Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

המפרק המורכב של הקרסול (ASCJ) הוא ליבת כף הרגל וממלא תפקיד מפתח בבקרת שיווי המשקל בפעילויות יומיומיות. פציעות ספורט מובילות לעיתים קרובות לחוסר יציבות במפרק זה. כאן, אנו מתארים מודל עכברי של חוסר יציבות הנגרמת על ידי טראנסקציה של הרצועה של ASCJ.

Abstract

נקעים בקרסול הם אולי פציעות הספורט הנפוצות ביותר בחיי היומיום, ולעתים קרובות גורמות לחוסר יציבות של המפרק המורכב של הקרסול (ASCJ), ויכולות בסופו של דבר להוביל לדלקת מפרקים ניוונית פוסט טראומטית (PTOA) בטווח הארוך. עם זאת, בשל מורכבות מנגנון הפגיעה והביטויים הקליניים, כגון אקכימוזיס, המטומה או רגישות בכף הרגל הצידית, אין הסכמה קלינית על אבחון וטיפול באי יציבות ASCJ. מאחר שמבנה השלד והשרירים של העצמות והרצועות של כף הרגל האחורית של העכבר דומה לזה של בני אדם, מודל חייתי של חוסר יציבות ASCJ בעכברים נקבע על ידי טרנסקציה של רצועות סביב ASCJ. המודל אומת היטב באמצעות סדרה של מבחנים התנהגותיים וניתוחים היסטולוגיים, כולל בדיקת קרן איזון, ניתוח טביעת רגל (הערכה של רמת פעילות גופנית ויכולת שיווי משקל בעכברים), הערכת נוסיספציה תרמית (הערכה של תפקוד חושי כף הרגל בעכברים), סריקת טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת (CT) וצביעת חתך של הסחוס המפרקי (הערכה של נזק לסחוס מפרקי וניוון בעכברים). ההקמה המוצלחת של מודל עכברי של חוסר יציבות ASCJ תספק התייחסות חשובה למחקר קליני על מנגנון הפציעה ותוביל לאפשרויות טיפול טובות יותר לנקע בקרסול.

Introduction

נקעים בקרסול הם אחת מפציעות הספורט הנפוצות ביותר בעולם. ההערכה היא כי 10,000 אנשים נפצעים מדי יום בארה"ב1, מתוכם פציעות הקשורות לספורט מהוות 15%-45%2. העלויות הרפואיות הכרוכות בטיפול בנקעים בקרסול בארצות הברית מסתכמות ב -4.2 מיליארד דולר בשנה 3,4,5. אי יציבות כרונית בכף הרגל היא בעיה נפוצה בעקבות נקעים בקרסול ומופיעה בכ-74% מנקעי הקרסול6, כולל חוסר יציבות בקרסול או תת קרקעי. עם זאת, בשל התסמינים והסימנים הקליניים הדומים, קשה לצוות הרפואי להבחין האם אי יציבות כרונית בקרסול מלווה גם באי יציבות כרונית של המפרק התת-קרקעי במרפאה, וכתוצאה מכך ניתן להחמיץ בקלות אי יציבות תת-קרקעית כרונית. לכן, השכיחות האמיתית של חוסר יציבות כרונית של מפרק תת-קרקעי בקרסול (ASCJ) (סוג מסוים של חוסר יציבות כרונית בכף הרגל הכוללת הן חוסר יציבות כרונית בקרסול והן אי יציבות תת-קרקעית כרונית) עשויה להיות גבוהה יותר מהדיווח 7,8,9. אם לא מטפלים בכך, חוסר יציבות כרוני של המפרק התת-קרקעי עלול לגרום לנקעים חוזרים ונשנים בקרסול, מה שמוביל למעגל קסמים של נקעים בקרסול ולחוסר יציבות כרוני של מורכבות הקרסול. אי יציבות כרונית ארוכת טווח של הקרסול-סובטלרי עלולה להוביל לניוון של ASCJ ולדלקת מפרקים ניוונית פוסט טראומטית, אשר יכולה להשפיע על המפרקים הסמוכים במקרים חמורים10. במחלות אלה, הטיפול הקליני הנוכחי הוא שמרני בעיקרו, בנוסף לשיטות טיפול כירורגיות כגון תיקון רצועות ושחזור רצועות11,12.

