Мышиная модель нестабильности голеностопно-подтаранного сустава

Резюме

Голеностопно-подтаранный сустав (ASCJ) является ядром стопы и играет ключевую роль в контроле равновесия в повседневной деятельности. Спортивные травмы часто приводят к нестабильности в этом суставе. В данной работе мы описываем мышиную модель нестабильности ASCJ, вызванной транссекцией связок.

Аннотация

Растяжение связок голеностопного сустава является, пожалуй, наиболее распространенной спортивной травмой в повседневной жизни, часто приводящей к нестабильности голеностопно-подтаранного сустава (ASCJ) и в конечном итоге может привести к посттравматическому остеоартриту (PTOA) в долгосрочной перспективе. Однако из-за сложности механизма травмы и клинических проявлений, таких как экхимоз, гематома или болезненность в боковой части стопы, не существует клинического консенсуса по диагностике и лечению нестабильности ASCJ. Поскольку костно-мышечная структура костей и связок задней стопы мыши сопоставима с таковой у человека, животная модель нестабильности ASCJ у мышей была установлена путем рассечения связок вокруг ASCJ. Модель была хорошо валидирована с помощью серии поведенческих тестов и гистологических анализов, включая тест с балансиром, анализ отпечатка ноги (оценка уровня физической нагрузки и способности к равновесию у мышей), оценку тепловой ноцицепции (оценка сенсорной функции стопы у мышей), микрокомпьютерную томографию (КТ) и окрашивание срезов суставного хряща (оценка повреждения и дегенерации суставного хряща у мышей). Успешное создание мышиной модели нестабильности ASCJ предоставит ценный справочник для клинических исследований механизма травмы и приведет к лучшим вариантам лечения растяжения связок голеностопного сустава.

Введение

Растяжение связок голеностопного сустава является одной из самых распространенных спортивных травм во всем мире. По оценкам, 10 000 человек ежедневно получают травмы в Соединенных Штатах¹, из которых 15-45% приходится на травмы, связанные со спортом^. Медицинские расходы, связанные с лечением растяжений связок голеностопного сустава в Соединенных Штатах, составляют 4,2 миллиарда долларов в год^. Хроническая нестабильность стопы является распространенной проблемой после растяжения связок голеностопного сустава и возникает примерно в 74% случаев растяжения связок голеностопного^{сустава6}, включая нестабильность голеностопного сустава или подтаранного сустава. Однако из-за схожих клинических симптомов и признаков медицинскому персоналу в клинике сложно определить, сопровождается ли хроническая нестабильность голеностопного сустава хронической нестабильностью подтаранного сустава, и, как следствие, хроническую подтаранную нестабильность можно легко пропустить. Таким образом, истинная частота хронической нестабильности голеностопно-подтаранного сустава (ASCJ) (специфический тип хронической нестабильности стопы, который включает в себя как хроническую нестабильность голеностопного сустава, так и хроническую подтаранную нестабильность) может быть выше, чем сообщалось ^7,8,9. При отсутствии лечения хроническая нестабильность голеностопно-подтаранного сустава может привести к повторным растяжениям связок голеностопного сустава, что приводит к порочный круг растяжений связок голеностопного сустава и хронической нестабильности голеностопно-подтаранного комплекса. Длительная хроническая нестабильность голеностопно-подтаранного комплекса может привести к дегенерации АСКЖ и посттравматическому остеоартрозу, который в тяжелых случаях может поражать соседние суставы¹⁰. Для этих заболеваний в настоящее время клиническое лечение в основном консервативно, в дополнение к хирургическим методам лечения, таким как восстановление связок и реконструкция связок^11,12.

ASCJ является основной структурой стопы и поддерживает равновесие тела во время движения¹³. Проведено обширное исследование строения голеностопного сустава и подтаранного сустава по отдельности^14,15,16,17. Тем не менее, исследования всего голеностопно-подтаранного сустава проводятся редко. Около четверти случаев травмы голеностопного сустава связаны с повреждением подтаранного сустава¹⁸. Из-за сложного механизма повреждения нестабильности ASCJ не существует единого мнения по поводу диагностики и лечения этого заболевания в клинических условиях. Учитывая современную ситуацию с травмами голеностопного сустава в клинике, необходим более научный метод изучения голеностопного и подтаранного суставов в целом, тем самым обеспечивая новое понимание для изучения заболеваний стопы.

