足首-距骨下複合関節不安定性のマウスモデル

要約

足首距骨下複合関節(ASCJ)は足のコアであり、日常生活におけるバランス制御に重要な役割を果たします。スポーツ傷害は、しばしばこの関節の不安定性につながります。ここでは、靭帯離断によるASCJの不安定性のマウスモデルについて述べる。

要約

足首の捻挫は、おそらく日常生活で最も一般的なスポーツ傷害であり、多くの場合、足首-距骨下複合関節(ASCJ)の不安定性をもたらし、最終的には長期的には心的外傷後変形性関節症(PTOA)につながる可能性があります。しかし、損傷メカニズムの複雑さと、斑状出血、血腫、または外側足の圧痛などの臨床症状のため、ASCJの不安定性の診断と治療に関する臨床的コンセンサスはありません。マウスの後足の骨と靭帯の筋骨格構造はヒトに匹敵することから、ASCJ周辺の靭帯の切断により、マウスのASCJ不安定性の動物モデルを確立した。このモデルは、平均台試験、フットプリント分析(マウスの運動レベルとバランス能力の評価)、熱侵害受容評価(マウスの足の感覚機能の評価)、マイクロコンピュータ断層撮影(CT)スキャン、関節軟骨の切片染色(マウスの関節軟骨の損傷と変性の評価)など、一連の行動テストと組織学的分析を通じて十分に検証されました。ASCJ不安定性のマウスモデルの確立に成功すれば、損傷メカニズムに関する臨床研究に貴重な参考資料を提供し、足首捻挫のより良い治療法の選択肢をもたらすでしょう。

概要

足首の捻挫は、世界中で最も一般的なスポーツ傷害の1つです。米国では毎日10,000人が負傷していると推定され^ており1、そのうちスポーツ関連の負傷は15%〜45%^{を占めています2}。米国における足首の捻挫の治療に関連する医療費は、年間42億ドルにのぼります^3,4,5。慢性的な足の不安定性は、足首の捻挫に続く一般的な問題であり、足首や距骨下の不安定性を含む足首の捻挫^の約74%で発生します6。しかし、臨床症状や徴候が似ているため、慢性的な足首の不安定性が慢性的な距骨下関節の不安定性も伴うかどうかを医療スタッフが区別することは困難であり、その結果、慢性的な距骨下不安定性は簡単に見逃される可能性があります。したがって、慢性足首距骨下複合関節(ASCJ)不安定性(慢性足首不安定性と慢性距骨下不安定性の両方を含む特定のタイプの慢性足の不安定性)の真の発生率は、報告されている^7,8,9よりも高い可能性があります。慢性的な足首-距骨下複合関節の不安定性は、治療せずに放置すると、足首の捻挫を繰り返し、足首の捻挫と慢性的な足首-距骨下複合体の不安定性の悪循環につながる可能性があります。長期にわたる慢性的な足首-距骨下複合体の不安定性は、ASCJの変性および心的外傷後変形性関節症につながる可能性があり、重症の場合、隣接する関節に影響を与える可能性があります¹⁰。これらの疾患に対して、現在の臨床治療は、靭帯修復や靭帯再建などの外科的治療法に加えて、主に保存的である^11,12。

ASCJは足のコア構造であり、動き¹³の間、体のバランスを維持します。足首関節と距骨下関節の構造について、別々に広範な研究が行われています14,15,16,17。しかし、足首と距骨下関節全体の研究はまれです。足首損傷の症例の約4分の1は距骨下関節損傷に関連している¹⁸。ASCJの不安定性の複雑な損傷メカニズムのために、臨床現場での診断と治療に関するコンセンサスはありません。クリニックにおける足関節損傷の現状を考えると、足関節と距骨下関節全体を研究するためのより科学的な方法が必要であり、それによって足の病気を研究するための新しい理解を提供します。