ASCJ הוא מבנה הליבה של כף הרגל ושומר על איזון הגוף במהלך תנועה13. מחקר מקיף נערך על מבנה מפרק הקרסול והמפרק התת קרקעי בנפרד14,15,16,17. עם זאת, מחקר על כל מפרק הקרסול-subtalar הוא נדיר. כרבע מהמקרים של פגיעה בקרסול קשורים לפגיעה במפרק תת-קרקעי18. בשל מנגנון הפציעה המורכב של חוסר יציבות ASCJ, אין הסכמה על אבחון וטיפול בו במסגרת הקלינית. בהתחשב במצב הנוכחי של פציעות קרסול במרפאה, יש צורך בשיטה מדעית יותר כדי לחקור את הקרסול ואת המפרק subtalar בכללותו, ובכך לספק הבנה חדשה לחקר מחלות כף הרגל.

מכיוון שהמבנה האנטומי של כף הרגל האחורית של העכבר ברמת השלד והשרירים דומה לזה של כף הרגל האנושית 19, במספר מחקרים כבר יושמו מודלים של עכברים לחקר כף הרגל/קרסול10,19. Chang et al.19 פיתחו בהצלחה שלושה מודלים עכבריים שונים של דלקת מפרקים ניוונית בקרסול. בהשראת הביסוס המוצלח של אי יציבות הקרסול במודל העכבר, ביססנו מודל עכברי לאי-יציבות מורכבת תת-קרקעית של הקרסול, והנחנו כי הטרנסקציה של הרצועות החלקיות בכף הרגל האחורית של העכבר תגרום לאי יציבות מכנית של ASCJ, מה שיוביל לדלקת מפרקים ניוונית פוסט-טראומטית (PTOA) של ASCJ. מודל בעלי החיים של חוסר יציבות ASCJ יכול לשמש לטיפול הן באי יציבות הקרסול והן באי יציבות תת-קרקעית, אשר תואמת יותר את המצב הקליני בפועל מאשר מודל אי יציבות הקרסול הפשוטהמשמש כיום 7,8,9,19. כדי לבחון השערה זו, תוכננו שני מודלים עכבריים של חוסר יציבות הנגרמת על ידי מעבר רצועה של ASCJ. התוצאות עבור התפקוד החושי-מוטורי - בדיקת קרן האיזון, ניתוח טביעת הרגל והערכת נוסיספטציה תרמית - שימשו להערכת היתכנות המודל, וטומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת (CT) וצביעה היסטולוגית שימשו להערכת הנזק וההתנוונות של הסחוס המפרקי של העכבר. ההקמה המוצלחת של מודל עכברי של חוסר יציבות ASCJ לא רק מספקת הבנה חדשה לחקר מחלות כף הרגל, אלא גם מספקת התייחסות רבת ערך למחקר קליני על המנגנונים הקשורים לפציעה, מספקת אפשרויות טיפול טובות יותר לנקעים בקרסול, ומועילה למחקרים נוספים על המחלה.

Protocol

כל המחקרים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת סוצ'ו.