Поскольку анатомическое строение задней стопы мыши на уровне опорно-двигательного аппарата сопоставимо с таковым у стопы человека 19, в нескольких исследованиях уже были реализованы мышиные модели для исследования стопы/голеностопного сустава^10,19. Chang et ^al.19 успешно разработали три различные мышиные модели остеоартрита голеностопного сустава. Вдохновленные успешным установлением нестабильности голеностопного сустава в мышиной модели, мы создали мышиную модель нестабильности голеностопно-подтаранного комплекса, предположив, что рассечение частичных связок в задней части стопы мыши приведет к механической нестабильности ASCJ, что приведет к посттравматическому остеоартриту (PTOA) ASCJ. Животная модель нестабильности ASCJ может быть использована для лечения как нестабильности голеностопного, так и подтаранной нестабильности, что больше соответствует фактической клинической ситуации, чем используемая в настоящее время простая модель нестабильности голеностопного сустава 7,8,9,19. Для проверки этой гипотезы были разработаны две мышиные модели нестабильности ASCJ, индуцированной транссекцией связок. Результаты сенсомоторной функции — тест на равновесие, анализ отпечатков ног и оценка термической ноцицепции — были использованы для оценки осуществимости модели, а микрокомпьютерная томография (КТ) и гистологическое окрашивание были использованы для оценки повреждения и дегенерации суставного хряща мыши. Успешное создание мышиной модели нестабильности ASCJ не только обеспечивает новое понимание для изучения заболеваний стопы, но и предоставляет ценный справочник для клинических исследований механизмов, связанных с травмой, предоставляет лучшие варианты лечения растяжений связок голеностопного сустава и полезен для дальнейших исследований этого заболевания.

протокол

Все исследования на животных были проведены в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных и были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Университета Сучжоу.

1. Хирургические процедуры

1. Разделите 21 6-недельного самца мышей C57BL/6 на три группы: группа поперечной шейной связки и передняя талофибулярная связка, группа поперечной шейной связки и группа дельтовидной связок, а также группа фиктивной хирургии. Убедитесь, что все мыши были выращены в среде, соответствующей определенным стандартам, свободным от патогенов (SPF).
2. Акклиматизируйте мышей к новой среде выращивания (цикл свет/темнота 12 ч/12 ч, постоянная температура и влажность 18-22 °C и 40%-70% соответственно) в течение 2 недель до эксперимента. За 1 неделю до эксперимента подвергните мышей тренировке баланса и походки, переходя от одного конца бревна или U-образной трубы к другому концу без остановки.
3. В возрасте 8 недель обезболивайте мышь с помощью ингаляций изофлурана, смочив ватный тампон 2 мл изофлурана и поместив его в герметичный контейнер для полного испарения. Следите за активностью мыши и продолжайте ингаляцию до тех пор, пока активность мыши значительно не снизится. Определяйте глубину анестезии, зажимая пальцы мышей, чтобы наблюдать за их реакцией. Вдыхайте испаренный изофлуран (2%) через лицевую маску для поддержания анестезии у мышей во время последующих операций. Используйте ветеринарную глазную мазь во время анестезии, чтобы предотвратить пересыхание глаз.
4. После обезболивания удалите бритвой волосы на голеностопном суставе правых задних конечностей мыши и трижды продезинфицируйте открытые участки кожи чередующимися рядами йодных ватных шариков и спиртовых ватных шариков. Вводят 5 мг/кг карпрофена подкожно. Перенесите мышь в операционную микрохирургического животного с помощью стерильной хирургической прокладки.
5. Для группы поперечной шейной связки и передней талофибулярной связки (КЛ + АТФЛ) скальпелем на коже над правым голеностопным суставом делают косой продольный разрез длиной 7 мм вниз и прощупывают микроскопическими прямыми щипцами перед голеностопным суставом.
6. Обеспечьте обнажение АТФЛ на нижней границе тела таранной кости и малоберцовой кости после зондирования и аккуратно разрежьте ее скальпелем. Разделите длинное и короткое малоберцовые сухожилия и сухожилия разгибателя пальцевого пальца, обнажите КЛ и разрежьте его скальпелем.
7. Для группы поперечная КЛ + дельтовидная связка (ДЛ) сделайте вертикальный разрез 8 мм на медиальной коже правого голеностопного сустава и тупо отделите ДЛ от медиальной лодыжки, чтобы окончательно разрезать ее. Затем обрежьте CL, как описано в шаге 1.5.
8. В группе симуляции (группа симуляции хирургии) проведите фиктивную операцию на правом голеностопном суставе, но не разрезайте связки.
9. Промойте разрез стерильным физиологическим раствором и зашите хирургической нейлоновой нитью 5-0. Наконец, продезинфицируйте зашитый разрез ватным тампоном с йодом.
10. Держите мышь под наблюдением до тех пор, пока она не сможет сохранять положение на грудине, и наблюдайте за ней до тех пор, пока она не придет в сознание. Дезинфицируйте разрез голеностопного сустава два раза в день ватным тампоном с йодом и вводите карпрофен (5 мг/кг, подкожная инъекция) один раз в день в течение 1 недели. После операции отдохните в одиночестве и обратите пристальное внимание на послеоперационное состояние мыши.
11. Через две недели после операции, когда отек голеностопного сустава уменьшится, начните тренировать мышей в роторном тренажере для мышей в течение 1 часа каждый день.

