilagem articular em camundongos). O estabelecimento bem-sucedido de um modelo de instabilidade da ASCA em camundongos fornecerá uma referência valiosa para a pesquisa clínica sobre o mecanismo de lesão e resultará em melhores opções de tratamento para entorse de tornozelo.

Introdução

A entorse de tornozelo é uma das lesões esportivas mais comuns em todo o mundo. Estima-se que 10.000 pessoas sejam feridas diariamente nos Estados Unidos¹, das quais as lesões relacionadas ao esporte são responsáveis por 15%-45%². Os custos médicos associados ao tratamento da entorse de tornozelo nos Estados Unidos são de US$ 4,2 bilhões anuais ^3,4,5. A instabilidade crônica do pé é um problema comum após entorses de tornozelo e ocorre em aproximadamente 74% das entorses de tornozelo6, incluindo instabilidade do tornozelo ou subtalar. No entanto, devido aos sintomas e sinais clínicos semelhantes, é difícil para a equipe médica distinguir se a instabilidade crônica do tornozelo também é acompanhada por instabilidade articular subtalar crônica na clínica e, como resultado, a instabilidade subtalar crônica pode ser facilmente perdida. Portanto, a verdadeira incidência de instabilidade crônica da articulação tornozelo-subtalar (ASC) (um tipo específico de instabilidade crônica do pé que inclui tanto a instabilidade crônica do tornozelo quanto a instabilidade subtalar crônica) pode ser maior do que a relatada7,8,9. Se não tratada, a instabilidade articular crônica do complexo tornozelo-subtalar pode causar entorses repetidas do tornozelo, levando a um círculo vicioso de entorses de tornozelo e instabilidade crônica do complexo tornozelo-subtalar. A instabilidade crônica prolongada do complexo tornozelo-subtalar pode levar à degeneração da JSCA e osteoartrite pós-traumática, que pode afetar as articulações adjacentes em casos graves¹⁰. Para essas doenças, o tratamento clínico atual é principalmente conservador, além de métodos de tratamento cirúrgico como reparo ligamentar e reconstrução ligamentar^11,12.

A JSCA é a estrutura central do pé e mantém o equilíbrio do corpo durante o movimento¹³. Extensas pesquisas têm sido realizadas sobre a estrutura da articulação do tornozelo e da articulação subtalar separadamente^14,15,16,17. No entanto, pesquisas sobre toda a articulação tornozelo-subtalar são raras. Cerca de um quarto dos casos de lesão do tornozelo está associado à lesão da articulação^subtalar18. Devido ao complexo mecanismo de lesão da instabilidade da JSCA, não há consenso sobre seu diagnóstico e tratamento no cenário clínico. Considerando a situação atual das lesões do tornozelo na clínica, faz-se necessário um método mais científico para estudar o tornozelo e a articulação subtalar como um todo, proporcionando assim um novo entendimento para o estudo das doenças do pé.

Como a estrutura anatômica do retropé de camundongo em nível musculoesquelético é comparável à do pé humano 19, em vários estudos modelos de camundongos para pesquisa de pé/tornozelo já foram implementados^10,19. Chang et ^al.19 desenvolveram com sucesso três modelos diferentes de osteoartrite de tornozelo em camundongos. Inspirados pelo estabelecimento bem-sucedido da instabilidade do tornozelo no modelo de camundongo, estabelecemos um modelo de instabilidade do complexo tornozelo-subtalar, hipotetizando que a transecção dos ligamentos parciais no retropé de camundongo resultaria em instabilidade mecânica da JSCA, o que levaria à osteoartrite pós-traumática (ATPI) da JSCA. O modelo animal de instabilidade da JSCA poderia ser utilizado tanto para o tratamento da instabilidade do tornozelo quanto da instabilidade subtalar, o que está mais de acordo com a situação clínica real do que o modelo de instabilidade simples do tornozelo atualmente utilizado7,8,9,19. Para testar essa hipótese, dois modelos murinos de instabilidade induzida por transecção ligamentar da JSCA foram projetados. Os resultados da função sensório-motora - teste do feixe de equilíbrio, análise das pegadas e avaliação da nocicepção térmica - foram usados para avaliar a viabilidade do modelo, e a microtomografia computadorizada (TC) e a coloração histológica foram usadas para avaliar o dano e a degeneração da cartilagem articular de camundongos. O estabelecimento bem-sucedido de um modelo de instabilidade da JSCA em camundongos não apenas fornece uma nova compreensão para o estudo das doenças do pé, mas também fornece uma referência valiosa para a pesquisa clínica sobre os mecanismos relacionados à lesão, fornece melhores opções de tratamento para entorses de tornozelo e é útil para estudos futuros sobre a doença.