1. הליכים כירורגיים

  1. חלקו עכברים זכרים C57BL/6 בני 6 שבועות בני 6 שבועות לשלוש קבוצות: הרצועה הצווארית הרוחבית וקבוצת הרצועה הטאלופיבולרית הקדמית, קבוצת הרצועה הצווארית הרוחבית ורצועת הדלטואיד, וקבוצת ניתוחי הדמה. ודא שכל העכברים גודלו בסביבה העומדת בתקנים ספציפיים ללא פתוגן (SPF).
  2. התאקלמו את העכברים בסביבת הגידול החדשה (מחזור אור/חושך של 12 שעות/12 שעות, וטמפרטורה ולחות קבועות של 18-22 מעלות צלזיוס ו-40%-70%, בהתאמה) במשך שבועיים לפני הניסוי. העבירו את העכברים לאימון קרן איזון והליכה, מעבר מקצה אחד של קרן שיווי משקל או צינור בצורת U לקצה השני ללא הפסקה, שבוע לפני הניסוי.
  3. בגיל 8 שבועות, מרדימים את העכבר באמצעות שאיפת איזופלורן על ידי הרטבת כדור צמר גפן עם 2 מ"ל של איזופלורן והכנסתו למיכל אטום לתנודתיות מלאה. עקוב אחר פעילות העכבר והמשך בשאיפה עד שפעילות העכבר פחתה באופן משמעותי. קבע את עומק ההרדמה על ידי צביטת אצבעות הרגליים של העכברים כדי לבחון את תגובותיהם. שאפו איזופלורן מאדה (2%) דרך מסכת פנים כדי לשמור על הרדמה בעכברים במהלך הניתוחים הבאים. השתמש משחת עיניים וטרינרית במהלך ההרדמה כדי למנוע את העיניים להתייבש.
  4. לאחר ההרדמה, להסיר את השיער על מפרק הקרסול של הגפיים האחוריות הימניות של העכבר עם מכונת גילוח, ולחטא את העור החשוף שלוש פעמים עם סיבובים לסירוגין של כדורי צמר גפן יוד וכדורי צמר גפן אלכוהול. מתן 5 מ"ג / ק"ג קרפרופן על ידי הזרקה תת עורית. העבירו את העכבר לחדר הניתוח של בעלי החיים באמצעות כרית כירורגית סטרילית.
  5. עבור קבוצת הרצועה הצווארית הרוחבית והרצועה הטאלופיבולרית הקדמית (CL + ATFL), יש לבצע חתך אורכי אלכסוני של 7 מ"מ כלפי מטה עם אזמל על העור מעל מפרק הקרסול הימני, ולבצע בדיקה עם מלקחיים ישרים מיקרוסקופיים לפני מפרק הקרסול.
  6. יש לוודא את חשיפת ה-ATFL בגבול התחתון של גוף הטלוס והפיבולה לאחר החיטוט ולחתוך אותו בעדינות בעזרת אזמל. הפרידו בין הגידים הפיבולריים הארוכים והקצרים לבין הגידים הארוכים של extensor digitorum longus, חשפו את ה-CL וחתכו אותו בעזרת אזמל.
  7. עבור קבוצת הרצועה הרוחבית CL + deltoid (DL), בצע חתך אנכי של 8 מ"מ על העור המדיאלי של מפרק הקרסול הימני והפריד בבוטות את ה- DL מה- malleolus המדיאלי כדי לחתוך אותו לבסוף. לאחר מכן, חתכו את ה-CL כמתואר בשלב 1.5.
  8. עבור קבוצת דמה (קבוצת ניתוחי דמה), בצע ניתוח דמה במפרק קרסול ימין אך אל תחתוך רצועות.
  9. שוטפים את החתך במי מלח רגילים סטריליים ותופרים אותו בחוט ניילון כירורגי 5-0. לבסוף, לחטא את החתך תפור עם כדור צמר גפן יוד.
  10. שמור על העכבר תחת השגחה עד שהוא יכול לשמור על עצם החזה, והשגיח עד שהוא בהכרה מלאה. יש לחטא את החתך בקרסול פעמיים ביום עם כדור צמר גפן יוד ולתת קרפרופן (5 מ"ג/ק"ג, הזרקה תת עורית), פעם ביום למשך שבוע. מאחור לבד לאחר הניתוח, ולשים לב היטב למצב שלאחר הניתוח של העכבר.
  11. שבועיים לאחר הניתוח וכאשר הנפיחות במפרק הקרסול פחתה, יש להתחיל לאמן את העכברים במכונת העייפות הסיבובית של העכבר במשך שעה אחת בכל יום.

2. מבחן קרן איזון

  1. מהדקים קורת עץ עגולה באורך 1 מ' וקוטר 20 מ"מ, נטויה ב-15° בקצה אחד, עם תפס חצובה לצילום, ומניחים את הקצה השני על משטח עבודה המחובר לקסטה סגורה.
  2. בצע אימון קרן שיווי משקל שבוע לפני הניתוח כדי להבטיח שהעכברים ינועו בצורה חלקה מקצה אחד של הקרן לקצה השני. חשבו על עכבר שעבר את המבחן כאשר הוא עובר דרך הקרן פעמיים ב-60 שניות מבלי להשהות.
  3. בצע שני ניסויים רצופים עבור כל עכבר ורסס את קרן האיזון עם 75% אלכוהול לאחר כל ניסוי כדי למנוע את שאריות הריח של העכבר הקודם מלהשפיע על העכבר הבא.
  4. יש לבצע את בדיקת קרן האיזון לפני הניתוח, 3 ימים, שבוע, 4 שבועות, 8 שבועות ו-12 שבועות לאחר הניתוח. רשום את הזמן הממוצע של כל עכבר העובר את קרן שיווי המשקל פעמיים ברציפות ואת מספר הפעמים שרגל ימין האחורית מחליקה מהקרן כמשתנים תלויים.