2. Испытание балансиром

1. Зажмите круглый деревянный брус длиной 1 м и диаметром 20 мм, наклоненный под углом 15° с одного конца, зажимом для штатива для фотографии, а другой конец положите на рабочую поверхность, соединенную с закрытой кассетой.
2. За 1 неделю до операции проводите тренировку баланса, чтобы мыши плавно переходили от одного конца балки к другому. Считайте, что мышь прошла испытание, если она проходит через луч дважды за 60 с без паузы.
3. Выполните два последовательных испытания для каждой мыши и опрыскайте балансир 75% спиртом после каждой попытки, чтобы предотвратить воздействие остаточного запаха предыдущей мыши на следующую.
4. Проводите тест баланса перед операцией, через 3 дня, 1 неделю, 4 недели, 8 недель и 12 недель после операции. Запишите среднее время, за которое каждая мышь проходит бревно два раза подряд, и количество раз, когда правая задняя лапа соскальзывает с балки в качестве зависимых переменных.

3. Анализ футпринта

1. Поместите на экспериментальный стол-образный пластиковый канал длиной 50 см, шириной 10 см и высотой 10 см и соедините один конец пластикового канала с закрытой кассетой.
2. Положите обычную пигментную бумагу в канал, а затем держите мышь обеими руками и равномерно покрасьте ее переднюю и заднюю лапки нетоксичным красным и зеленым пигментом.
3. Аккуратно поместите нарисованную мышь на один конец канала и дайте ей переместиться на другой конец кассеты. Возьмите пигментированную бумагу со следами, отметьте ее и положите сушиться на вешалку в проветриваемом и затененном месте.
4. После того, как каждая мышь пройдет мимо, опрыскайте U-образный пластиковый канал 75% спиртом, чтобы остаточный запах предыдущей мыши не повлиял на следующую.
5. Выберите три последовательных четких следа мыши на каждом листе бумаги и с помощью линейки измерьте длину шага посадочного места правой ноги мыши, а также ширину шага между левым и правым контурами.

4. Оценка тепловой ноцицепции

1. Во время эксперимента используйте подошвенную пробу для регистрации времени реакции тепловой ноцицепции лапки мыши и времени реакции мыши во время активности и покоя соответственно. Записывайте данные измерений за считанные секунды.
2. Поместите мышь в измерительный прибор, выровняйте прибор по правой ноге и начните нагревать прибор с медленным повышением температуры. Понаблюдайте за реакцией мыши. Когда температура превысит допустимую, мышь быстро отстранится или облизывает правую ногу. Запишите время с помощью прибора и определите время как время реакции во время занятия.
3. Чтобы измерить время реакции в состоянии покоя, дайте мыши посидеть в течение 30 минут на столе для отдыха без нагрева, а затем получите данные о времени, как описано в шаге 4.2. Используйте полученные временные данные для последующего анализа.