筋骨格レベルでのマウス後足の解剖学的構造は人間の足の解剖学的構造に匹敵するため19、いくつかの研究では、足/足首研究用のマウスモデルがすでに実装されています^10,19。Changら¹⁹は、変形性足首関節症の3つの異なるマウスモデルの開発に成功しました。マウスモデルにおける足首の不安定性の確立に成功したことに触発され、マウス後足の部分靭帯の切断がASCJの機械的不安定性をもたらし、ASCJの心的外傷後変形性関節症(PTOA)につながるという仮説を立てて、足首-距骨下複合体の不安定性のマウスモデルを確立しました。ASCJ不安定性動物モデルは、足首の不安定性と距骨下不安定性の両方の治療に使用でき、現在使用されている単純な足首不安定性モデル7,8,9,19よりも実際の臨床状況と一致しています。この仮説を検証するために、靭帯離断によるASCJの不安定性を示す2つのマウスモデルを設計しました。感覚運動機能(平均台試験、フットプリント解析、熱侵害受容評価)の結果を用いてモデルの実現可能性を評価し、マイクロコンピュータ断層撮影(CT)と組織学的染色を用いてマウス関節軟骨の損傷と変性を評価した。ASCJ不安定性のマウスモデルの確立に成功したことは、足の病気を研究するための新しい理解を提供するだけでなく、損傷関連のメカニズムに関する臨床研究のための貴重な参考資料を提供し、足首の捻挫に対するより良い治療オプションを提供し、病気のさらなる研究に役立ちます。

プロトコル

すべての動物実験は、実験動物の飼育と使用に関するガイドラインに従って実施され、東呉大学の動物実験施設の飼育と使用委員会によって承認されました。

1.外科的処置

1. 生後6週齢のC57BL/6雄マウス21匹を、横頸靭帯および前距腓靭帯群、横頸靭帯および三角筋靭帯群、偽手術群の3群に分ける。すべてのマウスが特定の病原体フリー(SPF)基準を満たす環境で飼育されていることを確認してください。
2. 実験前の2週間、マウスを新しい飼育環境(明暗サイクル12時間/12時間、温度と湿度のそれぞれ18〜22°Cと40%〜70%の一定温度)に順応させる。実験の1週間前に、マウスに平均台と歩行のトレーニングを行い、平均台またはU字型のパイプの一方の端からもう一方の端まで停止せずに移動させます。
3. 8週齢で、綿球を2mLのイソフルランで濡らし、完全に揮発させるために密閉容器に入れて、イソフルラン吸入を使用してマウスに麻酔をかけます。マウスの活動を監視し、マウスの活動が大幅に減少するまで吸入を続けます。マウスのつま先をつまんで反応を観察して、麻酔の深さを決定します。気化したイソフルラン(2%)をフェイスマスクを通して吸入し、その後の手術中にマウスの麻酔を維持します。麻酔中は獣医の眼軟膏を使用して、目の乾燥を防ぎます。
4. 麻酔後、マウスの右後肢の足首関節の毛をシェーバーで取り除き、露出した皮膚をヨウ素綿球とアルコール綿球を交互に3回消毒する。皮下注射で5 mg / kgのカルプロフェンを投与します。.滅菌手術用パッドを使用して、マウスを顕微鏡手術動物の手術室に移します。
5. 横頸靭帯と前距腓靭帯(CL + ATFL)グループの場合、右足首関節の上の皮膚にメスで7mm斜め下向きの縦方向切開を行い、足首関節の前に顕微鏡のまっすぐな鉗子でプローブします。
6. プロービング後、距骨本体と腓骨の下縁にATFLが露出していることを確認し、メスで穏やかに切断します。長腓骨腱と短腓骨腱と長指伸筋腱を分離し、CLを露出させ、メスで切断します。
7. 横CL+三角筋靭帯(DL)群の場合、右足首関節の内側皮膚を8mmの垂直切開を行い、DLを内側くるぶしから鈍く分離して最終的に切断します。次に、ステップ1.5で説明したようにCLをカットします。
8. 偽手術群(偽手術群)では、右足関節の偽手術を行いますが、靭帯は切除しません。
9. 切開部を滅菌生理食塩水で洗い流し、5-0の外科用ナイロン糸で縫合します。最後に、縫合した切開部をヨウ素綿球で消毒します。
10. マウスが胸骨の横臥を維持できるようになるまで観察下に置き、完全に意識が戻るまで監視します。足首切開部を1日2回ヨウ素綿球で消毒し、カルプロフェン(5mg/kg、皮下注射)を1日1回1週間投与する。手術後は一人で後部座席に座り、マウスの術後の状態に細心の注意を払ってください。
11. 手術から2週間後、足首関節の腫れが引いたら、マウス回転疲労マシンでマウスを毎日1時間運動させます。