Protocolo

Todos os estudos em animais foram realizados de acordo com as Diretrizes para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Soochow.

1. Procedimentos cirúrgicos

1. Divida 21 camundongos machos C57BL/6 com 6 semanas de idade em três grupos: o grupo do ligamento cervical transverso e ligamento talofibular anterior, o grupo do ligamento cervical transverso e do ligamento deltoide e o grupo da cirurgia simulada. Certifique-se de que todos os camundongos foram criados em um ambiente que atenda aos padrões específicos livres de patógenos (SPF).
2. Aclimatar os camundongos ao novo ambiente de criação (ciclo claro/escuro de 12 h/12 h, temperatura e umidade constantes de 18-22 °C e 40%-70%, respectivamente) por 2 semanas antes do experimento. Submeter os camundongos ao treinamento de equilíbrio e marcha, passando de uma extremidade de um feixe de equilíbrio ou tubo em forma de U para a outra extremidade sem parar, 1 semana antes do experimento.
3. Com 8 semanas de idade, anestesiar o camundongo por inalação de isoflurano umedecendo um algodão com 2 mL de isoflurano e colocando-o em um recipiente hermético para volatilização total. Monitore a atividade do mouse e continue a inalação até que a atividade do mouse tenha diminuído significativamente. Determine a profundidade da anestesia apertando os dedos dos pés dos ratos para observar suas reações. Inalar isoflurano vaporizado (2%) através de máscara facial para manter a anestesia em camundongos durante as operações subsequentes. Use pomada ocular veterinária durante a anestesia para evitar que os olhos sequem.
4. Após a anestesia, remova os pelos da articulação do tornozelo dos membros posteriores direitos do rato com um barbeador e desinfete a pele exposta três vezes com rodadas alternadas de bolas de algodão de iodo e bolas de algodão de álcool. Administrar 5 mg/kg de carprofeno por injeção subcutânea. Transfira o camundongo para a sala de cirurgia do animal de microcirurgia usando uma almofada cirúrgica estéril.
5. Para o grupo ligamento transverso cervical e ligamento talofibular anterior (CL + ATFL), realizar incisão longitudinal oblíqua descendente de 7 mm com bisturi na pele acima da articulação do tornozelo direito e sonda com pinça reta microscópica na frente da articulação do tornozelo.
6. Certifique-se da exposição do ATFL na borda inferior do corpo do tálus e da fíbula após sondar e corte-o suavemente com um bisturi. Separe os tendões fibulares longo e curto e extensor longo dos dedos, exponha a CL e corte-a com bisturi.
7. Para o grupo LC transverso + ligamento deltoide (LD), fazer uma incisão vertical de 8 mm na pele medial da articulação do tornozelo direito e separar o DL do maléolo medial para finalmente cortá-lo. Em seguida, corte o CL conforme descrito na etapa 1.5.
8. Para o grupo sham (grupo de cirurgia simulada), realize a cirurgia simulada na articulação do tornozelo direito, mas não corte nenhum ligamento.
9. Lave a incisão com soro fisiológico normal estéril e suture-a com fio de náilon cirúrgico 5-0. Finalmente, desinfete a incisão suturada com uma bola de algodão de iodo.
10. Mantenha o rato em observação até que possa manter a decúbito esternal e supervisione até que esteja totalmente consciente. Desinfetar a incisão do tornozelo duas vezes por dia com uma bola de algodão iodado e administrar carprofeno (5 mg/kg, injeção subcutânea), uma vez por dia durante 1 semana. Recue sozinho após a operação, e preste muita atenção à condição pós-operatória do mouse.
11. Duas semanas após a cirurgia e quando o inchaço da articulação do tornozelo diminuiu, comece a exercitar os ratos na máquina de fadiga rotativa do mouse por 1 h todos os dias.

