踝距下复杂关节不稳定的小鼠模型

摘要

踝距下复合关节 （ASCJ） 是足部的核心，在日常活动中起着关键作用。运动损伤通常会导致该关节不稳定。在这里，我们描述了韧带横断诱导的ASCJ不稳定性的小鼠模型。

摘要

踝关节扭伤可能是日常生活中最常见的运动损伤，通常会导致踝距下复合关节 （ASCJ） 不稳定，从长远来看，最终会导致创伤后骨关节炎 （PTOA）。然而，由于损伤机制的复杂性和临床表现，如瘀斑、血肿或外侧足压痛，对ASCJ不稳定的诊断和治疗尚无临床共识。由于小鼠后足骨骼和韧带的肌肉骨骼结构与人类相当，因此通过ASCJ周围韧带的横断建立了小鼠ASCJ不稳定的动物模型。该模型通过一系列行为测试和组织学分析得到了充分验证，包括平衡木测试、足迹分析（评估小鼠的运动水平和平衡能力）、热伤害感受评估（评估小鼠的足部感觉功能）、显微计算机断层扫描 （CT） 扫描和关节软骨切片染色（评估小鼠关节软骨损伤和退化）。成功建立ASCJ不稳定小鼠模型将为损伤机制的临床研究提供有价值的参考，并为踝关节扭伤提供更好的治疗选择。

引言

踝关节扭伤是全球最常见的运动损伤之一。据估计，美国每天有 10,000 人受伤¹，其中运动相关伤害占 15%-45%²。在美国，与治疗踝关节扭伤相关的医疗费用每年达 42 亿美元 ^3,4,5。慢性足部不稳是踝关节扭伤后的常见问题，约占踝关节扭伤^{的 74% 6}，包括踝关节或距下关节不稳。然而，由于临床症状和体征相似，医务人员在临床上很难区分慢性踝关节不稳是否也伴有距下关节不稳，因此容易漏诊慢性距下关节不稳。因此，慢性踝距下复合关节 （ASCJ） 不稳定（一种特定类型的慢性足部不稳定，包括慢性踝关节不稳定和慢性距下不稳定）的真实发生率可能高于报告^的 7,8,9。如果不及时治疗，慢性踝距下复合关节不稳定会导致反复踝关节扭伤，导致踝关节扭伤和慢性踝距下复合关节不稳定的恶性循环。长期慢性踝距下复合体不稳定可导致 ASCJ 退化和创伤后骨关节炎，严重时会影响邻近关节¹⁰.对于这些疾病，目前的临床治疗主要是保守治疗，此外还有韧带修复和韧带重建等手术治疗方法^11,12。

ASCJ 是足部的核心结构，在运动¹³ 期间保持身体平衡。已经对踝关节和距下关节的结构进行了广泛的研究^{分别 14,15,16,17}。然而，对整个踝距下关节的研究很少见。大约四分之一的踝关节损伤病例与距下关节损伤有关¹⁸。由于ASCJ不稳定的损伤机制复杂，临床上对诊断和治疗尚无共识。考虑到目前临床踝关节损伤的现状，需要一种更科学的方法，将踝关节和距下关节作为一个整体进行研究，从而为研究足部疾病提供新的认识。

由于小鼠后足在肌肉骨骼水平上的解剖结构与人足的解剖结构相当19，因此在几项研究中，已经实施了用于足/踝研究的小鼠模型^10,19。Chang 等 ¹⁹ 成功开发了三种不同的踝骨关节炎小鼠模型。受小鼠模型中踝关节不稳定性成功建立的启发，我们建立了踝距下复合体不稳定性的小鼠模型，假设小鼠后足部分韧带的横断会导致ASCJ的机械不稳定，从而导致ASCJ的创伤后骨关节炎（PTOA）。ASCJ不稳动物模型可用于踝关节不稳和距下不稳的治疗，比目前使用的单纯踝关节不稳模型⁷、⁸、^9、19更符合临床实际情况。为了验证这一假设，设计了两个韧带横断诱导的ASCJ不稳定的小鼠模型。采用平衡木试验、足迹分析、热伤害感受评估等感觉运动功能结果评价模型的可行性，采用显微计算机断层扫描（CT）和组织学染色评估小鼠关节软骨损伤和变性。ASCJ不稳定性小鼠模型的成功建立，不仅为研究足部疾病提供了新的认识，也为损伤相关机制的临床研究提供了有价值的参考，为踝关节扭伤提供了更好的治疗选择，有助于进一步研究该疾病。