2. 平均台試験

1. 長さ1m、直径20mmの円形の木製梁を、一方の端が15°傾いた写真用三脚クリップで固定し、もう一方の端を閉じたカセットに接続された作業台に置きます。
2. 手術の1週間前に平均台のトレーニングを行い、マウスがビームの端から端までスムーズに動くようにします。マウスが 60 秒間に 2 回、一時停止せずにビームを通過した場合、テストに合格したとします。
3. 各マウスについて2回連続して試行を行い、各試行後に平均台に75%のアルコールをスプレーして、前のマウスの残留臭いが次のマウスに影響を与えないようにします。
4. 術前、術後3日、1週間、4週間、8週間、12週間後に平均台テストを実施します。各マウスが平均台を2回連続して通過する平均時間と、右後足が平均台から滑り落ちる回数を従属変数として記録します。

3. フットプリント分析

1. 長さ50cm、幅10cm、高さ10cmのU字型のプラスチックチャンネルを実験台に置き、プラスチックチャンネルの一端を閉じたカセットに接続します。
2. 普通の顔料紙をチャネルに平らに置き、マウスを両手で持ち、前足と後足に無毒の赤と緑の顔料を均等に塗ります。
3. 塗装したマウスをチャンネルの一方の端にそっと置き、カセットのもう一方の端に移動します。足跡のついた顔料紙を取り出し、印をつけてラックに置き、風通しの良い日陰で乾かします。
4. 各マウスが通過した後、前のマウスの残留臭いが次のマウスに影響を与えないように、U字型のプラスチックチャネルに75%のアルコールをスプレーします。
5. 各用紙に連続して3つの透明なマウスフットプリントを選択し、定規を使用して、マウスの右足のフットプリントのステップ長と、左右のフットプリント間のステップ幅を測定します。

4.熱侵害受容評価

1. 実験中、足底テストを使用して、マウスの足の熱侵害受容反応時間と、活動中と安静時のマウスの反応時間をそれぞれ記録します。測定データを秒単位で記録します。
2. マウスを測定器に置き、測定器を右足に合わせ、ゆっくりと温度を上げながら機器の加熱を開始します。マウスの反応を観察します。温度が許容範囲を超えて上昇すると、マウスはすぐに右足を引っ込めたり舐めたりします。機器を使用して時間を記録し、その時間をアクティビティ中の反応時間として定義します。
3. 安静時の反応時間を測定するには、マウスを加熱せずにレストテーブルに30分間座らせてから、ステップ4.2で説明したように時間データを取得します。取得したこれらの時間データは、その後の解析に使用します。