2. Ensaio do feixe de equilíbrio

1. Aperte uma viga circular de madeira com 1 m de comprimento e 20 mm de diâmetro, inclinada a 15° em uma extremidade, com um tripé fotográfico, e coloque a outra extremidade em uma superfície de trabalho conectada a um fechado.
2. Realize o treinamento do feixe de equilíbrio 1 semana antes da cirurgia para garantir que os camundongos se movam suavemente de uma extremidade da viga para a outra. Considere que um rato passou no teste quando passa pelo feixe duas vezes em 60 s sem pausar.
3. Realize duas tentativas consecutivas para cada rato e pulverize o feixe de equilíbrio com álcool a 75% após cada ensaio para evitar que o odor residual do rato anterior afecte o rato seguinte.
4. Realizar o teste do feixe de equilíbrio no pré-operatório, 3 dias, 1 semana, 4 semanas, 8 semanas e 12 semanas após a cirurgia. Registre o tempo médio de cada mouse passando pela trave de equilíbrio duas vezes seguidas e o número de vezes que o retropé direito escorrega da viga como variáveis dependentes.

3. Análise da pegada

1. Coloque um canal de plástico em forma de U com um comprimento de 50 cm, uma largura de 10 cm e uma altura de 10 cm sobre a mesa experimental e conecte uma extremidade do canal de plástico a um fechado.
2. Coloque um papel pigmentado liso no canal e, em seguida, segure o mouse com as duas mãos e pinte os pés dianteiros e traseiros uniformemente com pigmento vermelho e verde não tóxico.
3. Coloque o rato pintado suavemente numa extremidade do canal e deixe-os mover-se para a outra extremidade da. Pegue o papel pigmentado com as pegadas para fora, marque-o e coloque-o em uma prateleira para secar em um lugar ventilado e sombreado.
4. Depois de cada rato ter passado, borrife o canal de plástico em forma de U com álcool a 75% para evitar que o odor residual do rato anterior afecte o rato seguinte.
5. Selecione três pegadas claras consecutivas do mouse em cada papel e use uma régua para medir o comprimento do passo do pé direito do mouse, bem como a largura do passo entre as pegadas esquerda e direita.

4. Avaliação da nocicepção térmica

1. Durante o experimento, use o teste plantar para registrar o tempo de reação de nocicepção térmica do pé de camundongo e o tempo de reação do camundongo durante a atividade e repouso, respectivamente. Registre os dados de medição em segundos.
2. Coloque o mouse no instrumento de medição, alinhe o instrumento com o pé direito e comece a aquecer o instrumento com a temperatura aumentando lentamente. Observe a resposta do mouse. Quando a temperatura aumenta acima da tolerância, o mouse rapidamente retira ou lambe seu pé direito. Registre o tempo de uso do instrumento e defina o tempo como o tempo de reação durante a atividade.
3. Para medir o tempo de reação em repouso, deixe o mouse sentado por 30 min na mesa de repouso sem aquecimento e, em seguida, obtenha os dados de tempo conforme explicado na etapa 4.2. Use esses dados temporais adquiridos para análise posterior.

5. Micro-tomografia computadorizada

1. Eutanasiar camundongos de 12 semanas com dióxido de carbono no pós-operatório, descascar a pele do tornozelo direito e, em seguida, cortar a tíbia média e a fíbula com tesoura cirúrgica para obter espécimes completos do tornozelo. Colocar os espécimes em tubos centrífugos marcados de 15 mL contendo formalina neutra a 10% por 48 h.
2. Após a fixação, colocar os espécimes em lotes (quatro corpos de prova por batelada) em um tanque de esponja especial para micro-tomografia computadorizada. Defina os parâmetros da máquina da seguinte forma: tensão = 50 kV, corrente = 200 mA, filtro = 0,5 mmAl e resolução = 9 μm. Execute o micro-tomógrafo.
3. Após a digitalização, use o software de reconstrução para delinear o alcance da imagem e selecione uma posição angular específica após ajustar o eixo XYZ da imagem delineada usando um software de análise de dados comerciais, como descrito em Liu et ^al.10.
4. Use um software de análise de micro-TC para selecionar regiões contínuas de interesse de 10 camadas nas imagens reestruturadas ajustadas pelos eixos XYZ e analisar quantitativamente as articulações necessárias para determinar a fração de volume ósseo (BV/TV), conforme descrito em Liu et ^al.10.
5. Finalmente, use um software de processamento de imagens médicas tridimensionais para realizar o processamento tridimensional de imagens de TC das articulações do tornozelo de camundongos, como descrito em Liu et ^al.10. Após a reconstrução, observar o desgaste e a formação de osteófitos na JSCA.