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研究方案

所有动物研究均按照《实验动物护理和使用指南》进行，并得到苏州大学机构动物护理和使用委员会的批准。

1. 外科手术

1. 将21只6周龄的C57BL/6雄性小鼠分为三组:颈横韧带和距腓前韧带组，颈横韧带和三角韧带组，假手术组。确保所有小鼠都是在符合特定无病原体（SPF）标准的环境中饲养的。
2. 在实验前2周使小鼠适应新的饲养环境（12小时/ 12小时的光/暗循环，以及18-22°C和40%-70%的恒定温度和湿度）。在实验前 1 周，对小鼠进行平衡木和步态训练，从平衡木或 U 形管的一端不停地走到另一端。
3. 在 8 周龄时，通过用 2 mL 异氟烷润湿棉球并将其置于密封容器中以充分挥发，使用异氟烷吸入麻醉小鼠。监测小鼠的活动并继续吸入，直到小鼠的活动显着降低。通过捏住小鼠的脚趾来观察它们的反应，以确定麻醉的深度。通过面罩吸入蒸发的异氟醚（2%），以在随后的手术中维持小鼠的麻醉。麻醉期间使用兽用眼药膏，防止眼睛干燥。
4. 麻醉后，用剃须刀去除小鼠右后肢踝关节上的毛发，用碘棉球和酒精棉球交替对裸露的皮肤进行三次消毒。通过皮下注射给予 5 mg/kg 卡洛芬。使用无菌手术垫将小鼠转移到显微外科动物手术室。
5. 对于颈椎横韧带和距腓前韧带（CL+ATFL）组，用手术刀在右踝关节上方的皮肤上做一个7mm的斜向下纵向切口，并在踝关节前方用显微镜直镊进行探查。
6. 探查后确保距骨体下缘和腓骨的ATFL暴露，并用手术刀轻轻切割。将腓骨长肌腱和腓骨长伸肌腱分开，露出CL，用手术刀切开。
7. 对于横向 CL + 三角韧带 （DL） 组，在右踝关节的内侧皮肤上做一个 8 毫米的垂直切口，并将 DL 与内踝钝地分开，最终将其切割。然后，按照步骤 1.5 中的说明切割 CL。
8. 对于假手术组（假手术组），对右踝关节进行假手术，但不要切断任何韧带。
9. 用无菌生理盐水冲洗切口，并用5-0手术尼龙线缝合。最后，用碘棉球对缝合的切口进行消毒。
10. 观察小鼠，直到它能够保持胸骨卧位，并监督它直到它完全清醒。用碘棉球每天两次对踝关节切口进行消毒，并给予卡洛芬（5mg / kg，皮下注射），每天一次，持续1周。术后单独后方，密切注意小鼠术后状况。
11. 手术后两周，当踝关节肿胀减轻时，开始每天在小鼠旋转疲劳机中锻炼小鼠1小时。

2.平衡木试验

1. 用摄影三脚架夹夹住一根长 1 m、直径 20 mm 的圆形木梁，一端倾斜 15°，另一端放在连接到封闭盒的工作台面上。
2. 手术前1周进行平衡木训练，以确保小鼠从平衡木的一端平稳地移动到另一端。假设鼠标在 60 秒内两次穿过光束而不停顿时已通过测试。
3. 对每只小鼠进行两次连续试验，并在每次试验后用75%的酒精喷洒平衡木，以防止前一只小鼠的残留气味影响下一只小鼠。
4. 术前、术后3天、1周、4周、8周、12周进行平衡木试验。记录每只鼠标连续两次通过平衡木的平均时间和右后脚滑出平衡木的次数作为因变量。