5. マイクロCTスキャン

1. 術後、生後12週齢のマウスを二酸化炭素で安楽死させ、右足首の皮膚を剥がした後、手術用ハサミで中脛骨と腓骨を切断して、完全な足首標本を取得します。検体を、10%中性ホルマリンを含むマーク付きの15 mL遠心チューブに48時間入れます。
2. 固定後、検体をバッチ(バッチごとに4つの検体)でマイクロCTスキャン用の特別なスポンジタンクに入れます。機械のパラメータを、電圧 = 50 kV、電流 = 200 mA、フィルタ = 0.5 mmAl、分解能 = 9 μmに設定します。マイクロCTスキャナーを実行します。
3. スキャン後、再構成ソフトウェアを使用して画像の範囲を描写し、Liuら¹⁰に記載されているように、市販のデータ解析ソフトウェアを使用して描写された画像のXYZ軸を調整した後、特定の角度位置を選択します。
4. マイクロCT解析ソフトウェアを使用して、XYZ軸で調整された再構成された画像から連続した10層の関心領域を選択し、必要な関節を定量的に分析して骨体積分率(BV / TV)^{を決定します。}
5. 最後に、Liuら¹⁰に記載されているように、3次元医用画像処理ソフトウェアを使用して、マウスの足首関節の3次元CT画像処理を実行します。再建後、ASCJの骨棘の摩耗と形成を観察します。

6. 関節軟骨の切片染色

注:すべての染色ステップはドラフト内で行われ、手順中はマスクを着用します。

1. 顕微鏡ピンセットとハサミを使用して足首の標本の周りの余分な軟部組織を取り除き、次に、塩酸でpHを7.35〜7.45に調整して、44 gのNaOH、2パックのPBS、および400 gのEDTA-2Naで調製した10%EDTA脱灰溶液を含む遠心分離管に標本を入れ、さまざまなグループをマークします。
2. 次に、遠心管を脱灰用の振とう台(速度20rpmに設定)に置き、1日1回脱灰液を交換します。標本の脱灰を決定します。
3. 1ヶ月の脱灰後、検体をグラジエントアルコールで脱水し、清澄化のためにn-ブタノールを8時間使用します。最後に、透明化した標本を冠状の位置にあるパラフィンに浸して包埋します。
4. パラフィン試料を4°Cの冷蔵庫に入れ、後で使用する。切片化する前に、4°Cの冷蔵庫から試験片を取り出し、-20°Cの冷凍庫に約10分間入れて、完全な平面の切断を容易にします。
5. 標本をミクロトームに固定し、6μmの厚さで切片化します。同時に、顕微鏡を使用して、サンプルが予想されるレベルで切断されているかどうかを観察します-注射針が骨組織に簡単に浸透します。
6. あらかじめ打錠機の水温を40°Cに調整してください。次に、2〜3つの完全なパラフィン切片を連続して切断し、それらを錠剤機に移して完全に膨張させます。次に、スライドガラスでパラフィン切片を取り除き、水を切ります。最後に、スライドにグループと番号をマークします。

7. ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色

1. 切片を60°Cのインキュベーターに入れ、無傷のASCJ関節構造を顕微鏡で観察できるようにし、切片を40〜50分間焼きます。次に、識別しやすいようにI、II、III の番号が付けられたキシレン 3x で、切片をそれぞれ 15 分、15 分、10 分間脱ワックスします。
2. 脱ワックスした切片を100%エタノール2x(識別しやすいようにIおよびIIと番号を付け)、90%エタノール、および80%エタノールにそれぞれ3分間、3分間、3分間、5分間、および5分間置きます。次に、切片を二重蒸留水(ddH₂O)で5分間洗浄します。
3. ヘマトキシリンに1分間浸した後、切片をddH₂Oで無色になるまで洗浄する。切片を1%酸性エタノール分化溶液に30秒間浸漬し、ddH₂Oで1分間3回洗浄します。その後、切片を1%アンモニア溶液で1分間染色し、ddH₂Oでそれぞれ1分間3回洗浄します。
4. 次に、サンプルをエオシン染色液で1分間染色した後、95%エタノールと100%エタノールにそれぞれ1分間連続して入れます。最後に、切片をキシレンIVで1分間処理します。
5. 切片を風乾し、中性樹脂を一滴垂らしてスライド上の試料に貼り付け、カバースリップで覆います。次に、明視野で正立蛍光顕微鏡で5倍と20倍の画像を撮影します。