3. ניתוח טביעת רגל

  1. מניחים על שולחן הניסוי תעלת פלסטיק בצורת U באורך של 50 ס"מ, רוחב של 10 ס"מ וגובה של 10 ס"מ ומחברים קצה אחד של תעלת הפלסטיק לקסטה סגורה.
  2. הניחו נייר פיגמנט רגיל שטוח בתעלה, ולאחר מכן החזיקו את העכבר בשתי ידיו וצבעו את רגליו הקדמיות והאחוריות באופן שווה בפיגמנט אדום וירוק שאינו רעיל.
  3. הניחו את העכבר הצבוע בעדינות בקצה אחד של הערוץ ותנו לו לעבור לקצה השני של הקלטת. הוציאו את הנייר הפיגמנטי עם טביעות הרגליים החוצה, סמנו אותו והניחו אותו על מדף לייבוש במקום מאוורר ומוצל.
  4. לאחר שכל עכבר עובר, רססו את תעלת הפלסטיק בצורת U ב-75% אלכוהול כדי למנוע משאריות הריח של העכבר הקודם להשפיע על העכבר הבא.
  5. בחר שלוש טביעות רגל רצופות של עכבר ברור על כל נייר, והשתמש בסרגל כדי למדוד את אורך הצעד של טביעת הרגל של כף רגלו הימנית של העכבר, וכן את רוחב הצעד בין טביעת הרגל השמאלית והימנית.

4. הערכת nociception תרמית

  1. במהלך הניסוי, השתמש במבחן הפלנטרי כדי לרשום את זמן התגובה התרמית של רגל העכבר ואת זמן התגובה של העכבר במהלך פעילות ומנוחה, בהתאמה. הקלט את נתוני המדידה תוך שניות.
  2. הניחו את העכבר במכשיר המדידה, יישרו את המכשיר עם רגלו הימנית והתחילו לחמם את המכשיר כשהטמפרטורה עולה לאט. שימו לב לתגובת העכבר. כאשר הטמפרטורה עולה מעל הסיבולת, העכבר ימשוך במהירות או ילקק את רגלו הימנית. הקלט את השעה באמצעות המכשיר והגדר את השעה כזמן התגובה במהלך הפעילות.
  3. כדי למדוד את זמן התגובה במנוחה, אפשר לעכבר לשבת במשך 30 דקות על שולחן המנוחה ללא חימום, ולאחר מכן קבל את נתוני הזמן כפי שמוסבר בשלב 4.2. השתמש בנתונים זמניים שנרכשו אלה לניתוח הבא.

5. סריקת Micro-CT

  1. הרדימו עכברים בני 12 שבועות עם פחמן דו חמצני לאחר הניתוח, קלפו את עור קרסוליהם הימניים, ולאחר מכן חתכו את השוקה האמצעית ואת הפיבולה שלהם במספריים כירורגיים כדי לקבל דגימות קרסול שלמות. הניחו את הדגימות בצינורות צנטריפוגות מסומנים של 15 מ"ל המכילים 10% פורמלין נייטרלי למשך 48 שעות.
  2. לאחר הקיבוע, הניחו את הדגימות באצוות (ארבע דגימות בכל אצווה) במיכל ספוג מיוחד לסריקת מיקרו-CT. הגדר את פרמטרי המכונה כדלקמן: מתח = 50 קילו וולט, זרם = 200 mA, מסנן = 0.5 מ"מ ורזולוציה = 9 מיקרומטר. הפעל את סורק המיקרו-CT.
  3. לאחר הסריקה, השתמש בתוכנת השחזור כדי לתחום את טווח התמונה, ובחר מיקום זווית מסוים לאחר התאמת ציר XYZ של התמונה המסומנת באמצעות תוכנה מסחרית לניתוח נתונים, כמתואר ב- Liu et al.10.
  4. השתמש בתוכנת ניתוח מיקרו-CT כדי לבחור אזורי עניין רציפים של 10 שכבות בתמונות המחודשות שהותאמו על ידי צירי XYZ, ולנתח כמותית את המפרקים הדרושים כדי לקבוע את מקטע נפח העצם (BV/TV), כמתואר ב- Liu et al.10.
  5. לבסוף, השתמש בתוכנת עיבוד תמונה רפואית תלת מימדית כדי לבצע עיבוד תמונה תלת מימדי CT של מפרקי קרסול העכבר, כמתואר ב- Liu et al.10. לאחר השחזור, לבחון את השחיקה ואת היווצרות של אוסטאופיטים ב ASCJ.

6. צביעת חתך של סחוס מפרקי

הערה: כל שלבי הצביעה מבוצעים במכסה אדים, ומסכה נלבשת במהלך ההליך.