6. Coloração dos cortes da cartilagem articular

OBS: Todas as etapas de coloração são realizadas em um exaustor de fumaça, e uma máscara é usada durante o procedimento.

1. Use pinças e tesouras microscópicas para remover o excesso de tecido mole ao redor dos espécimes do tornozelo e, em seguida, coloque os espécimes em um tubo centrífugo contendo solução de descalcificação de EDTA a 10% preparada com 44 g de NaOH, dois pacotes de PBS e 400 g de EDTA-2Na, com o pH ajustado para 7,35-7,45 com ácido clorídrico, e marque os diferentes grupos.
2. Em seguida, coloque o tubo da centrífuga em uma mesa de agitação (velocidade ajustada para 20 rpm) para descalcificação e troque a solução de descalcificação uma vez por dia. Determinar a descalcificação dos espécimes.
3. Após 1 mês de descalcificação, desidratar os espécimes com álcool gradiente e, em seguida, usar n-butanol por 8 h para fins de clareamento. Finalmente, imergir os espécimes limpos em parafina em posição coronal para incorporação.
4. Colocar as amostras de parafina num frigorífico a 4 °C para utilização posterior. Antes de seccionar, retire as amostras do frigorífico a 4 °C e coloque-as num congelador de -20 °C durante cerca de 10 minutos para facilitar o corte do plano completo.
5. Fixar os espécimes no micrótomo e seccioná-los a uma espessura de 6 μm. Ao mesmo tempo, use um microscópio para observar se as amostras foram cortadas no nível esperado - fácil penetração de uma agulha de seringa no tecido ósseo.
6. Ajuste a temperatura da água da máquina de comprimidos para 40 °C com antecedência. Em seguida, corte de duas a três seções completas de parafina seguidas e transfira-as para a máquina de tablet para expansão completa. Em seguida, remova as seções de parafina com uma lâmina de vidro e escorra a água. Por fim, marque os slides com grupos e números.

7. Coloração hematoxilina e eosina (H&E)

1. Coloque as seções em uma incubadora de 60 °C de tal forma que a estrutura articular ASCJ intacta possa ser observada sob o microscópio e asse as seções por 40-50 min. Em seguida, descermar os cortes com xileno 3x, numerados como I, II e III para facilitar a identificação, por 15 min, 15 min e 10 min, respectivamente.
2. Colocar as seções desparafinadas em etanol 100% 2x, numeradas como I e II para facilitar a identificação, etanol 90% e etanol 80% por 3 min, 3 min, 5 min e 5 min, respectivamente. Em seguida, lave as seções com água bidestilada (ddH₂O) por 5 min.
3. Após a imersão com hematoxilina por 1 min, lavar os cortes com ddH₂O até que fiquem incolores. Mergulhe as seções em solução de diferenciação de etanol ácido a 1% por 30 s e lave-as 3x por 1 min com ddH₂O. Depois disso, corar os cortes com solução de amônia a 1% por 1 min e, em seguida, lavar 3x por 1 min cada com ddH₂O.
4. Em seguida, corar as amostras com solução corante de eosina por 1 min e, em seguida, colocá-las em etanol 95% e etanol 100% por 1 min cada em sucessão. Finalmente, trate as seções com xileno IV por 1 min.
5. Seque as seções ao ar, cole uma gota de resina neutra nos espécimes nas lâminas e cubra-as com uma tampa. Em seguida, tire imagens com um microscópio de fluorescência vertical em campo claro a 5x e 20x.

