Un modelo de ratón de inestabilidad articular del complejo tobillo-subastragalina

Resumen

La articulación del complejo tobillo-subastragalina (ASCJ) es el núcleo del pie y desempeña un papel clave en el control del equilibrio en las actividades diarias. Las lesiones deportivas a menudo conducen a la inestabilidad en esta articulación. Aquí, describimos un modelo de ratón de inestabilidad inducida por transección de ligamentos de la ASCJ.

Resumen

Los esguinces de tobillo son quizás las lesiones deportivas más comunes en la vida diaria, que a menudo resultan en inestabilidad de la articulación del complejo tobillo-subastragalina (ASCJ) y, finalmente, pueden conducir a la osteoartritis postraumática (PTOA) a largo plazo. Sin embargo, debido a la complejidad del mecanismo de lesión y a las manifestaciones clínicas, como equimosis, hematoma o dolor a la palpación en la parte lateral del pie, no existe consenso clínico sobre el diagnóstico y tratamiento de la inestabilidad de la ACJ. Dado que la estructura musculoesquelética de los huesos y ligamentos de la pata trasera del ratón es comparable a la de los humanos, se estableció un modelo animal de inestabilidad de la ASCJ en ratones mediante la transección de ligamentos alrededor de la ASCJ. El modelo fue bien validado a través de una serie de pruebas de comportamiento y análisis histológicos, incluyendo una prueba de barra de equilibrio, un análisis de la huella (una evaluación del nivel de ejercicio y la capacidad de equilibrio en ratones), una evaluación de la nocicepción térmica (una evaluación de la función sensorial del pie en ratones), una microtomografía computarizada (TC) y una tinción de sección del cartílago articular (una evaluación del daño y la degeneración del cartílago articular en ratones). El establecimiento exitoso de un modelo murino de inestabilidad de ASCJ proporcionará una referencia valiosa para la investigación clínica sobre el mecanismo de la lesión y dará como resultado mejores opciones de tratamiento para el esguince de tobillo.

Introducción

Los esguinces de tobillo son una de las lesiones deportivas más comunes en todo el mundo. Se estima que 10.000 personas se lesionan diariamente en los Estados Unidos¹, de las cuales las lesiones relacionadas con el deporte representan entre el 15% y el 45%². Los costos médicos asociados con el tratamiento de los esguinces de tobillo en los Estados Unidos ascienden a $4.2 mil millones anuales ^3,4,5. La inestabilidad crónica del pie es un problema común después de los esguinces de tobillo y ocurre en aproximadamente el 74% de los esguinces de tobillo⁶, incluida la inestabilidad del tobillo o subastragalina. Sin embargo, debido a los síntomas y signos clínicos similares, es difícil para el personal médico distinguir si la inestabilidad crónica del tobillo también se acompaña de inestabilidad crónica de la articulación subastragalina en la clínica y, como resultado, la inestabilidad subastragalina crónica puede pasarse por alto fácilmente. Por lo tanto, la incidencia real de inestabilidad crónica de la articulación del complejo tobillo-subastragalina (ASCJ) (un tipo específico de inestabilidad crónica del pie que incluye tanto la inestabilidad crónica del tobillo como la inestabilidad subastragalina crónica) puede ser mayor que la reportada ^7,8,9. Si no se trata, la inestabilidad crónica de la articulación del complejo tobillo-subastragalina puede causar esguinces de tobillo repetidos, lo que lleva a un círculo vicioso de esguinces de tobillo e inestabilidad crónica del complejo tobillo-subastragalina. La inestabilidad crónica a largo plazo del complejo tobillo-subastragalina puede conducir a la degeneración de la ATCC y a la artrosis postraumática, que puede afectar a las articulaciones adyacentes en casos graves¹⁰. Para estas enfermedades, el tratamiento clínico actual es principalmente conservador, además de los métodos de tratamiento quirúrgico como la reparación y reconstrucción de ligamentos^11,12.