8. サフラニンO-fastグリーン染色

1. 選択した切片を60°Cのインキュベーターに入れ、切片を40〜50分間焼きます。次に、キシレンI、II、III.で切片をそれぞれ15分、15分、10分除去します。
2. 脱ワックスした切片を100%エタノールI、II、90%エタノール、80%エタノールにそれぞれ3分間、3分間、5分間、5分間入れます。次に、切片をddH₂Oで5分間洗浄します。
3. ヘマトキシリンに1分間浸した後、切片をddH₂Oで無色になるまで洗浄する。切片を1%酸性エタノール分化溶液に30秒間浸漬し、ddH₂Oで1分間3回洗浄します。次に、切片を1%アンモニア溶液で1分間染色し、ddH₂Oでそれぞれ1分間3回洗浄します。
4. 切片を0.05%ファストグリーンに2分間浸し、続いて切片を1%酢酸溶液に30秒間、0.1%サフラニンに5分間浸します。染色したサンプルを95%エタノールと100%エタノールに1分間ずつ入れます。
5. 最後に、切片をキシレンIVで1分間処理します。切片を風乾し、中性樹脂を一滴垂らしてスライド上の試料に貼り付け、カバースリップで覆います。次に、明視野で正立蛍光顕微鏡で5倍と20倍の画像を撮影します。

9. 免疫組織化学

1. 1日目:選択した切片を60°Cのインキュベーターに入れ、切片を40〜50分間焼き、キシレンI、II、IIIでそれぞれ15分、15分、10分間脱ワックスします。脱ワックスした切片を100%エタノールI、II、90%エタノール、80%エタノールにそれぞれ3分間、3分間、5分間、5分間入れます。次に、切片をddH₂Oで5分間洗浄し、組織化ペンを使用して標本の領域を丸で囲み、暗箱に入れます。
2. 抗原賦活化:0.25%トリプシン20〜50 μLを丸で囲んだ検体領域に滴下し、37°Cのインキュベーターで60分間インキュベートした後、PBSで検体をそれぞれ2分間3回洗浄します。3%H₂O₂を添加して内因性ペルオキシダーゼをブロックし、検体を暗所で室温で10分間インキュベートした後、PBSでそれぞれ2分間3回洗浄します。10%ヤギ血清を室温で20分間添加して血清ブロッキングを行い、その後、一次抗体(マウス抗マウスII型コラーゲン、1,000倍希釈)と4°Cで一晩インキュベートします。
3. 2日目:切片を室温で30分間再温めます。一次抗体を回収し、切片をPBSでそれぞれ2分間3回洗浄します。二次抗体と37°Cのインキュベーターで40分間インキュベートした後、切片をPBSでそれぞれ2分間3回洗浄します。
4. DAB発色:5mLの_ddH2O、2滴の緩衝液、4滴のDAB、および2滴のH2O2を加えて、DAB試薬を調製する。20〜50μLの試薬を切片に加え、サンプルを5分間光から保護した後、切片をddH 2 Oで₂分間洗浄します。
5. ヘマトキシリンに1分間浸した後、切片をddH₂Oで無色になるまで洗浄する。切片を1%酸性エタノール分化溶液に30秒間浸漬し、ddH 2 Oでそれぞれ1分間3回洗浄し、切片を1%アンモニア溶液で1分間染色し、次にddH₂Oでそれぞれ1分間3回洗浄します。
6. 次に、切片をそれぞれ95%エタノールと100%エタノールにそれぞれ1分間入れます。最後に、切片をキシレンIVで1分間インキュベートします。切片を風乾し、中性樹脂を一滴垂らしてスライド上の試料に貼り付け、カバースリップで覆います。次に、明視野で正立蛍光顕微鏡で5倍と20倍の画像を撮影します。