  1. השתמשו בפינצטה מיקרוסקופית ובמספריים כדי להסיר עודפי רקמה רכה סביב דגימות הקרסול, ולאחר מכן הניחו את הדגימות בצינור צנטריפוגה המכיל 10% תמיסת הסתיידות EDTA שהוכנה עם 44 גרם NaOH, שתי חבילות PBS ו-400 גרם EDTA-2Na, כאשר ה-pH מותאם ל-7.35-7.45 עם חומצה הידרוכלורית, וסמנו את הקבוצות השונות.
  2. לאחר מכן, הניחו את צינור הצנטריפוגה על שולחן ניעור (מהירות מוגדרת ל-20 סל"ד) לצורך הסתיידות והחליפו את תמיסת ההסתיידות פעם ביום. לקבוע את decalcification של הדגימות.
  3. לאחר חודש אחד של הסתיידות, לייבש את הדגימות עם אלכוהול הדרגתי ולאחר מכן להשתמש n-butanol במשך 8 שעות למטרות ניקוי. לבסוף, לטבול את הדגימות שסולקו בפרפין במצב קורונלי להטמעה.
  4. הניחו את דגימות הפרפין במקרר בטמפרטורה של 4°C לשימוש מאוחר יותר. לפני החיתוך, קחו את הדגימות מהמקרר בטמפרטורה של 4°C והכניסו אותן למקפיא של -20°C למשך כ-10 דקות כדי להקל על חיתוך המישור השלם.
  5. מקבעים את הדגימות על המיקרוטום וחותכים אותן בעובי של 6 מיקרומטר. במקביל, השתמש במיקרוסקופ כדי לבחון אם הדגימות נחתכו ברמה הקלה הצפויה של מחט מזרק לתוך רקמת העצם.
  6. כוונן מראש את טמפרטורת המים של מכונת הטבליה ל- 40 °C. לאחר מכן, חותכים שניים עד שלושה חלקי פרפין שלמים בשורה ומעבירים אותם למכונת הטבליה להרחבה מלאה. לאחר מכן, להסיר את קטעי פרפין עם מגלשת זכוכית לנקז את המים. לבסוף, סמן את השקופיות בקבוצות ובמספרים.

7. צביעת המטוקסילין ואאוזין (H&E)

  1. מניחים את המקטעים באינקובטור של 60 מעלות צלזיוס כך שניתן יהיה לצפות במבנה המפרק השלם של ASCJ תחת המיקרוסקופ ואופים את המקטעים במשך 40-50 דקות. לאחר מכן, הסר את החלקים בשעווה עם קסילן 3x, ממוספרים כ- I, II ו- III לזיהוי קל, למשך 15 דקות, 15 דקות ו- 10 דקות, בהתאמה.
  2. הניחו את החלקים נטולי השעווה ב-100% אתנול 2x, ממוספרים כ-I ו-II לזיהוי קל, 90% אתנול ו-80% אתנול למשך 3 דקות, 3 דקות, 5 דקות ו-5 דקות, בהתאמה. לאחר מכן, לשטוף את החלקים עם מים מזוקקים פעמיים (ddH2O) במשך 5 דקות.
  3. לאחר השריה עם hematoxylin במשך 1 דקות, לשטוף את החלקים עם ddH2O עד שהם הופכים חסרי צבע. השרו את החלקים בתמיסת התמיינות אתנול חומצי 1% למשך 30 שניות ושטפו אותם 3x למשך דקה אחת עם ddH2O. לאחר מכן, מכתימים את החלקים בתמיסת אמוניה 1% למשך דקה אחת, ולאחר מכן שוטפים 3x למשך דקה אחת כל אחד עם ddH2O.
  4. לאחר מכן, להכתים את הדגימות עם תמיסת צביעת eosin במשך 1 דקות, ולאחר מכן לשים אותם 95% אתנול ו 100% אתנול במשך 1 דקות כל אחד ברצף. לבסוף, לטפל בחלקים עם קסילן IV במשך 1 דקות.
  5. יבשו את המקטעים באוויר, הדביקו טיפת שרף נייטרלי על הדגימות שעל המגלשות וכסו אותן בחלקת כיסוי. לאחר מכן, צלם תמונות עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי זקוף בשדה בהיר במהירות של 5x ו- 20x.