ASCJ es la estructura central del pie y mantiene el equilibrio del cuerpo durante el movimiento¹³. Se han realizado extensas investigaciones sobre la estructura de la articulación del tobillo y la articulación subastragalina por separado^14,15,16,17. Sin embargo, la investigación sobre toda la articulación tobillo-subastragalina es escasa. Alrededor de una cuarta parte de los casos de lesión de tobillo están asociados con lesión de la articulación subastragalina¹⁸. Debido al complejo mecanismo de lesión de la inestabilidad de la ASCJ, no existe consenso sobre su diagnóstico y tratamiento en el ámbito clínico. Teniendo en cuenta la situación actual de las lesiones de tobillo en la clínica, se necesita un método más científico para estudiar el tobillo y la articulación subastragalina en su conjunto, proporcionando así una nueva comprensión para el estudio de las enfermedades del pie.

Dado que la estructura anatómica del retropié del ratón a nivel musculoesquelético es comparable a la del pie humano 19, en varios estudios ya se han implementado modelos de ratón para la investigación del pie/tobillo^10,19. Chang et ^al.19 desarrollaron con éxito tres modelos murinos diferentes de artrosis de tobillo. Inspirados por el exitoso establecimiento de la inestabilidad del tobillo en el modelo de ratón, establecimos un modelo de ratón para la inestabilidad del complejo tobillo-subastragalina, planteando la hipótesis de que la transección de los ligamentos parciales en el retropié del ratón daría lugar a la inestabilidad mecánica de la ASCJ, lo que conduciría a la osteoartritis postraumática (PTOA) de la ASCJ. El modelo animal de inestabilidad ASCJ podría utilizarse para el tratamiento tanto de la inestabilidad del tobillo como de la inestabilidad subastragalina, lo que está más en línea con la situación clínica real que el modelo de inestabilidad simple del tobillo utilizado actualmente 7,8,9,19. Para probar esta hipótesis, se diseñaron dos modelos murinos de inestabilidad inducida por transección ligamentosa de la ASCJ. Los resultados de la función sensorio-motora (la prueba de la barra de equilibrio, el análisis de la huella y la evaluación de la nocicepción térmica) se utilizaron para evaluar la viabilidad del modelo, y la microtomografía computarizada (TC) y la tinción histológica se utilizaron para evaluar el daño y la degeneración del cartílago articular del ratón. El establecimiento exitoso de un modelo de ratón de inestabilidad de ASCJ no solo proporciona una nueva comprensión para el estudio de las enfermedades del pie, sino que también proporciona una referencia valiosa para la investigación clínica sobre los mecanismos relacionados con las lesiones, proporciona mejores opciones de tratamiento para los esguinces de tobillo y es útil para futuros estudios sobre la enfermedad.

Protocolo

Todos los estudios en animales se realizaron de acuerdo con las Directrices para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Soochow.