3. 足迹分析

1. 在实验台上放置一个长50厘米，宽10厘米，高10厘米的U形塑料通道，并将塑料通道的一端连接到封闭的盒中。
2. 将一张普通的颜料纸平放在通道中，然后用双手握住鼠标，用无毒的红色和绿色颜料均匀地涂上前脚和后脚。
3. 轻轻地将涂漆的鼠标放在通道的一端，让它们移动到盒的另一端。取出带有脚印的颜料纸，做标记，放在架子上，在通风阴凉处晾干。
4. 每只鼠标通过后，用75%的酒精喷洒U形塑料通道，以防止前一只鼠标的残留气味影响下一只鼠标。
5. 在每张纸上选择三个连续的透明鼠标脚印，用尺子测量鼠标右脚脚印的步长，以及左右脚印之间的步宽。

4. 热伤害感受评估

1. 实验过程中，采用足底试验分别记录小鼠足部的热伤害感受反应时间和小鼠活动和休息期间的反应时间。以秒为单位记录测量数据。
2. 将鼠标放在测量仪器中，将仪器与右脚对齐，随着温度的缓慢升高，开始加热仪器。观察鼠标的响应。当温度升高到公差以上时，鼠标会迅速退出或舔右脚。使用仪器记录时间，并将时间定义为活动期间的反应时间。
3. 为了测量静止时的反应时间，让鼠标在不加热的情况下在休息台上静置30分钟，然后按照步骤4.2中的说明获得时间数据。使用这些获取的时间数据进行后续分析。

5. 显微CT扫描

1. 术后用二氧化碳对12周龄小鼠实施安乐死，剥去其右脚踝的皮肤，然后用手术剪刀剪断其胫骨中段和腓骨，以获得完整的踝关节标本。将标本置于含有10%中性福尔马林的标记15mL离心管中48小时。
2. 固定后，将标本分批放置（每批四个标本）放入专用海绵罐中进行显微CT扫描。机器参数设置如下:电压 = 50 kV，电流 = 200 mA，滤波器 = 0.5 mmAl，分辨率 = 9 μm。运行微型 CT 扫描仪。
3. 扫描后，使用重建软件勾勒出图像的范围，并使用商业数据分析软件调整所描绘图像的XYZ轴后选择特定的角度位置，如Liu等人¹⁰所述。
4. 使用显微CT分析软件在XYZ轴调整的重组图像中选择连续的10层感兴趣区域，并定量分析所需的关节以确定骨体积分数（BV / TV），如Liu等人¹⁰所述。
5. 最后，使用三维医学图像处理软件对小鼠踝关节进行三维CT图像处理，如Liu等人¹⁰所述。重建后，观察ASCJ中骨赘的磨损和形成。

6.关节软骨切片染色

注意:所有染色步骤均在通风橱中进行，并在过程中戴上口罩。

1. 用显微镊子和剪刀去除脚踝标本周围多余的软组织，然后将标本放入含有10%EDTA脱钙液的离心管中，该溶液由44 g NaOH、两包PBS、400 g EDTA-2Na制备，用盐酸调节pH至7.35-7.45，并标记不同组。
2. 接下来，将离心管放在振荡台（速度设置为 20 rpm）上进行脱钙，并每天更换一次脱钙溶液。确定试样的脱钙。
3. 脱钙1个月后，用梯度醇使试样脱水，然后使用正丁醇8小时进行澄清。最后，将清除的标本浸入石蜡中的冠状位置进行包埋。
4. 将石蜡试样置于4°C冰箱中供后用。切片前，从4°C冰箱中取出试样，并将它们置于-20°C冰箱中约10分钟，以利于切割整个平面。
5. 将标本固定在切片机上，并以6μm的厚度切片。同时，使用显微镜观察样品是否在预期的水平上被切割——注射器针头容易穿透骨组织。
6. 提前将片机的水温调节到40°C。接下来，连续切割两到三个完整的石蜡部分，并将它们转移到压片机中进行完全膨胀。然后，用载玻片取出石蜡部分并沥干水。最后，用组和数字标记幻灯片。