8. ספרנין O-fast כתמים ירוקים

  1. מכניסים את החלקים שנבחרו לאינקובטור בטמפרטורה של 60 מעלות ואופים את הנתחים במשך 40-50 דקות. לאחר מכן, יש להסיר את החלקים עם קסילן I, II ו-III למשך 15 דקות, 15 דקות ו-10 דקות, בהתאמה.
  2. מניחים את החלקים ללא שעווה ב-100% אתנול I, II, 90% אתנול ו-80% אתנול למשך 3 דקות, 3 דקות, 5 דקות ו-5 דקות, בהתאמה. לאחר מכן, לשטוף את החלקים עם ddH2O במשך 5 דקות.
  3. לאחר השריה עם hematoxylin במשך 1 דקות, לשטוף את החלקים עם ddH2O עד שהם הופכים חסרי צבע. השרו את החלקים בתמיסת התמיינות אתנול חומצי 1% למשך 30 שניות ושטפו אותם 3x למשך דקה אחת עם ddH2O. לאחר מכן, הכתימו את החלקים בתמיסת אמוניה 1% למשך דקה אחת, ושטפו אותם 3x למשך דקה אחת כל אחד עם ddH2O.
  4. השרו את החלקים ב-0.05% ירוק מהיר למשך 2 דקות, ולאחר מכן השרו את החלקים בתמיסת חומצה אצטית 1% למשך 30 שניות וב-0.1% ספרנין למשך 5 דקות. הניחו את הדגימות המוכתמות ב-95% אתנול ו-100% אתנול למשך דקה, אחת אחרי השנייה.
  5. לבסוף, לטפל בחלקים עם קסילן IV במשך 1 דקות. יבשו את המקטעים באוויר, הדביקו טיפת שרף נייטרלי על הדגימות שעל המגלשות וכסו אותן בחלקת כיסוי. לאחר מכן, צלם תמונות עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי זקוף בשדה בהיר במהירות של 5x ו- 20x.

9. אימונוהיסטוכימיה

  1. יום 1: מניחים את החלקים שנבחרו באינקובטור של 60 מעלות צלזיוס, אופים את החלקים במשך 40-50 דקות, ולאחר מכן מסירים אותם בשעווה עם קסילן I, II ו- III במשך 15 דקות, 15 דקות ו- 10 דקות, בהתאמה. מניחים את החלקים ללא שעווה ב-100% אתנול I, II, 90% אתנול ו-80% אתנול למשך 3 דקות, 3 דקות, 5 דקות ו-5 דקות, בהתאמה. לאחר מכן, שטפו את החלקים עם ddH2O במשך 5 דקות, השתמשו בעט היסטוכימי כדי להקיף את שטח הדגימה, והניחו אותם בקופסה כהה.
  2. שליפת אנטיגן: יש לזרוק 20-50 μL של 0.25% טריפסין לאזור הדגימה המעוגלת, לדגור באינקובטור של 37°C למשך 60 דקות, ולאחר מכן לשטוף את הדגימות 3x למשך 2 דקות כל אחת עם PBS. חסום peroxidase אנדוגני על ידי הוספת 3% H 2 O 2, לדגור את הדגימות במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בחושך, ולאחר מכן לשטוף אותם 3x במשך2דקות כל אחד עם PBS. בצעו חסימת סרום על ידי הוספת סרום עיזים 10% בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות, ולאחר מכן דגרו עם הנוגדן הראשוני (קולגן עכבר נגד עכבר מסוג II, מדולל 1,000 פעמים) בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה.
  3. יום 2: חממו מחדש את המקטעים בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לשחזר את הנוגדן העיקרי ולשטוף את חלקים 3x במשך 2 דקות כל אחד עם PBS. לדגור עם הנוגדן המשני במשך 40 דקות באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן לשטוף את החלקים 3x במשך 2 דקות כל אחד עם PBS.
  4. פיתוח צבע DAB: הוסף 5 מ"ל של ddH 2 O, שתי טיפות חיץ, ארבע טיפות DAB ושתי טיפות של H 2 O2כדי להכין את מגיב DAB. הוסף 20-50 μL של מגיב לחלקים, לשמור על הדגימות מוגן מפני אור במשך 5 דקות, ולאחר מכן לשטוף את החלקים במשך 2 דקות עם ddH2O.
  5. לאחר השריה עם hematoxylin במשך 1 דקות, לשטוף את החלקים עם ddH2O עד שהם הופכים חסרי צבע. השרו את החלקים בתמיסת התמיינות אתנול חומצי 1% למשך 30 שניות ושטפו אותם 3x למשך דקה כל אחד עם ddH 2 O. צבעו את החלקים למשך דקה אחת בתמיסת אמוניה 1%, ולאחר מכן שטפו אותם 3x למשך דקה אחת כל אחד עם ddH2O.
  6. לאחר מכן, מניחים את החלקים באתנול 95% ו -100% אתנול, בהתאמה, למשך דקה אחת כל אחד. לבסוף, לדגור את החלקים במשך 1 דקות עם xylene IV. יבשו את המקטעים באוויר, הדביקו טיפת שרף נייטרלי על הדגימות שעל המגלשות וכסו אותן בחלקת כיסוי. לאחר מכן, צלם תמונות עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי זקוף בשדה בהיר במהירות של 5x ו- 20x.

תוצאות

הניתוח הסטטיסטי של נתוני המתאם בוצע באמצעות כלי ניתוח סטטיסטיים מקוונים. הנתונים שעמדו בשני המבחנים של התפלגות נורמלית והומוגניות השונות שימשו לניתוח סטטיסטי נוסף על ידי ניתוח חד-כיווני של שונות. אם הנתונים לא עמדו בשני המבחנים, מבחן קרוסקל-וואליס שימש לניתוח סטטיסטי. הנתונים מבוטאים כמ?...