結果

相関データの統計分析は、オンライン統計分析ツールを使用して実行しました。正規分布と分散の均一性の2つの検定を満たしたデータは、一元配置分散分析によるさらなる統計分析に使用されました。データが2つの検定を満たさない場合、Kruskal-Wallis検定が統計分析に使用されました。データは標準偏差±平均値で表され、 p < 0.05 は統計的に有意であると見なされました。

ディスカッション

本研究では、CL+ATFLまたはCL+DLをトランセクトすることにより、ASCJ不安定性の2つのマウスモデルの構築に成功しました。マウスが平均台を通過する時間は、手術後8週間と12週間で有意に増加し、これは、足首関節の外側靭帯を切断することによってハバード・ターナーチームが得た結果と同様である^23,24。右足滑走試験では、靭帯を切断した2群のマ...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-0 Surgical Nylon Suture	Ningbo Medical Needle Co., Ltd.	191104
Acidic ethanol differentiation solution (1%)	Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.	R20778
Adhesive slides	Jiangsu Shitai Company
Ammonia solution (1%)	Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.	R20788
Anhydrous ethanol	Shanghai Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd.
Aqueous acetic acid (1%)	Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.	R20773
Black cube cassette	Shanghai Yizhe Instrument Co., Ltd.
Centrifuge tube 15ml	Beijing Soleibo Technology Co., Ltd.	YA0476
Centrifuge tube 50ml	Beijing Soleibo Technology Co., Ltd.	YA0472
Cover glass	Jiangsu Shitai Company
CTAn software	Blue scientific		micro-CT analysis software
Dataview software	AEMC instruments		commercial data analysing software
Disodium ethylenediaminetetraacetate (EDTA-2Na)	Beijing Soleibo Technology Co., Ltd.	E8490
Electric incubator	Suzhou Huamei Equipment Factory
Embedding paraffin	Leica, Germany	39001006
Eosin staining solution (alcohol soluble, 1%)	Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.	R30117
Fast green staining solution	Sigma-Aldrich, USA	F7275
Gait paper	Baoding Huarong Paper Factory
GraphPad Prism 8.0	Graphpad software		online statistical analysis tools
Iodophor cotton balls	Qingdao Hainuo Bioengineering Co., Ltd.
Leica 818 blade	Leica, Germany
Micro-CT	Skyscan, Belgium	SkyScan 1176
Micromanipulation microscope	Suzhou Omet Optoelectronics Co., Ltd.
Mimics software	Materialise		3D medical image processing software
Modified Harris Hematoxylin Stain	Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.	R20566
Mouse anti-mouse type II collagen	American Abcam Company
NaOH	Shanghai Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd.
N-butanol	Shanghai Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd.
Neutral formalin fixative (10%)	Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.
Neutral resin	Sigma-Aldrich, USA
Nrecon reconstrcution software	Micro Photonics Inc.
Oaks hair clipper	Oaks Group Co., Ltd.
Paraffin Embedding Machine	Leica, Germany
PH meter	Shanghai Leitz Company
Phosphate Buffered Saline (PBS)	American Biosharp
Physiological saline (for mammals, sterile)	Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.	R22172
Safranin O-staining solution	Sigma-Aldrich, USA	HT90432
Saline (0.9%)	Shanghai Baxter Medical Drug Co., Ltd.	309107
Shaker	Haimen Qilin Bell Instrument Manufacturing Co., Ltd.	2008779
SPSS 23	IBM		online statistical analysis tools
Tablet machine	Leica, Germany
Tissue slicer	Leica, Germany
Ugo Basile	Ugo Basile Biological Research Company
Upright fluorescence microscope	Zeiss Axiovert, Germany
U-shaped plastic channel	Shanghai Yizhe Instrument Co., Ltd.
Veterinary eye ointment	Pfizer
Xylene	Shanghai Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd.
YLS-10B Wheel Fatigue Tester	Jinan Yiyan Technology Development Co., Ltd.