7. 苏木精和伊红（H&E）染色

1. 将切片置于60°C培养箱中，使其可以在显微镜下观察到完整的ASCJ关节结构，并将切片烘烤40-50分钟。然后，分别用二甲苯 3x 脱蜡切片，编号为 I、II 和 III 以便于识别，分别 15 分钟、15 分钟和 10 分钟。
2. 将脱蜡切片置于 100% 乙醇 2 次中，编号为 I 和 II，以便于识别、90% 乙醇和 80% 乙醇分别 3 分钟、3 分钟、5 分钟和 5 分钟。接下来，用双蒸水（ddH₂O）清洗切片5分钟。
3. 用苏木精浸泡1分钟后，用ddH₂O洗涤切片，直至它们变得无色。将切片浸泡在1%酸性乙醇分化溶液中30秒，并用ddH₂O洗涤3次，持续1分钟。之后，用 1% 氨溶液染色切片 1 分钟，然后用 ddH₂O 洗涤 3 次，每次 1 分钟。
4. 接下来，用曙红染色液对样品进行染色1分钟，然后将它们分别放入95%乙醇和100%乙醇中连续1分钟。最后，用二甲苯IV处理切片1分钟。
5. 风干切片，将一滴中性树脂粘贴到载玻片上的标本上，并用盖玻片盖住它们。然后，用正置荧光显微镜在明场中以 5 倍和 20 倍的速度拍摄图像。

8. 番红O-fast绿染色

1. 将选定的切片放入60°C培养箱中，烘烤切片40-50分钟。然后，分别用二甲苯I，II和III脱蜡15分钟，15分钟和10分钟。
2. 将脱蜡切片分别置于100%乙醇I，II，90%乙醇和80%乙醇中3分钟，3分钟，5分钟和5分钟。接下来，用ddH₂O洗涤切片5分钟。
3. 用苏木精浸泡1分钟后，用ddH₂O洗涤切片，直至它们变得无色。将切片浸泡在1%酸性乙醇分化溶液中30秒，并用ddH₂O洗涤3次，持续1分钟。然后，用 1% 氨溶液染色切片 1 分钟，并用 ddH₂O 洗涤 3 次，每次 1 分钟。
4. 将切片浸泡在0.05%速绿中2分钟，然后将切片浸泡在1%乙酸溶液中30秒，在0.1%沙夫拉宁中浸泡5分钟。将染色的样品一个接一个地置于95%乙醇和100%乙醇中1分钟。
5. 最后，用二甲苯IV处理切片1分钟。风干切片，将一滴中性树脂粘贴到载玻片上的标本上，并用盖玻片盖住它们。然后，用正置荧光显微镜在明场中以 5 倍和 20 倍的速度拍摄图像。

9. 免疫组化

1. 第1天:将选定的切片置于60°C培养箱中，烘烤切片40-50分钟，然后用二甲苯I，II和III分别脱蜡15分钟，15分钟和10分钟。将脱蜡切片分别置于100%乙醇I，II，90%乙醇和80%乙醇中3分钟，3分钟，5分钟和5分钟。然后，用ddH₂O洗涤切片5分钟，用组织化学笔圈出标本区域，并将它们放入暗盒中。
2. 抗原修复:将20-50μL的0.25%胰蛋白酶滴入圈出的标本区域，在37°C培养箱中孵育60分钟，然后用PBS洗涤标本3次，每次2分钟。通过加入3%H 2 O 2来阻断内源性过氧化物酶，将标本在室温下在黑暗中孵育10分钟，然后用PBS洗涤3次，每次₂分钟。通过在室温下加入10%山羊血清20分钟进行血清封闭，然后在4°C下与一抗（小鼠抗小鼠II型胶原，稀释1,000倍）孵育过夜。
3. 第 2 天:在室温下重新加热切片 30 分钟。回收一抗并用PBS洗涤切片3次，每次2分钟。在37°C的培养箱中与二抗一起孵育40分钟，然后用PBS洗涤切片3次，每次2分钟。
4. DAB 显色:加入 5 mL ddH 2 O、2 滴缓冲液、4 滴 DAB 和 2 滴 H 2 O₂ 以制备 DAB 试剂。向切片中加入 20-50 μL 试剂，将样品避光 5 分钟，然后用 ddH 2 O 洗涤切片₂分钟。
5. 用苏木精浸泡1分钟后，用ddH₂O洗涤切片，直至它们变得无色。将切片浸泡在1%酸性乙醇分化溶液中30秒，并用ddH 2 O洗涤3次，每次1分钟，用1%氨溶液染色切片1分钟，然后用ddH₂O洗涤3次，每次1分钟。
6. 接下来，将切片分别置于 95% 乙醇和 100% 乙醇中，每次 1 分钟。最后，用二甲苯IV孵育切片1分钟。风干切片，将一滴中性树脂粘贴到载玻片上的标本上，并用盖玻片盖住它们。然后，用正置荧光显微镜在明场中以 5 倍和 20 倍的速度拍摄图像。