Discussion

במחקר זה, שני מודלים עכבריים של חוסר יציבות ASCJ נבנו בהצלחה על ידי transecting CL + ATFL או CL + DL. הזמן עבור העכברים לעבור דרך קרן שיווי המשקל גדל באופן משמעותי לאחר 8 שבועות ו -12 שבועות לאחר הניתוח, אשר דומה לתוצאות שהתקבלו על ידי צוות האברד-טרנר על ידי חיתוך הרצועה הצידית של מפרק הקרסול23,24<...

Disclosures

לאף אחד מהמחברים אין אינטרסים מנוגדים.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי תוכנית המלגות הממשלתית של מחוז ג'יאנגסו ותוכנית אקדמית מועדפת לפיתוח מוסדות להשכלה גבוהה בג'יאנגסו (PAPD).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
5-0 Surgical Nylon SutureNingbo Medical Needle Co., Ltd.191104
Acidic ethanol differentiation solution (1%)Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.R20778
Adhesive slidesJiangsu Shitai Company
Ammonia solution (1%)Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.R20788
Anhydrous ethanolShanghai Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd.
Aqueous acetic acid (1%)Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.R20773
Black cube cassetteShanghai Yizhe Instrument Co., Ltd.
Centrifuge tube 15mlBeijing Soleibo Technology Co., Ltd.YA0476
Centrifuge tube 50mlBeijing Soleibo Technology Co., Ltd.YA0472
Cover glassJiangsu Shitai Company
CTAn softwareBlue scientificmicro-CT analysis software
Dataview softwareAEMC instrumentscommercial data analysing software
Disodium ethylenediaminetetraacetate (EDTA-2Na)Beijing Soleibo Technology Co., Ltd.E8490
Electric incubatorSuzhou Huamei Equipment Factory
Embedding paraffinLeica, Germany39001006
Eosin staining solution (alcohol soluble, 1%)Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.R30117
Fast green staining solutionSigma-Aldrich, USAF7275
Gait paperBaoding Huarong Paper Factory
GraphPad Prism 8.0Graphpad softwareonline statistical analysis tools
Iodophor cotton ballsQingdao Hainuo Bioengineering Co., Ltd.
Leica 818 bladeLeica, Germany
Micro-CTSkyscan, BelgiumSkyScan 1176
Micromanipulation microscopeSuzhou Omet Optoelectronics Co., Ltd.
Mimics softwareMaterialise 3D medical image processing software 
Modified Harris Hematoxylin StainShanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.R20566
Mouse anti-mouse type II collagenAmerican Abcam Company
NaOHShanghai Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd.
N-butanolShanghai Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd.
Neutral formalin fixative (10%)Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.
Neutral resinSigma-Aldrich, USA
Nrecon reconstrcution software Micro Photonics Inc.
Oaks hair clipperOaks Group Co., Ltd.
Paraffin Embedding MachineLeica, Germany
PH meterShanghai Leitz Company
Phosphate Buffered Saline (PBS)American Biosharp
Physiological saline (for mammals, sterile)Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.R22172
Safranin O-staining solutionSigma-Aldrich, USAHT90432
Saline (0.9%)Shanghai Baxter Medical Drug Co., Ltd.309107
ShakerHaimen Qilin Bell Instrument Manufacturing Co., Ltd.2008779
SPSS 23IBMonline statistical analysis tools
Tablet machineLeica, Germany
Tissue slicerLeica, Germany
Ugo BasileUgo Basile Biological Research Company
Upright fluorescence microscopeZeiss Axiovert, Germany
U-shaped plastic channelShanghai Yizhe Instrument Co., Ltd.
Veterinary eye ointmentPfizer
XyleneShanghai Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd.
YLS-10B Wheel Fatigue TesterJinan Yiyan Technology Development Co., Ltd.