5. Микро-КТ сканирование

1. Усыпляйте 12-недельных мышей углекислым газом после операции, снимайте кожу с их правых лодыжек, а затем разрезайте их среднюю большеберцовую и малоберцовую кости хирургическими ножницами, чтобы получить полные образцы лодыжек. Поместите образцы в маркированные центрифужные пробирки объемом 15 мл, содержащие 10% нейтрального формалина, на 48 ч.
2. После фиксации образцы помещают партиями (по четыре образца в партию) в специальный губчатый резервуар для микро-КТ-сканирования. Установите параметры машины следующим образом: напряжение = 50 кВ, ток = 200 мА, фильтр = 0,5 ммАл и разрешение = 9 мкм. Запустите микрокомпьютерный томограф.
3. После сканирования используйте программное обеспечение для реконструкции, чтобы очертить диапазон изображения, и выберите конкретное положение угла после настройки оси XYZ очерченного изображения с помощью коммерческого программного обеспечения для анализа данных, как описано в Liu et ^al.10.
4. Используйте программное обеспечение для анализа микро-КТ для выбора непрерывных 10-слойных областей, представляющих интерес на реструктурированных изображениях, скорректированных по осям XYZ, и количественного анализа необходимых суставов для определения объемной доли кости (BV/TV), как описано в Liu et ^al.10.
5. Наконец, используйте программное обеспечение для обработки трехмерных медицинских изображений для выполнения трехмерной компьютерной томографии голеностопных суставов мыши, как описано в Liu et ^al.10. После реконструкции наблюдают износ и образование остеофитов в ASCJ.

6. Разрезное окрашивание суставного хряща

ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы окрашивания выполняются в вытяжном шкафу, а во время процедуры надевается маска.

1. Используйте микроскопический пинцет и ножницы, чтобы удалить лишние мягкие ткани вокруг образцов лодыжки, а затем поместите образцы в центрифужную пробирку, содержащую 10% раствор для декальцинации ЭДТА, приготовленный из 44 г NaOH, двух упаковок PBS и 400 г ЭДТА-2Na, с pH, доведенным до 7,35-7,45 соляной кислотой, и отметьте различные группы.
2. Затем поместите центрифужную пробирку на встряхивающий стол (скорость установлена на 20 об/мин) для удаления накипи и меняйте раствор для удаления накипи один раз в день. Определите декальцинацию образцов.
3. После 1 месяца декальцинации образцы обезвоживают градиентным спиртом, а затем используют н-бутанол в течение 8 ч для очистки. Наконец, очищенные образцы погружают в парафин в корончатом положении для заделки.
4. Поместите образцы парафина в холодильник с температурой 4 °C для последующего использования. Перед секционированием достаньте образцы из холодильника с температурой 4 °C и поместите их в морозильную камеру с температурой −20 °C примерно на 10 минут, чтобы облегчить резку всей плоскости.
5. Зафиксируйте образцы на микротоме и разрежьте их на толщину 6 мкм. При этом с помощью микроскопа наблюдают, были ли образцы срезаны на ожидаемом уровне – легкого проникновения иглы шприца в костную ткань.
6. Заранее отрегулируйте температуру воды в таблеточной машине до 40 °C. Далее отрежьте в ряд две-три полные секции парафина и перенесите их в таблеточную машину для полного раскрытия. Затем удалите парафиновые срезы предметным стеклом и слейте воду. Наконец, отметьте слайды группами и номерами.

7. Окрашивание гематоксилином и эозином (H&E)

1. Поместите срезы в инкубатор при температуре 60 °C таким образом, чтобы под микроскопом можно было разглядеть неповрежденную структуру сустава ASCJ, и выпекайте срезы в течение 40-50 минут. Затем депарафинизируйте срезы ксилолом 3x, пронумерованными как I, II и III для легкой идентификации, в течение 15 минут, 15 минут и 10 минут соответственно.
2. Поместите депарафинизированные срезы в 100% этанол 2 раза, пронумерованных как I и II для легкой идентификации, 90% этанола и 80% этанола на 3 мин, 3 мин, 5 мин и 5 мин соответственно. Затем промойте срезы дважды дистиллированной водой (ddH₂O) в течение 5 мин.
3. После замачивания гематоксилином в течение 1 мин промывают срезы_ддН2Одо тех пор, пока они не станут бесцветными. Срезы замочить в 1%-ном растворе кислого этанола на 30 с и промыть их 3 раза в течение 1 мин с ddH₂O. После этого окрашивают срезы 1% раствором нашатырного спирта в течение 1 мин, а затем промывают 3 раза по 1 мин с ддН₂О.
4. Затем окрасьте образцы раствором для окрашивания эозином в течение 1 мин, а затем поместите их последовательно в 95% этанол и 100% этанол на 1 мин каждый. Наконец, обработайте срезы ксилолом внутривенно в течение 1 мин.
5. Высушите срезы на воздухе, нанесите каплю нейтральной смолы на образцы на предметных стеклах и накройте их покровным листком. Затем сделайте снимки с помощью вертикального флуоресцентного микроскопа в светлом поле с 5x и 20x.