8. Coloração verde Safranin O-fast

1. Coloque as seções selecionadas em uma incubadora de 60 °C e asse as seções por 40-50 min. Em seguida, descerpar os cortes com xileno I, II e III por 15 min, 15 min e 10 min, respectivamente.
2. Colocar as seções desparafinadas em etanol 100% I, II, etanol 90% e etanol 80% por 3 min, 3 min, 5 min e 5 min, respectivamente. Em seguida, lave as seções com ddH₂O por 5 min.
3. Após a imersão com hematoxilina por 1 min, lavar os cortes com ddH₂O até que fiquem incolores. Mergulhe as seções em solução de diferenciação de etanol ácido a 1% por 30 s e lave-as 3x por 1 min com ddH₂O. Em seguida, corar os cortes com solução de amônia a 1% por 1 min e lavá-los 3x por 1 min cada com ddH₂O.
4. Mergulhe as seções em verde rápido 0,05% por 2 min, seguido de imersão das seções em solução de ácido acético a 1% por 30 s e em safranina a 0,1% por 5 min. Colocar as amostras coradas em etanol 95% e etanol 100% por 1 min, uma após a outra.
5. Finalmente, trate as seções com xileno IV por 1 min. Seque as seções ao ar, cole uma gota de resina neutra nos espécimes nas lâminas e cubra-as com uma tampa. Em seguida, tire imagens com um microscópio de fluorescência vertical em campo claro a 5x e 20x.

9. Imuno-histoquímica

1. Dia 1: Coloque as seções selecionadas em uma incubadora de 60 °C, asse as seções por 40-50 min e, em seguida, desencrefe-as com xileno I, II e III por 15 min, 15 min e 10 min, respectivamente. Colocar as seções desparafinadas em etanol 100% I, II, etanol 90% e etanol 80% por 3 min, 3 min, 5 min e 5 min, respectivamente. Em seguida, lave os cortes com ddH₂O por 5 min, use uma caneta histoquímica para circundar a área do espécime e coloque-os em uma caixa escura.
2. Recuperação de antígeno: Gotejar 20-50 μL de tripsina a 0,25% na área circundada do espécime, incubar em uma incubadora de 37 °C por 60 min e, em seguida, lavar os espécimes 3x por 2 min cada com PBS. Bloquear a peroxidase endógena adicionando 3% H 2 O 2, incubar os espécimes por 10 min à temperatura ambiente no escuro e, em seguida, lavá-los 3x por₂min cada com PBS. Realizar o bloqueio do soro adicionando 10% de soro de cabra à temperatura ambiente por 20 minutos e, em seguida, incubar com o anticorpo primário (colágeno tipo II de camundongo anticamundongo, diluído 1.000 vezes) a 4 °C durante a noite.
3. Dia 2: Reaqueça as seções à temperatura ambiente por 30 min. Recupere o anticorpo primário e lave as secções 3x durante 2 minutos cada com PBS. Incubar com o anticorpo secundário durante 40 minutos numa incubadora a 37 °C e, em seguida, lavar as secções 3x durante 2 minutos cada com PBS.
4. Desenvolvimento da cor DAB: Adicionar 5 mL de ddH 2 O, duas gotas de tampão, quatro gotas de DAB e duas gotas de H 2 O₂para preparar o reagente DAB. Adicionar 20-50 μL de reagente às seções, manter as amostras protegidas da luz por 5 min e, em seguida, lavar as seções por 2 min com ddH₂O.
5. Após a imersão com hematoxilina por 1 min, lavar os cortes com ddH₂O até que fiquem incolores. Mergulhe as seções em solução de diferenciação de etanol ácido a 1% por 30 s e lave-as 3x por 1 min cada com ddH 2 O. Manchar as seções por 1 min com solução de amônia a 1% e, em seguida, lavá-las 3x por 1 min cada comddH₂O.
6. Em seguida, coloque as seções em etanol 95% e etanol 100%, respectivamente, por 1 min cada. Finalmente, incubar os cortes por 1 min com xileno IV. Seque as seções ao ar, cole uma gota de resina neutra nos espécimes nas lâminas e cubra-as com uma tampa. Em seguida, tire imagens com um microscópio de fluorescência vertical em campo claro a 5x e 20x.