1. Procedimientos quirúrgicos

1. Divida 21 ratones machos C57BL/6 de 6 semanas de edad en tres grupos: el ligamento cervical transverso y el grupo del ligamento talofibular anterior, el grupo del ligamento cervical transverso y el ligamento deltoideo, y el grupo de cirugía simulada. Asegúrese de que todos los ratones se hayan criado en un entorno que cumpla con los estándares específicos libres de patógenos (SPF).
2. Aclimatar a los ratones al nuevo entorno de cría (un ciclo de luz/oscuridad de 12 h/12 h, y una temperatura y humedad constantes de 18-22 °C y 40%-70%, respectivamente) durante 2 semanas antes del experimento. Someter a los ratones a un entrenamiento de barra de equilibrio y marcha, yendo de un extremo de una barra de equilibrio o tubo en forma de U al otro extremo sin parar, 1 semana antes del experimento.
3. A la edad de 8 semanas, anestesiar al ratón mediante la inhalación de isoflurano humedeciendo una bola de algodón con 2 ml de isoflurano y colocándola en un recipiente hermético para una volatilización completa. Controle la actividad del ratón y continúe inhalando hasta que la actividad del ratón se haya reducido significativamente. Determine la profundidad de la anestesia pellizcando los dedos de los pies de los ratones para observar sus reacciones. Inhalar isoflurano vaporizado (2%) a través de una mascarilla para mantener la anestesia en ratones durante las operaciones posteriores. Use ungüento veterinario para los ojos durante la anestesia para evitar que los ojos se sequen.
4. Después de anestesiar, retire el vello de la articulación del tobillo de las extremidades traseras derechas del ratón con una afeitadora y desinfecte la piel expuesta tres veces con rondas alternas de bolas de algodón de yodo y bolas de algodón con alcohol. Administrar 5 mg/kg de carprofeno por inyección subcutánea. Transfiera el ratón al quirófano de animales de microcirugía con una almohadilla quirúrgica estéril.
5. Para el grupo del ligamento cervical transverso y el ligamento talofibular anterior (CL + ATFL), realizar una incisión longitudinal oblicua hacia abajo de 7 mm con un bisturí sobre la piel por encima de la articulación del tobillo derecho y sondear con pinzas rectas microscópicas delante de la articulación del tobillo.
6. Asegurar la exposición del ATFL en el borde inferior del astrágalo y el peroné después de sondear y cortarlo suavemente con un bisturí. Separe los tendones largos y cortos del peroné y los tendones extensores largos de los dedos, exponga el CL y córtelo con un bisturí.
7. Para el grupo CL transverso + ligamento deltoides (DL), realizar una incisión vertical de 8 mm en la piel medial de la articulación del tobillo derecho y separar sin rodeos el DL del maléolo medial para finalmente cortarlo. A continuación, corte el CL como se describe en el paso 1.5.
8. Para el grupo simulado (grupo de cirugía simulada), realice una cirugía simulada en la articulación del tobillo derecho, pero no corte ningún ligamento.
9. Enjuague la incisión con solución salina normal estéril y suérela con hilo de nailon quirúrgico 5-0. Finalmente, desinfecte la incisión suturada con una bola de algodón de yodo.
10. Mantenga al ratón bajo observación hasta que pueda mantener la decúbito esternal, y supervise hasta que esté completamente consciente. Desinfectar la incisión del tobillo dos veces al día con un algodón de yodo y administrar carprofeno (5 mg/kg, inyección subcutánea), una vez al día durante 1 semana. Retroceda solo después de la operación y preste mucha atención al estado postoperatorio del mouse.
11. Dos semanas después de la cirugía y cuando la hinchazón de la articulación del tobillo se haya reducido, comience a ejercitar a los ratones en la máquina de fatiga rotativa para ratones durante 1 hora todos los días.

2. Prueba de la barra de equilibrio

1. Sujete una viga circular de madera de 1 m de longitud y 20 mm de diámetro, inclinada a 15° en un extremo, con un clip de trípode fotográfico, y coloque el otro extremo sobre una superficie de trabajo conectada a un casete cerrado.
2. Realice el entrenamiento con barra de equilibrio 1 semana antes de la cirugía para asegurarse de que los ratones se muevan suavemente de un extremo a otro de la viga. Considere que un ratón ha pasado la prueba cuando pasa a través del haz dos veces en 60 s sin detenerse.
3. Realice dos pruebas consecutivas para cada ratón y rocíe la barra de equilibrio con alcohol al 75% después de cada prueba para evitar que el olor residual del ratón anterior afecte al siguiente ratón.
4. Realice la prueba de la barra de equilibrio antes de la operación, 3 días, 1 semana, 4 semanas, 8 semanas y 12 semanas después de la cirugía. Registre el tiempo promedio de cada mouse que pasa por la barra de equilibrio dos veces seguidas y el número de veces que el retropié derecho se desliza fuera de la viga como variables dependientes.