8. Сафранин О-фаст зеленое окрашивание

1. Поместите выбранные секции в инкубатор с температурой 60 °C и запекайте их в течение 40-50 минут. Затем депарафинизируют срезы ксилолом I, II и III в течение 15 мин, 15 мин и 10 мин соответственно.
2. Поместите депарафинизированные срезы в 100% этанол I, II, 90% этанол и 80% этанол на 3 мин, 3 мин, 5 мин и 5 мин соответственно. Далее промойте срезы ddH₂O в течение 5 мин.
3. После замачивания гематоксилином в течение 1 мин промывают срезы_ддН2Одо тех пор, пока они не станут бесцветными. Срезы замочить в 1%-ном растворе кислого этанола на 30 с и промыть их 3 раза в течение 1 мин с ddH₂O. Затем окрасьте срезы 1% раствором нашатырного спирта в течение 1 мин и промойте их 3 раза по 1 минуте с ддН₂О.
4. Срезы замачивают в 0,05% быстром зеленом растворе в течение 2 мин с последующим замачиванием срезов в 1% растворе уксусной кислоты в течение 30 с и в 0,1% сафранине в течение 5 мин. Поместите окрашенные образцы в 95% этанол и 100% этанол на 1 мин, один за другим.
5. Наконец, обработайте срезы ксилолом внутривенно в течение 1 мин. Высушите срезы на воздухе, нанесите каплю нейтральной смолы на образцы на предметных стеклах и накройте их покровным листком. Затем сделайте снимки с помощью вертикального флуоресцентного микроскопа в светлом поле с 5x и 20x.

9. Иммуногистохимия

1. День 1: Поместите выбранные секции в инкубатор при температуре 60 °C, запекайте их в течение 40-50 минут, а затем депарафинизируйте их ксилолом I, II и III в течение 15 минут, 15 минут и 10 минут соответственно. Поместите депарафинизированные срезы в 100% этанол I, II, 90% этанол и 80% этанол на 3 мин, 3 мин, 5 мин и 5 мин соответственно. Затем промойте срезы ddH₂O в течение 5 минут, с помощью гистохимической ручки обведите область образца и поместите их в темную коробку.
2. Забор антигена: Капните 20-50 мкл 0,25% трипсина в область образца, обведенную кружком, инкубируйте в инкубаторе при температуре 37 °C в течение 60 минут, а затем промойте образцы 3 раза по 2 минуты каждый PBS. Блокируют эндогенную пероксидазу, добавляя 3%_H2O2, инкубируют образцы в течение 10 мин при комнатной температуре в темноте, а затем промывают их 3 раза по 2 мин каждый PBS. Выполните блокирование сыворотки, добавив 10% козью сыворотку при комнатной температуре в течение 20 минут, а затем инкубируйте с первичным антителом (мышиный антимышиный коллаген II типа, разбавленный в 1000 раз) при 4 °C в течение ночи.
3. День 2: Разогрейте секции при комнатной температуре в течение 30 минут. Восстановите первичные антитела и промойте срезы 3 раза по 2 мин каждый с PBS. Инкубируют со вторичным антителом в течение 40 мин в инкубаторе при 37 °C, а затем промывают срезы 3 раза по 2 мин каждый PBS.
4. Проявление цвета DAB: Добавьте 5 мл ddH 2 O, двекапли буфера, четыре капли DAB и две капли H 2 O₂ для приготовления реагента DAB. Добавьте 20-50 мкл реагента к срезам, держите образцы защищенными от света в течение 5 минут, а затем промойте срезы в течение 2 минут ddH₂O.
5. После замачивания гематоксилином в течение 1 мин промывают срезы_ддН2Одо тех пор, пока они не станут бесцветными. Замочите срезы в 1%-ном растворе кислого этанола в течение 30 с и промойте их 3 раза по 1 мин с ddH 2 O. Окрасьте срезы на 1 мин 1% раствором аммиака, а затем промойте их 3 раза по 1 мин ddH₂O.
6. Затем поместите секции в 95% этанол и 100% этанол соответственно на 1 минуту каждая. Наконец, инкубируйте срезы в течение 1 минуты с ксилолом внутривенно. Высушите срезы на воздухе, нанесите каплю нейтральной смолы на образцы на предметных стеклах и накройте их покровным листком. Затем сделайте снимки с помощью вертикального флуоресцентного микроскопа в светлом поле с 5x и 20x.