Resultados

A análise estatística dos dados de correlação foi realizada por meio de ferramentas de análise estatística online. Os dados que atenderam aos dois testes de distribuição normal e homogeneidade de variância foram utilizados para posterior análise estatística por análise de variância one-way. Caso os dados não atendessem aos dois testes, o teste de Kruskal-Wallis era utilizado para a análise estatística. Os dados estão expressos como média ± desvio padrão (DP), sendo considerado estatisticamente sig...

Discussão

Neste estudo, dois modelos murinos de instabilidade da JSCA foram construídos com sucesso por transecção CL + ATFL ou CL + DL. O tempo de passagem dos camundongos pelo feixe de equilíbrio aumentou significativamente em 8 semanas e 12 semanas após a cirurgia, o que é semelhante aos resultados obtidos pela equipe de Hubbard-Turner pelo corte do ligamento lateral da articulação do tornozelo^23,24. No teste de deslizamento do pé direito, observamos que os tem...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-0 Surgical Nylon Suture	Ningbo Medical Needle Co., Ltd.	191104
Acidic ethanol differentiation solution (1%)	Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.	R20778
Adhesive slides	Jiangsu Shitai Company
Ammonia solution (1%)	Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.	R20788
Anhydrous ethanol	Shanghai Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd.
Aqueous acetic acid (1%)	Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.	R20773
Black cube cassette	Shanghai Yizhe Instrument Co., Ltd.
Centrifuge tube 15ml	Beijing Soleibo Technology Co., Ltd.	YA0476
Centrifuge tube 50ml	Beijing Soleibo Technology Co., Ltd.	YA0472
Cover glass	Jiangsu Shitai Company
CTAn software	Blue scientific		micro-CT analysis software
Dataview software	AEMC instruments		commercial data analysing software
Disodium ethylenediaminetetraacetate (EDTA-2Na)	Beijing Soleibo Technology Co., Ltd.	E8490
Electric incubator	Suzhou Huamei Equipment Factory
Embedding paraffin	Leica, Germany	39001006
Eosin staining solution (alcohol soluble, 1%)	Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.	R30117
Fast green staining solution	Sigma-Aldrich, USA	F7275
Gait paper	Baoding Huarong Paper Factory
GraphPad Prism 8.0	Graphpad software		online statistical analysis tools
Iodophor cotton balls	Qingdao Hainuo Bioengineering Co., Ltd.
Leica 818 blade	Leica, Germany
Micro-CT	Skyscan, Belgium	SkyScan 1176
Micromanipulation microscope	Suzhou Omet Optoelectronics Co., Ltd.
Mimics software	Materialise		3D medical image processing software
Modified Harris Hematoxylin Stain	Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.	R20566
Mouse anti-mouse type II collagen	American Abcam Company
NaOH	Shanghai Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd.
N-butanol	Shanghai Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd.
Neutral formalin fixative (10%)	Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.
Neutral resin	Sigma-Aldrich, USA
Nrecon reconstrcution software	Micro Photonics Inc.
Oaks hair clipper	Oaks Group Co., Ltd.
Paraffin Embedding Machine	Leica, Germany
PH meter	Shanghai Leitz Company
Phosphate Buffered Saline (PBS)	American Biosharp
Physiological saline (for mammals, sterile)	Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.	R22172
Safranin O-staining solution	Sigma-Aldrich, USA	HT90432
Saline (0.9%)	Shanghai Baxter Medical Drug Co., Ltd.	309107
Shaker	Haimen Qilin Bell Instrument Manufacturing Co., Ltd.	2008779
SPSS 23	IBM		online statistical analysis tools
Tablet machine	Leica, Germany
Tissue slicer	Leica, Germany
Ugo Basile	Ugo Basile Biological Research Company
Upright fluorescence microscope	Zeiss Axiovert, Germany
U-shaped plastic channel	Shanghai Yizhe Instrument Co., Ltd.
Veterinary eye ointment	Pfizer
Xylene	Shanghai Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd.
YLS-10B Wheel Fatigue Tester	Jinan Yiyan Technology Development Co., Ltd.