3. Análisis de la huella

1. Coloque un canal de plástico en forma de U con una longitud de 50 cm, un ancho de 10 cm y una altura de 10 cm en la mesa experimental y conecte un extremo del canal de plástico a un casete cerrado.
2. Coloque un papel de pigmento liso plano en el canal y luego sostenga el mouse con ambas manos y pinte sus patas delanteras y traseras de manera uniforme con pigmento rojo y verde no tóxico.
3. Coloque el ratón pintado suavemente en un extremo del canal y deje que se mueva al otro extremo del casete. Saca el papel pigmentado con las huellas, márcalo y colócalo en una rejilla para que se seque en un lugar ventilado y sombreado.
4. Después de que haya pasado cada ratón, rocíe el canal de plástico en forma de U con alcohol al 75% para evitar que el olor residual del ratón anterior afecte al siguiente.
5. Seleccione tres huellas transparentes consecutivas del ratón en cada papel y utilice una regla para medir la longitud del paso de la huella del pie derecho del ratón, así como el ancho del paso entre las huellas izquierda y derecha.

4. Evaluación de la nocicepción térmica

1. Durante el experimento, utilice la prueba plantar para registrar el tiempo de reacción de la nocicepción térmica del pie del ratón y el tiempo de reacción del ratón durante la actividad y el descanso, respectivamente. Registre los datos de medición en segundos.
2. Coloque el mouse en el instrumento de medición, alinee el instrumento con su pie derecho y comience a calentar el instrumento con la temperatura aumentando lentamente. Observa la respuesta del ratón. Cuando la temperatura aumenta por encima de la tolerancia, el ratón se retirará o se lamerá rápidamente el pie derecho. Registre el tiempo utilizando el instrumento y defina el tiempo como el tiempo de reacción durante la actividad.
3. Para medir el tiempo de reacción en reposo, deje que el ratón se asiente durante 30 minutos en la mesa de descanso sin calentarse y, a continuación, obtenga los datos de tiempo como se explica en el paso 4.2. Utilice estos datos temporales adquiridos para su posterior análisis.

5. Micro-CT

1. Eutanasiar ratones de 12 semanas de edad con dióxido de carbono después de la operación, quitarles la piel del tobillo derecho y luego cortarles la tibia y el peroné medios con tijeras quirúrgicas para obtener muestras completas del tobillo. Coloque las muestras en tubos de centrífuga marcados de 15 ml que contengan un 10% de formalina neutra durante 48 h.
2. Después de la fijación, coloque las muestras en lotes (cuatro muestras por lote) en un tanque de esponja especial para la exploración por micro-TC. Configure los parámetros de la máquina de la siguiente manera: voltaje = 50 kV, corriente = 200 mA, filtro = 0,5 mmAl y resolución = 9 μm. Ejecute el escáner de microtomografía computarizada.
3. Después de escanear, utilice el software de reconstrucción para delinear el rango de la imagen y seleccione una posición de ángulo específica después de ajustar el eje XYZ de la imagen delineada utilizando un software comercial de análisis de datos, como se describe en Liu et ^al.10.
4. Utilice el software de análisis micro-CT para seleccionar regiones continuas de interés de 10 capas en las imágenes reestructuradas ajustadas por los ejes XYZ, y analice cuantitativamente las articulaciones requeridas para determinar la fracción de volumen óseo (BV/TV), como se describe en Liu et ^al.10.
5. Por último, utilice un software de procesamiento de imágenes médicas tridimensionales para realizar el procesamiento tridimensional de imágenes de TC de las articulaciones del tobillo del ratón, como se describe en Liu et ^al.10. Después de la reconstrucción, observe el desgaste y la formación de osteofitos en la ASCJ.

6. Tinción de secciones del cartílago articular

NOTA: Todos los pasos de tinción se realizan en una campana extractora y se usa una máscara durante el procedimiento.