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结果

利用在线统计分析工具对相关数据进行统计分析。采用单因素方差分析，将满足正态分布和方差均匀性两个检验的数据用于进一步的统计分析。如果数据不符合两个检验，则采用Kruskal-Wallis检验进行统计分析。数据表示为平均值±标准差 （SD）， p < 0.05 被认为具有统计学意义。

平衡木试验
对每组小鼠在每阶段通过平衡木两次的平均所需时间进行统计分析...

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讨论

本研究通过横断CL+ATFL或CL+DL成功构建了2个ASCJ不稳定性小鼠模型。小鼠通过平衡木的时间在手术后8周和12周显着增加，这与Hubbard-Turner团队通过切割踝关节外侧韧带获得的结果相似^23,24。在右足滑动试验中，我们观察到两组断韧带小鼠的滑行次数明显高于假韧带组小鼠，并且在手术后12周滑动次数达到最大值，从而提示两组断韧带小鼠可能患有ASCJ不稳定?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-0 Surgical Nylon Suture	Ningbo Medical Needle Co., Ltd.	191104
Acidic ethanol differentiation solution (1%)	Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.	R20778
Adhesive slides	Jiangsu Shitai Company
Ammonia solution (1%)	Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.	R20788
Anhydrous ethanol	Shanghai Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd.
Aqueous acetic acid (1%)	Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.	R20773
Black cube cassette	Shanghai Yizhe Instrument Co., Ltd.
Centrifuge tube 15ml	Beijing Soleibo Technology Co., Ltd.	YA0476
Centrifuge tube 50ml	Beijing Soleibo Technology Co., Ltd.	YA0472
Cover glass	Jiangsu Shitai Company
CTAn software	Blue scientific		micro-CT analysis software
Dataview software	AEMC instruments		commercial data analysing software
Disodium ethylenediaminetetraacetate (EDTA-2Na)	Beijing Soleibo Technology Co., Ltd.	E8490
Electric incubator	Suzhou Huamei Equipment Factory
Embedding paraffin	Leica, Germany	39001006
Eosin staining solution (alcohol soluble, 1%)	Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.	R30117
Fast green staining solution	Sigma-Aldrich, USA	F7275
Gait paper	Baoding Huarong Paper Factory
GraphPad Prism 8.0	Graphpad software		online statistical analysis tools
Iodophor cotton balls	Qingdao Hainuo Bioengineering Co., Ltd.
Leica 818 blade	Leica, Germany
Micro-CT	Skyscan, Belgium	SkyScan 1176
Micromanipulation microscope	Suzhou Omet Optoelectronics Co., Ltd.
Mimics software	Materialise		3D medical image processing software
Modified Harris Hematoxylin Stain	Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.	R20566
Mouse anti-mouse type II collagen	American Abcam Company
NaOH	Shanghai Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd.
N-butanol	Shanghai Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd.
Neutral formalin fixative (10%)	Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.
Neutral resin	Sigma-Aldrich, USA
Nrecon reconstrcution software	Micro Photonics Inc.
Oaks hair clipper	Oaks Group Co., Ltd.
Paraffin Embedding Machine	Leica, Germany
PH meter	Shanghai Leitz Company
Phosphate Buffered Saline (PBS)	American Biosharp
Physiological saline (for mammals, sterile)	Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.	R22172
Safranin O-staining solution	Sigma-Aldrich, USA	HT90432
Saline (0.9%)	Shanghai Baxter Medical Drug Co., Ltd.	309107
Shaker	Haimen Qilin Bell Instrument Manufacturing Co., Ltd.	2008779
SPSS 23	IBM		online statistical analysis tools
Tablet machine	Leica, Germany
Tissue slicer	Leica, Germany
Ugo Basile	Ugo Basile Biological Research Company
Upright fluorescence microscope	Zeiss Axiovert, Germany
U-shaped plastic channel	Shanghai Yizhe Instrument Co., Ltd.
Veterinary eye ointment	Pfizer
Xylene	Shanghai Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd.
YLS-10B Wheel Fatigue Tester	Jinan Yiyan Technology Development Co., Ltd.