Результаты

Статистический анализ корреляционных данных проводился с использованием онлайн-инструментов статистического анализа. Данные, удовлетворяющие двум критериям нормального распределения и однородности дисперсии, были использованы для дальнейшего статистического анализа методом одно...

Обсуждение

В этом исследовании две мышиные модели нестабильности ASCJ были успешно построены путем разрезания CL + ATFL или CL + DL. Время, необходимое мышам для прохождения через балку, значительно увеличивалось через 8 недель и 12 недель после операции, что аналогично результатам, полученным командой Хаб...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-0 Surgical Nylon Suture	Ningbo Medical Needle Co., Ltd.	191104
Acidic ethanol differentiation solution (1%)	Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.	R20778
Adhesive slides	Jiangsu Shitai Company
Ammonia solution (1%)	Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.	R20788
Anhydrous ethanol	Shanghai Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd.
Aqueous acetic acid (1%)	Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.	R20773
Black cube cassette	Shanghai Yizhe Instrument Co., Ltd.
Centrifuge tube 15ml	Beijing Soleibo Technology Co., Ltd.	YA0476
Centrifuge tube 50ml	Beijing Soleibo Technology Co., Ltd.	YA0472
Cover glass	Jiangsu Shitai Company
CTAn software	Blue scientific		micro-CT analysis software
Dataview software	AEMC instruments		commercial data analysing software
Disodium ethylenediaminetetraacetate (EDTA-2Na)	Beijing Soleibo Technology Co., Ltd.	E8490
Electric incubator	Suzhou Huamei Equipment Factory
Embedding paraffin	Leica, Germany	39001006
Eosin staining solution (alcohol soluble, 1%)	Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.	R30117
Fast green staining solution	Sigma-Aldrich, USA	F7275
Gait paper	Baoding Huarong Paper Factory
GraphPad Prism 8.0	Graphpad software		online statistical analysis tools
Iodophor cotton balls	Qingdao Hainuo Bioengineering Co., Ltd.
Leica 818 blade	Leica, Germany
Micro-CT	Skyscan, Belgium	SkyScan 1176
Micromanipulation microscope	Suzhou Omet Optoelectronics Co., Ltd.
Mimics software	Materialise		3D medical image processing software
Modified Harris Hematoxylin Stain	Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.	R20566
Mouse anti-mouse type II collagen	American Abcam Company
NaOH	Shanghai Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd.
N-butanol	Shanghai Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd.
Neutral formalin fixative (10%)	Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.
Neutral resin	Sigma-Aldrich, USA
Nrecon reconstrcution software	Micro Photonics Inc.
Oaks hair clipper	Oaks Group Co., Ltd.
Paraffin Embedding Machine	Leica, Germany
PH meter	Shanghai Leitz Company
Phosphate Buffered Saline (PBS)	American Biosharp
Physiological saline (for mammals, sterile)	Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.	R22172
Safranin O-staining solution	Sigma-Aldrich, USA	HT90432
Saline (0.9%)	Shanghai Baxter Medical Drug Co., Ltd.	309107
Shaker	Haimen Qilin Bell Instrument Manufacturing Co., Ltd.	2008779
SPSS 23	IBM		online statistical analysis tools
Tablet machine	Leica, Germany
Tissue slicer	Leica, Germany
Ugo Basile	Ugo Basile Biological Research Company
Upright fluorescence microscope	Zeiss Axiovert, Germany
U-shaped plastic channel	Shanghai Yizhe Instrument Co., Ltd.
Veterinary eye ointment	Pfizer
Xylene	Shanghai Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd.
YLS-10B Wheel Fatigue Tester	Jinan Yiyan Technology Development Co., Ltd.