1. Utilice pinzas y tijeras microscópicas para eliminar el exceso de tejido blando alrededor de las muestras de tobillo, y luego coloque las muestras en un tubo de centrífuga que contenga una solución de descalcificación de EDTA al 10% preparada con 44 g de NaOH, dos paquetes de PBS y 400 g de EDTA-2Na, con el pH ajustado a 7,35-7,45 con ácido clorhídrico, y marque los diferentes grupos.
2. A continuación, coloque el tubo de centrífuga en una mesa vibratoria (velocidad ajustada a 20 rpm) para la descalcificación y cambie la solución de descalcificación una vez al día. Determinar la descalcificación de los especímenes.
3. Después de 1 mes de descalcificación, deshidratar las muestras con alcohol de gradiente y luego usar n-butanol durante 8 h con fines de limpieza. Finalmente, sumerja las muestras aclaradas en parafina en una posición coronal para su inclusión.
4. Coloque las muestras de parafina en un refrigerador a 4 °C para su uso posterior. Antes de seccionar, saque las muestras del refrigerador a 4 °C y colóquelas en un congelador a -20 °C durante unos 10 minutos para facilitar el corte del plano completo.
5. Fijar las muestras en el micrótomo y seccionarlas con un grosor de 6 μm. Al mismo tiempo, use un microscopio para observar si las muestras se han cortado al nivel esperado: fácil penetración de una aguja de jeringa en el tejido óseo.
6. Ajuste la temperatura del agua de la máquina de tabletas a 40 °C con anticipación. A continuación, corte dos o tres secciones completas de parafina en una fila y transfiéralas a la máquina de tabletas para una expansión completa. Luego, retire las secciones de parafina con un portaobjetos de vidrio y escurra el agua. Por último, marca las diapositivas con grupos y números.

7. Tinción de hematoxilina y eosina (H&E)

1. Coloque las secciones en una incubadora a 60 °C de tal manera que se pueda observar la estructura intacta de la junta ASCJ bajo el microscopio y hornee las secciones durante 40-50 min. Luego, desparafina las secciones con xileno 3x, numeradas como I, II y III para una fácil identificación, durante 15 min, 15 min y 10 min, respectivamente.
2. Coloque las secciones desparafinadas en etanol al 100% 2x, numeradas como I y II para una fácil identificación, etanol al 90% y etanol al 80% durante 3 min, 3 min, 5 min y 5 min, respectivamente. A continuación, lave las secciones con agua bidestilada (ddH₂O) durante 5 min.
3. Después de remojar con hematoxilina durante 1 min, lavar las secciones con ddH₂O hasta que se vuelvan incoloras. Remojar las secciones en una solución de diferenciación de etanol ácido al 1% durante 30 s y lavarlas 3 veces durante 1 min con ddH₂O. Después de eso, tiñe las secciones con una solución de amoníaco al 1% durante 1 minuto y luego lava 3 veces durante 1 minuto cada una con ddH₂O.
4. A continuación, tiña las muestras con una solución de tinción de eosina durante 1 minuto y, a continuación, colócalas en etanol al 95% y etanol al 100% durante 1 minuto cada una de forma consecutiva. Finalmente, trate las secciones con xileno IV durante 1 min.
5. Seque al aire las secciones, pegue una gota de resina neutra sobre las muestras en los portaobjetos y cúbralas con un cubreobjetos. A continuación, tome imágenes con un microscopio de fluorescencia vertical en campo claro a 5x y 20x.

8. Tinción verde Safranina O-fast

1. Coloque las secciones seleccionadas en una incubadora a 60 °C y hornee las secciones durante 40-50 min. Luego, desparafina las secciones con xileno I, II y III durante 15 min, 15 min y 10 min, respectivamente.
2. Coloque las secciones desparafinadas en etanol al 100% I, II, etanol al 90% y etanol al 80% durante 3 min, 3 min, 5 min y 5 min, respectivamente. A continuación, lava las secciones con ddH₂O durante 5 min.
3. Después de remojar con hematoxilina durante 1 min, lavar las secciones con ddH₂O hasta que se vuelvan incoloras. Remojar las secciones en una solución de diferenciación de etanol ácido al 1% durante 30 s y lavarlas 3 veces durante 1 min con ddH₂O. A continuación, tiñe las secciones con una solución de amoníaco al 1% durante 1 minuto y lávalas 3 veces durante 1 minuto cada una con ddH₂O.
4. Remojar las secciones en verde rápido al 0,05 % durante 2 min, seguido de remojar las secciones en una solución de ácido acético al 1 % durante 30 s y en safranina al 0,1 % durante 5 min. Coloque las muestras teñidas en etanol al 95% y etanol al 100% durante 1 minuto, una tras otra.
5. Finalmente, trate las secciones con xileno IV durante 1 min. Seque al aire las secciones, pegue una gota de resina neutra sobre las muestras en los portaobjetos y cúbralas con un cubreobjetos. A continuación, tome imágenes con un microscopio de fluorescencia vertical en campo claro a 5x y 20x.

9. Inmunohistoquímica

1. Día 1: Coloque las secciones seleccionadas en una incubadora a 60 °C, hornee las secciones durante 40-50 minutos y luego desparafinarlas con xileno I, II y III durante 15 minutos, 15 minutos y 10 minutos, respectivamente. Coloque las secciones desparafinadas en etanol al 100% I, II, etanol al 90% y etanol al 80% durante 3 min, 3 min, 5 min y 5 min, respectivamente. Luego, lave las secciones con ddH₂O durante 5 min, use un bolígrafo histoquímico para rodear el área de la muestra y colóquelas en una caja oscura.
2. Recuperación de antígenos: Dejar caer 20-50 μL de tripsina al 0,25% en el área de la muestra encerrada en un círculo, incubar en una incubadora a 37 °C durante 60 minutos y luego lavar las muestras 3 veces durante 2 minutos cada una con PBS. Bloquee la peroxidasa endógena agregando 3% de H 2 O 2, incube las muestras durante 10 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad y luego lávelas 3 veces durante₂minutos cada una con PBS. Realizar el bloqueo sérico añadiendo un 10% de suero de cabra a temperatura ambiente durante 20 min, y luego incubar con el anticuerpo primario (colágeno anti-ratón tipo II, diluido 1.000 veces) a 4 °C durante la noche.
3. Día 2: Vuelva a calentar las secciones a temperatura ambiente durante 30 min. Recupere el anticuerpo primario y lave las secciones 3 veces durante 2 minutos cada una con PBS. Incubar con el anticuerpo secundario durante 40 min en una incubadora a 37 °C, y luego lavar las secciones 3 veces durante 2 min cada una con PBS.
4. Desarrollo del color DAB: Agregue 5 ml de ddH 2 O, dos gotas de tampón, cuatro gotas de DAB y dos gotas de H 2O₂para preparar el reactivo DAB. Añadir 20-50 μL de reactivo a las secciones, mantener las muestras protegidas de la luz durante 5 min, y luego lavar las secciones durante 2 min con ddH₂O.
5. Después de remojar con hematoxilina durante 1 min, lavar las secciones con ddH₂O hasta que se vuelvan incoloras. Remoje las secciones en una solución de diferenciación de etanol ácido al 1% durante 30 s y lávelas 3 veces durante 1 minuto cada una con ddH 2 O. Tiña las secciones durante 1 minuto con una solución de amoníaco al 1% y luego lávelas 3 veces durante 1 minuto cada una con ddH₂O.
6. A continuación, coloque las secciones en etanol al 95% y etanol al 100%, respectivamente, durante 1 minuto cada una. Finalmente, incubar las secciones durante 1 min con xileno IV. Seque al aire las secciones, pegue una gota de resina neutra sobre las muestras en los portaobjetos y cúbralas con un cubreobjetos. A continuación, tome imágenes con un microscopio de fluorescencia vertical en campo claro a 5x y 20x.

Resultados

El análisis estadístico de los datos de correlación se realizó utilizando herramientas de análisis estadístico en línea. Los datos que cumplieron con las dos pruebas de distribución normal y homogeneidad de varianza se utilizaron para un análisis estadístico posterior mediante análisis de varianza de una vía. Si los datos no cumplían con las dos pruebas, se utilizó la prueba de Kruskal-Wallis para el análisis estadístico. Los datos se expresan como media ± desviación estándar (DE), y p < 0,05 ...

Discusión

En este estudio, se construyeron con éxito dos modelos de ratón de inestabilidad ASCJ mediante transección de CL + ATFL o CL + DL. El tiempo de los ratones para pasar a través de la barra de equilibrio aumentó significativamente a las 8 semanas y a las 12 semanas después de la cirugía, lo que es similar a los resultados obtenidos por el equipo de Hubbard-Turner al cortar el ligamento lateral de la articulación del tobillo^23,24. En la prueba de deslizamien...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-0 Surgical Nylon Suture	Ningbo Medical Needle Co., Ltd.	191104
Acidic ethanol differentiation solution (1%)	Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.	R20778
Adhesive slides	Jiangsu Shitai Company
Ammonia solution (1%)	Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.	R20788
Anhydrous ethanol	Shanghai Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd.
Aqueous acetic acid (1%)	Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.	R20773
Black cube cassette	Shanghai Yizhe Instrument Co., Ltd.
Centrifuge tube 15ml	Beijing Soleibo Technology Co., Ltd.	YA0476
Centrifuge tube 50ml	Beijing Soleibo Technology Co., Ltd.	YA0472
Cover glass	Jiangsu Shitai Company
CTAn software	Blue scientific		micro-CT analysis software
Dataview software	AEMC instruments		commercial data analysing software
Disodium ethylenediaminetetraacetate (EDTA-2Na)	Beijing Soleibo Technology Co., Ltd.	E8490
Electric incubator	Suzhou Huamei Equipment Factory
Embedding paraffin	Leica, Germany	39001006
Eosin staining solution (alcohol soluble, 1%)	Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.	R30117
Fast green staining solution	Sigma-Aldrich, USA	F7275
Gait paper	Baoding Huarong Paper Factory
GraphPad Prism 8.0	Graphpad software		online statistical analysis tools
Iodophor cotton balls	Qingdao Hainuo Bioengineering Co., Ltd.
Leica 818 blade	Leica, Germany
Micro-CT	Skyscan, Belgium	SkyScan 1176
Micromanipulation microscope	Suzhou Omet Optoelectronics Co., Ltd.
Mimics software	Materialise		3D medical image processing software
Modified Harris Hematoxylin Stain	Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.	R20566
Mouse anti-mouse type II collagen	American Abcam Company
NaOH	Shanghai Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd.
N-butanol	Shanghai Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd.
Neutral formalin fixative (10%)	Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.
Neutral resin	Sigma-Aldrich, USA
Nrecon reconstrcution software	Micro Photonics Inc.
Oaks hair clipper	Oaks Group Co., Ltd.
Paraffin Embedding Machine	Leica, Germany
PH meter	Shanghai Leitz Company
Phosphate Buffered Saline (PBS)	American Biosharp
Physiological saline (for mammals, sterile)	Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.	R22172
Safranin O-staining solution	Sigma-Aldrich, USA	HT90432
Saline (0.9%)	Shanghai Baxter Medical Drug Co., Ltd.	309107
Shaker	Haimen Qilin Bell Instrument Manufacturing Co., Ltd.	2008779
SPSS 23	IBM		online statistical analysis tools
Tablet machine	Leica, Germany
Tissue slicer	Leica, Germany
Ugo Basile	Ugo Basile Biological Research Company
Upright fluorescence microscope	Zeiss Axiovert, Germany
U-shaped plastic channel	Shanghai Yizhe Instrument Co., Ltd.
Veterinary eye ointment	Pfizer
Xylene	Shanghai Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd.
YLS-10B Wheel Fatigue Tester	Jinan Yiyan Technology Development Co., Ltd.