References

  1. Waterman, B. R., Belmont, P. J., Cameron, K. L., Deberardino, T. M., Owens, B. D. Epidemiology of ankle sprain at the United States Military Academy. American Journal of Sports Medicine. 38 (4), 797-803 (2010).
  2. Fong, D. T., Chan, Y. Y., Mok, K. M., Yung, P. S., Chan, K. M. Understanding acute ankle ligamentous sprain injury in sports. Sports Medicine Arthroscopy Rehabilitation Therapy & Technology. 1 (1), 14 (2009).
  3. Herzog, M. M., Kerr, Z. Y., Marshall, S. W., Wikstrom, E. A. Epidemiology of ankle sprains and chronic ankle instability. Journal of Athletic Training. 54 (6), 603-610 (2019).
  4. Medina McKeon, J. M., Hoch, M. C. The ankle-joint complex: A kinesiologic approach to lateral ankle sprains. Journal of Athletic Training. 54 (6), 589-602 (2019).
  5. Jones, M. H., Amendola, A. S. Acute treatment of inversion ankle sprains: immobilization versus functional treatment. Clinical Orthopaedics and Related Research. 455 (463), 169-172 (2007).
  6. Anandacoomarasamy, A., Barnsley, L. Long term outcomes of inversion ankle injuries. British Association of Sport and Medicine. 39 (3), 14 (2005).
  7. Ringleb, S. I., Dhakal, A., Anderson, C. D., Bawab, S., Paranjape, R. Effects of lateral ligament sectioning on the stability of the ankle and subtalar joint. Journal of Orthopaedic Research. 29 (10), 1459-1464 (2011).
  8. Mittlmeier, T., Wichelhaus, A. Subtalar joint instability. European Journal of Trauma and Emergency Surgery. 41 (6), 623-629 (2015).
  9. Barg, A., et al. Subtalar instability: Diagnosis and treatment. Foot & Ankle International. 33 (02), 151-160 (2012).
  10. Liu, P., et al. A mouse model of ankle-subtalar joint complex instability induced post-traumatic osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 16 (1), 541 (2021).
  11. Lui, T. H. Modified arthroscopic Brostrom procedure with bone tunnels. Arthroscopy Techniques. 5 (4), 775-780 (2016).
  12. Wang, W., Xu, G. H. Allograft tendon reconstruction of the anterior talofibular ligament and calcaneofibular Ligament in the treatment of chronic ankle instability. BMC Musculoskeletal Disorders. 18 (1), 150 (2017).
  13. Yang, N., Waddington, G., Adams, R., Han, J. Age-related changes in proprioception of the ankle complex across the lifespan. Journal of Sport and Health Science. 8 (6), 548-554 (2019).
  14. Michels, F., et al. Searching for consensus in the approach to patients with chronic lateral ankle instability: Ask the expert. Knee Surgery Sports Traumatology Arthroscopy. 26 (7), 2095-2102 (2017).
  15. Kamada, K., Watanabe, S., Yamamoto, H. Chronic subtalar instability due to insufficiency of the calcaneofibular ligament: A case report. Foot & Ankle International. 23 (12), 1135-1137 (2002).
  16. Kato, T. The diagnosis and treatment of instability of the subtalar joint. The Journal of Bone and Joint Surgery. 77 (3), 400-406 (1995).
  17. Meyer, J. M., Garcia, J., Hoffmeyer, P., Fritschy, D. The subtalar sprain. A roentgenographic study. Clinical Orthopaedics and Related Research. (226), 169-173 (1988).
  18. Mittlmeier, T., Rammelt, S. Update on subtalar joint instability. Foot and Ankle Clinics. 23 (3), 397-413 (2018).
  19. Chang, S. H., et al. Comparison of mouse and human ankles and establishment of mouse ankle osteoarthritis models by surgically-induced instability. Osteoarthritis & Cartilage. 24 (4), 688-697 (2016).
  20. Naito, K., et al. Evaluation of the effect of glucosamine on an experimental rat osteoarthritis model. Life Sciences. 86 (13-14), 538-543 (2010).
  21. Pritzker, K. P. H., et al. Osteoarthritis cartilage histopathology: Grading and staging. Osteoarthritis Cartilage. 14 (1), 13-29 (2006).
  22. Glasson, S. S., et al. The OARSI histopathology initiative - Recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 18, 17-23 (2010).
  23. Hubbard-Turner, T., Wikstrom, E. A., Guderian, S., Turner, M. J. Acute ankle sprain in a mouse model. Medicine & Science in Sports & Exercise. 45 (8), 1623-1628 (2013).
  24. Wikstrom, E. A., Hubbard-Turner, T., Guderian, S., Turner, M. J. Lateral ankle sprain in a mouse model: Lifelong sensorimotor dysfunction. Journal of Athletic Training. 53 (3), 249-254 (2018).
  25. Bell-Krotoski, J. A., Fess, E. E., Figarola, J. H., Hiltz, D. Threshold detection and Semmes-Weinstein monofilaments. Journal of Hand Therapy. 8 (2), 155-162 (1995).
  26. Wieland, H. A., Michaelis, M., Kirschbaum, B. J., Rudolphi, K. A. Osteoarthritis - An untreatable disease. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (4), 331-344 (2005).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved