JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

في هذه الورقة ، يتم تقديم طرق السمية البيئية الموحدة لتقييم المؤشرات الحيوية في أنواع الأنوران الاستوائية الجديدة. على وجه التحديد ، توضح هذه الورقة بالتفصيل العديد من المنهجيات على نطاقات مختلفة من تقييم السموم البيئية ، مثل المستويات الجينية والخلوية النسيجية والكيميائية الحيوية والمورفولوجية والفردية.

Abstract

تسلط الأسئلة الجديدة في علم السموم البيئية الضوء على أهمية تطبيق مجموعة من المؤشرات الحيوية ، حيث ينتج عن ذلك تنبؤات السمية البيئية التي لا تحسن تفسير تأثيرات الضغوطات البيئية على الكائنات الحية فحسب ، بل تعمل أيضا على تحديد تأثيرها المحتمل. من المعروف أن استخدام المؤشرات الحيوية السمية البيئية على مستويات مختلفة من التنظيم يسمح بالتنبؤ بالاستجابات البيولوجية للكائنات الحية للضغوط البيئية ، وهو أمر مفيد في تقييم المخاطر البيئية.

ومع ذلك ، من الضروري النظر في تحسين الإجراءات الأساسية ، وتوليد بيانات تاريخية في مجموعات التحكم ، واستخدام فحوصات حيوية محددة لتقييم الاستجابات في الأعضاء والأنسجة من أجل توضيح طبيعة وتباين التأثيرات التي لوحظت. لذلك ، يهدف العمل الحالي إلى وصف العديد من منهجيات السمية البيئية المستخدمة في جميع مراحل الأنوران المدارية الجديدة على مستويات بيئية مختلفة والتحقق من صحتها كمؤشرات حيوية مفيدة لاستخدامها في كل من الحياة البرية وفي ظروف المختبر. في هذا العمل ، تم تطبيق هذه المؤشرات الحيوية على المستوى الفردي / الكائني (مؤشر حالة الجسم) ، والمستوى النسيجي / الفسيولوجي (التحليل النسيجي المرضي ، والقياسات النسيجية ، والتصبغية) ، والمستوى الكيميائي الحيوي (إنزيمات الإجهاد التأكسدي) ، والمستوى الجيني (الضرر المباشر والتأكسدي في الحمض النووي عن طريق فحص المذنب).

على الرغم من أن هذه المنهجيات لها اختلافات أو تعديلات صغيرة اعتمادا على الأنواع ، إلا أن هذه التقنيات توفر مؤشرات حيوية فعالة لتقييم تأثير الكائنات الغريبة الحيوية على الأنوران ، والتي تمتلك خصائص معينة تجعلها أنواعا مؤشرا مفيدة للنظم الإيكولوجية المائية والبرية. في الختام ، أثبتت مجموعة المؤشرات الحيوية المستخدمة في هذه الدراسة أنها كافية لتقدير الاستجابات السامة في الأنوران المدارية الجديدة ويمكن التوصية بها أيضا كمؤشرات حيوية لتحديد تأثير الملوثات على النظم الإيكولوجية المائية في المنطقة. أخيرا ، يوصى بتحقيق توحيد هذه المؤشرات الحيوية المهمة للأنوران في مناطق محددة وكذلك إمكانية إدراجها في تقييمات المخاطر وصنع القرار.

Introduction

يمكن أن تؤثر مدخلات الضغوطات البيئية في المسطحات المائية الطبيعية على صحة النظام البيئي المائي1. يمكن أن يؤثر التعرض لهذه الضغوطات البيئية على بقاء الكائنات المائية أو لياقتها من خلال آليات سمية مختلفة ، بما في ذلك التعرض المباشر (قصير الأجل وطويل الأجل)2. ومن ثم ، فإن المقايسات الحيوية المختبرية الموحدة لتقييم نقاط النهاية السمية المتعلقة باللياقة البدنية والبقاء على قيد الحياة قد تكون تقديرا غير موثوق به للعديد من الآثار غير المباشرة للإجهاد في هذا المجال. علاوة على ذلك ، قد تكون التغيرات في المستويات الفسيولوجية الطبيعية والتأثيرات على الأفراد ، مثل التقاط الفريسة ، مؤشرات أفضل على المدى الطويل للتأثير على البقاء واللياقة الإنجابية في الكائنات الحية ، وفي النهاية ، على صحة النظام البيئي1،3. يعد التنبؤ بالتغيرات في تكوين النظام الإيكولوجي ووظيفته ، وكذلك صحة الكائنات الحية ، بناء على مجموعة معروفة من المعلمات البيئية وتركيزات الملوثات ، أمرا مهما لتحسين إدارةالتلوث 1.

تعرف المؤشرات الحيوية بأنها تغيرات كيميائية حيوية أو فسيولوجية أو نسيجية بسبب التعرض للمواد الكيميائية الغريبة الحيوية أو تأثيراتها4،5. أثبتت المؤشرات الحيوية أنها مفيدة جدا كإشارات إنذار مبكر4،5. السؤال المهم الذي تساعد المؤشرات الحيوية في الإجابة عليه هو ما إذا كانت بعض الضغوطات موجودة بتركيزات عالية بما يكفي في البيئة لإحداث آثار ضارة. تساهم هذه المعلومات في تقييم ما إذا كان من المفيد التحقيق في طبيعة ومدى الضرر والعوامل المسببة أو ما إذا كان ينبغي عدم استثمار المزيد من الموارد في هذه الحالة6 ، 7 ، 8. علاوة على ذلك ، نظرا لأن مفهوم تقييم مؤشر حيوي واحد كمؤشر حيوي قد لا يكون كافيا5 ، 7 ، 8 ، 9 ، 10 ، فهناك اتجاه متزايد نحو إجراء تقييم شامل للمؤشرات الحيوية المتعددة من أجل الكشف عن علامات الإنذار المبكر ، وبالتالي منع الآثار التي لا رجعة فيها على النظم الإيكولوجية.

من المهم جدا ملاحظة أن جميع التأثيرات السامة تبدأ بتفاعل الضغوطات مع الجزيئات الحيوية. بهذا المعنى ، يمكن أن تتدفق التأثيرات من خلال مستويات التنظيم الكيميائية الحيوية ، وتحت الخلوية ، والخلوية ، والأنسجة ، والعضو ، والفرد ، والسكان ، والمجتمع ، والنظام البيئي ، والمناظر الطبيعية ، والبيئات الحيوية للتنظيم. الخلايا هي الموقع الأساسي للتفاعل بين الضغوطات البيئية والأنظمة البيولوجية. وبالتالي ، فإن فهم التأثيرات الجزيئية والوراثية يسمح للباحثين بربط المستويات المنخفضة والعالية من التنظيم البيئي ويساعدهم على التنبؤ بتأثير الملوثات البيئية ، على سبيل المثال ، على صحة الإنسان ، التي لم يتم اختبارهابعد 5. علاوة على ذلك ، نظرا للخصوصية العالية للخلايا ، فهي ليست مفيدة فقط لتقييم الملوثات البيئية ولكن أيضا لصحة الإنسان5،11. لذلك ، فإن فهم تأثيرات الضغوطات على المستوى الكيميائي الحيوي قد يوفر نظرة ثاقبة لأسباب التأثيرات الملحوظة ويسمح لها بالارتباط بتلك الموجودة في المستوى الأعلىالتالي 5. بالإضافة إلى ذلك ، من خلال فهم الآليات الكيميائية الحيوية للضغوطات ، يمكن التنبؤ بتأثيرات الضغوطات الجديدة التي لم يتم تقييمها بعد من الناحية السمية فيما يتعلق بالملوثات الأخرى المعروفة بناء على أوجه التشابه بينها في الوظيفة. في وجود ضغوطات بيئية مختلفة ، قد توفر المؤشرات الحيوية الجينية والكيميائية الحيوية معلومات قيمة عن التأثيرات المحددة التي لوحظت. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن توفر التقييمات الكيميائية النسيجية المتعلقة بالتغيرات الكيميائية الحيوية معلومات عن الديناميكا السمية5. باختصار ، من الضروري إجراء تحليل شامل للمؤشرات الحيوية الخلوية والكيميائية الحيوية والنسيجية10،12 ، وهذا النوع من التحليل ، بدوره ، يجب تضمينه في برامج المراقبة الحيوية للأنواع المحلية5،13،14.

ومع ذلك، قد تطرح دراسة المؤشرات الحيوية في ظل ظروف المختبر بعض الصعوبات، بما في ذلك الصعوبات في الكشف عن الآثار شبه المميتة والتأثيرات المزمنة بعد التعرض للملوثات وفي التحقق من صحة الأساليب المستخدمة وتوحيدها، فضلا عن الاستجابات المعقدة المعتمدة على الوقت أو الجرعة، والروابط غير الواضحة أو غير المحددة باللياقة، والافتقار إلى النماذج الميكانيكيةالمتكاملة. 4. لحل هذه المشكلات ، لا يكمن الحل في زيادة عدد المؤشرات الحيوية المقاسة ولكن تصميم الدراسات والفرضيات القابلة للاختبار بعناية والتي تساهم في شرح الأسس الميكانيكية للتأثيرات الكيميائية على الكائنات الحيةبأكملها 4.

تسلط الأسئلة الجديدة في علم السموم البيئية الضوء على أهمية تطبيق مجموعة من المؤشرات الحيوية لتوليد تنبؤات السمية البيئية التي تعمل على تحسين تفسير تأثيرات الضغوطات البيئية على الكائنات الحية ، فضلا عن اتخاذ القرارات بشأن تأثيرها المحتمل. علاوة على ذلك ، فإن أهمية الجمع بين كل من المفاهيم - المؤشرات الحيوية والمؤشرات الحيوية - في تقييمات المخاطر البيئية والمراقبة البيولوجية هي أن هذا سيسمح للباحثين بتحديد ما إذا كانت الكائنات الحية في بيئة معينة ذات أهمية طبيعية من الناحية الفسيولوجية أو مجهدة. يشبه النهج المتبع في هذه الدراسة نهج التحليل الكيميائي الحيوي الذي يتم إجراؤه على البشر. بهذا المعنى ، يمكن تحليل بطارية من المؤشرات الحيوية لمعرفة ما إذا كان الكائن الحي يتمتع بصحة جيدة في كل من الحقل وفي المختبر6. أخيرا ، ستساهم المؤشرات الحيوية في تقييمات المخاطر البيئية بطريقتين: (1) تقييم التعرض للأنواع النادرة و / أو طويلة العمر ، و (2) اختبار الفرضيات حول آليات التأثيرات الكيميائية على مستويات مختلفة من التنظيم البيولوجي4.

في العقد الماضي ، تم استخدام المؤشرات الحيوية في الأنوران للمراقبة البيولوجية للتعرض للملوثات السامة للخلايا والسامة للجينات. من بين هذه التقنيات ، التقنيات التي تم استخدامها بشكل متكرر هي مقايسة النواة الدقيقة (MN) ومقايسة المذنب أو تحريض فواصل الحمض النووي أحادي الشريطة عن طريق اختبار الرحلان الكهربائي للهلام أحادي الخلية (SCGE). بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام هذه التقنيات بنجاح لتقدير تلف الحمض النووي الناجم عن الضغوطات البيئية المختلفة في العديد من الأنوران الاستوائيةالجديدة 14،15،16،17،18،19. يمكن استخدام المؤشرات الحيوية الأخرى لفحص التغيرات في حالة التأكسد في الكائنات الحية المعرضة للملوثاتالبيئية 16،17،18،19. الإجهاد التأكسدي هو استجابة للتعرض لأنواع مختلفة من الكائنات الغريبة ، مما يؤدي إلى العديد من الآثار الضارة ، بما في ذلك القدرة المضادة للأكسدة للأفراد المعرضين5،6،7،19،20.

في دراسات السمية البيئية ، يتم استخدام أنواع المؤشرات الحيوية لأنها كائنات تحدد التفاعلات طويلة المدى والآثار الضارة للضغوطات البيئية على المستويات التنظيمية الأعلى (على سبيل المثال ، الكائن الحي والسكان والمجتمع ومستويات النظام البيئي) 10،20،21. من خلال دمج المفهومين - المؤشرات الحيوية والمؤشرات الحيوية - يمكن فحص الأنواع لتحديد الهياكل أو العمليات الكيميائية الحيوية أو الفسيولوجية أو البيئية التي ترتبط أو ترتبط بالتأثيرات البيولوجية المقاسة على مستوى واحد أو أكثر من مستويات التنظيم البيولوجي. أخيرا ، يتعلق التحدي الكبير المتمثل في استخدام كلا المفهومين لتحسين تقديرات سمية الإجهاد بتحليل المؤشرات الحيوية والمؤشرات الحيوية التي لها فائدة عالية في تقييم المخاطر البيئية20. وبهذا المعنى، هناك توافق في الآراء على أهمية استخدام المؤشرات الحيوية والمؤشرات الحيوية كعلامات إنذار مبكر، لأنها توفر معلومات ذات صلة باستجابة كائن اختبار للضغوطات البيئية12،20،21.

البرمائيات هي واحدة من أكثر مجموعات الكائنات الحية المهددة وسريعة التدهور في جميع أنحاء العالم. أحد الأسباب الرئيسية لهذا الانخفاض هو الملوثات التي تدخل بيئتها ، مثل المبيدات الحشرية والمعادن والملوثات الناشئة22،23،24،25. تتمتع Anurans بالعديد من الخصائص التي تجعلها مفيدة كأنواع مؤشرات حيوية ، مثل جلدها المنفذ ، وعلاقتها الوثيقة بالماء ، والحساسية للتلوث البيئي2،23،24. هذه الخصائص تجعل البرمائيات مؤشرات حيوية فعالة للصحةالبيئية 7،8،22،23،24،26.

ومع ذلك ، من الضروري ليس فقط النظر في تحسين الإجراءات الأساسية وتوليد البيانات التاريخية في مجموعات التحكم ولكن أيضا لاستخدام فحوصات حيوية محددة لتقييم الاستجابات في الأعضاء والأنسجة لتوضيح طبيعة وتباين التأثيرات التي لوحظت في المؤشرات الحيوية. بهذا المعنى ، يهدف العمل الحالي إلى وصف العديد من منهجيات السموم البيئية التي سيتم استخدامها في جميع مراحل الأنوران الاستوائية الجديدة على مستويات بيئية مختلفة والتحقق من صحتها كمؤشرات حيوية مفيدة لاستخدامها في كل من الحياة البرية وظروف المختبر. يقدم هذا العمل مجموعة من المؤشرات الحيوية التي يمكن دمجها والتي تم إثباتها للمراقبة البيولوجية للمختبرات والحياة البرية في الأنوران المعرضين للضغوط البيئية.

Protocol

تشمل التقنيات التالية التضحية السابقة بالحيوان ، والتي تم تنفيذها وفقا للمعايير الأخلاقية الدولية46 ، 47 ، 48 ، وتشريح الأعضاء واستئصالها لاحقا. تم القبض على بموجب ترخيص من وزارة البيئة والزراعة والإنتاج في مقاطعة سان لويس (القرار 49-PMA2019). تمت الموافقة على طرق التضحية والقتل الرحيم للحيوانات على النحو الواجب من خلال بروتوكولات اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامها (CICUA ، البروتوكول Q-322/19) من جامعة سان لويس الوطنية. تم تنفيذ الإجراءات مع الكائنات الحية الأنوران وفقا للمبادئ التوجيهية المفصلة في Garber et al.46 و CONICET47 و INTA48. بالإضافة إلى ذلك ، فإن جميع البروتوكولات المعروضة هنا مخصصة لأنواع الأنوران الاستوائية الجديدة في مراحل حياتها اليرقاتية والبالغة. لقد تم قبولها بالفعل على نطاق واسع من قبل الباحثين المحليين ويتم تنفيذها بموجب بروتوكول صارم وبإذن من "اللجنة الدولية لمعهد Cuidado y Uso de Animales (CICUA)" لكل جامعة معنية. يتم عرض قائمة بالمواد والحلول المستخدمة في جدول المواد والجدول 1.

1. المستوى الفردي: حالة الجسم ومؤشرات الكبد والغدد التناسلية

  1. مؤشر حالة الجسم: مؤشر الكتلة المتدرج
    ملاحظة: يمكن استخدام هذا المؤشر مع كل من البالغين ومع الأحداث واليرقات. تستند هذه المنهجية إلى Peig and Green27 ، مع تعديلات طفيفة للأنوران وفقا ل Brodeur et al.28،30و MacCracken and Stebbings29.
    1. سجل كتلة جسم كل عينة باستخدام مقياس تحليلي دقيق.
    2. ضع كل عينة على ورقة ملليمترية ، والتقط صورة على مسافة ~ 15 سم.
      ملاحظة: من المهم دائما التقاط الصور الفوتوغرافية من نفس المسافة.
    3. تحليل الصور:
      ملاحظة: يمكن تحليل الصور باستخدام برنامج ImageJ ، المتاح مجانا عبر الإنترنت (https://imagej.nih.gov/ij/index.html) ، أو باستخدام أي برنامج آخر لتحليل الصور يسمح بإجراء القياسات من مقياس مدرج في الصورة.
      1. قم بقياس طول فتحة الأنف (SVL) لكل عينة باستخدام أداة القياس من برنامج ImageJ ، وقم أولا بالرجوع إلى مقياس معروف في ورقة المليمتر.
        ملاحظة: في الضفادع الصغيرة ، يجب أن يكون قياس طول الجسم حتى الأنبوب المذرق ، بغض النظر عن الزعنفة الذيلية.
    4. مؤشر الكتلة المتدرج (S)
      1. باستخدام البيانات التي تم الحصول عليها من كتلة الجسم و SVL لكل أنوران ، قم ببناء خط انحدار دالة الطاقة غير الخطية لكتلة الجسم (المحور y) مقابل SVL (المحور x).
      2. احسب متوسط الطول باستخدام بيانات SVL لجميع الأفراد المقاسين من السكان المدروسين.
      3. أخيرا ، احسب مؤشر الكتلة المقاس (S) وفقا ل Peig and Green27 و Brodeur et al.28 باستخدام المعادلة (1):
        S = Mi (L0 / Li) b (1)
        حيث Mi و Li هي كتلة الجسم و SVL من الفرد i ، على التوالي ؛ ب هو أس القياس المقدر بانحدار دالة القدرة غير الخطية28 ؛ L0 هو متوسط الطول للسكان المدروسين. و S هي كتلة الجسم المتوقعة للفرد i عندما يتم توحيد SVL الخاص به بقيمة L0 .
        ملاحظة: من المهم ملاحظة أن b هو ثابت خاص بالأنواع يمكن أن يكون أيضا خاصا بالجنس في الأنواع ثنائية الشكل جنسيا.
  2. مؤشر الكبد الجسمي: مؤشر الكبد المتدرج
    ملاحظة: بالنسبة لمؤشر حالة الجسم ، يمكن استخدام هذا المؤشر مع الأفراد في جميع مراحل التطور. وتستند المنهجية إلى Brodeur et al.28.
    1. سجل SVL لكل عينة وفقا للخطوة 1.1.2 والخطوة 1.1.3.
    2. القتل الرحيم للأفراد وفقا للمعايير الأخلاقية لبرمائيات أنوران46،47،48.
    3. إزالة الكبد بأكمله, وتسجيل كتلته على مقياس تحليلي دقيق لأقرب مليغرام.
    4. باستخدام البيانات التي تم الحصول عليها من كتلة الكبد و SVL لكل أنوران ، قم ببناء خط انحدار دالة طاقة غير خطية لكتلة الكبد (المحور y) مقابل SVL (المحور x).
    5. احسب متوسط الطول باستخدام بيانات SVL لجميع الأفراد المقاسين من السكان المدروسين.
    6. احسب مؤشر الكبد المقاس (SLI) وفقا ل Brodeur et al.28 باستخدام المعادلة (2):
      SLI = Lmi (L0 / Li) b (2)
      حيث Lmi و Li هي كتلة الكبد و SVL من الفرد i ، على التوالي ؛ ب هو أس القياس المقدر بانحدار دالة القدرة غير الخطية28 ؛ L0 هو متوسط الطول للسكان المدروسين. و SLI هي كتلة الكبد المتوقعة للفرد i عندما يتم توحيد SVL الخاص به إلى L0.
  3. مؤشر الغدد التناسلية: مؤشر الغدد التناسلية المتدرج
    ملاحظة: تستند هذه المنهجية إلى Brodeur et al.30 وهي مفيدة فقط مع الأفراد البالغين. من المهم ملاحظة أنه يجب تحليل مؤشرات الذكور والإناث بشكل منفصل لأنها تختلف على مقاييس متميزة.
    1. سجل SVL لكل عينة وفقا للخطوة 1.1.2 والخطوة 1.1.3.
    2. القتل الرحيم للأفراد وفقا للمعايير الأخلاقية لبرمائيات أنوران46،47،48.
    3. قم بإزالة الغدد التناسلية اليمنى واليسرى ، وسجل الكتلة على مقياس تحليلي دقيق لأقرب مليغرام.
    4. باستخدام البيانات التي تم الحصول عليها من كتلة الغدد التناسلية و SVL لكل أنوران ، قم ببناء خط انحدار دالة طاقة غير خطية لكتلة الغدد التناسلية (المحور y) مقابل SVL (المحور x) ، على غرار الخطوة 1.1.4.1 والخطوة 1.2.3.
    5. احسب متوسط الطول باستخدام بيانات SVL لجميع الأفراد المقاسين من السكان المدروسين.
    6. تقدير مؤشر الغدد التناسلية المقاس (SGI) وفقا ل Brodeur et al.30 لكل باستخدام المعادلة (3):
      SGI = GMi (L0 / Li) b (3)
      حيث Gmi و Li هي كتلة الغدد التناسلية و SVL من الفرد i ، على التوالي ، b هو أس القياس المقدر بانحدار دالة الطاقة غير الخطية بواسطة Brodeur et al.30 ، L0 هو متوسط الطول للسكان المدروسين ، و SGI هي كتلة الغدد التناسلية المتوقعة للفرد i عندما يتم توحيد SVL الخاص به إلى L0.

2. المستوى الشكلية النسيجي

ملاحظة: في هذا التحليل ، من الضروري استخدام الأقسام النسيجية. الخطوة الأولى هي جمع الأنسجة.

  1. التثبيت والجفاف
    1. استخدم حلا مثبتا للحفاظ على الهياكل. بالنسبة لأنسجة الأنوران ، يفضل استخدام محلول ميثاكارن أو بوين ، الموصى به على بقية محاليل التثبيت (الجدول 1).
      ملاحظة: يجب خلط جميع المواد في وقت الاستخدام.
    2. ضع الضفادع الصغيرة أو جزء من الأنسجة من 50-100 مجم في أنبوب مخروطي الشكل مع 1-2 مل من محلول التثبيت عند 4 درجات مئوية لمدة 3 ساعات. اغسل المنديل بنفس الحجم 70٪ من الكحول الإيثيلي لمدة 30 دقيقة.
    3. ضع الأنسجة في محلول كحول إيثيلي طازج بنسبة 70٪.
      ملاحظة: من الممكن إيقاف الإجراء في هذه المرحلة لبضعة أيام قبل الاستمرار في الجفاف.
    4. تجفيف الأنسجة في سلسلة من محاليل الكحول: الكحول الإيثيلي 80٪ (10 دقائق) ، الكحول 90٪ (10 دقائق) ، الكحول الإيثيلي 100٪ (10 دقائق) ، والكحول الإيثيلي 100٪ (10 دقائق).
    5. قم بإجراء التصفية (المقاصة) 2 × 10 دقائق في الزيلين.
    6. تذوب البارافين في دورق نقع المنديل لمدة 10 دقائق. قم بإزالة الأنسجة ، وضعها في قالب نسيجي مع البارافين المذاب. انتظر حتى يتصلب في درجة حرارة الغرفة.
    7. ضع أقساما بحجم 3 ميكرومتر مصنوعة على ميكروتوم دوار على شريحة زجاجية.
  2. التحليل النسيجي
    1. تلطيخ أقسام الأنسجة في الهيماتوكسيلين يوزين31.
    2. استخدم 10-20 صورة مجهرية للقياس بهدف 100x في المجهر الضوئي. تحليل 5-10 خلايا كبدية في كل صورة مجهرية.
      ملاحظة: هنا ، تم استخدام الكبد كنموذج لوصف هذه التقنية. من الممكن استخدام الأنسجة الأخرى. تأكد من أن الهدف من المجهر الضوئي المراد استخدامه مناسب لنوع الأنسجة. من الضروري أن تكون قادرا على رؤية وتحديد الخلايا المراد قياسها.
  3. علم الأنسجة المرضية
    1. بعد تلطيخ أقسام الأنسجة في الهيماتوكسيلين يوزين32 ، افحص 5-10 أقسام نسيجية تحت أهداف 10x و 20x و 40x و 100x.
    2. ابحث عن تغيرات الأنسجة وقم بتقدير درجة تغيرات الأنسجة (DTC) كما هو موضح من قبل بيرنت وآخرون 32 باستخدام المعادلة (4):
      DTC = Σalt. (أ × واط)    (4)
      حيث Σalt هو مجموع التغيير. يمثل أ مرحلة الضرر (0 ، غائب ؛ 1 ، منخفض ؛ 2 ، معتدل ؛ 3 ، مرتفع) ؛ و w يمثل درجة انعكاس الضرر (1 ، قابل للعكس ؛ 2 ، قابل للعكس جزئيا ؛ 3 ، لا رجعة فيه).
      ملاحظة: هنا ، تم استخدام الكبد كنموذج لوصف هذه التقنية. من الممكن استخدام الأنسجة الأخرى. تأكد من أن الهدف من المجهر الضوئي المراد استخدامه مناسب لنوع الأنسجة.
  4. نظام الصباغ
    1. بعد تلطيخ الشرائح في الهيماتوكسيلين يوزين ، افحص 10-20 صورة مجهرية بهدف 20x.
    2. حدد المساحة التي يشغلها الميلانين عن طريق قياس الاختلافات في شدة التلوين باستخدام برنامج Image Pro-Plus وفقا ل Santos et al.33.
    3. افتح البرنامج Image Pro Plus 6.0®.
    4. حدد القائمة وشريط الأدوات: بيولوجي.
    5. حدد المعايرة المكانية للتكبير المستخدمة لالتقاط الصور المجهرية.
    6. افتح صورة نسيجية.
    7. حدد عدد الأدوات | قياس الأشياء.
    8. انقر فوق الزر "تحديد الألوان ".
    9. حدد أداة القطارة ، وحدد اللون المراد قياسه في الصورة.
    10. أغلق النافذة ، وانقر فوق العد.
    11. حدد عرض | إحصائيات لرؤية النتائج.

3. المستوى الكيميائي الحيوي: أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) والإنزيمات الكولينية

  1. تجانس العينة
    ملاحظة: بمجرد انتهاء التجربة ، احتفظ بالعينات (الأنسجة أو الضفادع الصغيرة) في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) إذا لم تتم معالجتها في ذلك الوقت عن طريق التجميد عند -20 درجة مئوية (لمدة شهرين) أو -80 درجة مئوية (لمدة 6 أشهر). بدلا من ذلك ، يمكن تجانسها في ذلك الوقت وفقا للتوصيات المقترحة أدناه.
    1. الضفادع الصغيرة
      1. وزن 1 جم من الشرغوف أو مجموعة الضفادع الصغيرة على ميزان تحليلي دقيق.
      2. ضع 1 جم من الضفادع الصغيرة في أنبوب مخروطي سعة 15 مل يحتوي على 1 مل من PBS ، واغمره في حمام جليدي (4 درجات مئوية).
      3. تجانس باستخدام الخالط ذو الرؤوس التفلون الذي يتكيف مع أنبوب مخروطي ، والعمل في الظروف الباردة (4 درجات مئوية).
        تنبيه: تجنب استخدام عدد كبير من الثورات ، لأن ذلك قد يدمر البروتينات ويرفع درجة الحرارة.
      4. انقل نفس الحجم من الجانس السائل لكل عينة إلى أنبوبين من أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 2 مل ، واعمل في الظروف الباردة (4 درجات مئوية).
      5. الطرد المركزي العينات مع السائل المتجانس لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية و 9,520 × جم.
      6. أخيرا ، استخرج المادة الطافية ، وضعها في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة ، وقم بتسميتها بكميات من 0.5 مل إلى 1 مل ، واحتفظ بها في الفريزر عند -80 درجة مئوية (لمدة 6 أشهر) أو -20 درجة مئوية (لمدة شهرين) حتى يتم فحص الإنزيم.
    2. راشدون
      1. قم بإزالة الأنسجة المهمة (مثل الكبد والعضلات والكلى) ، ووزن 1 جم على ميزان تحليلي دقيق.
      2. ضع الأنسجة في أنبوب مخروطي سعة 50 مل يحتوي على 1 مل من PBS ، واغمرها في حمام جليدي (4 درجات مئوية).
      3. تجانس باستخدام الخالط ذو الرؤوس التفلون الذي يتكيف مع أنبوب مخروطي الشكل ، والعمل على البارد (4 درجات مئوية).
        تنبيه: تجنب استخدام عدد دورات عالية في الدقيقة ، لأن ذلك قد يدمر البروتينات ويرفع درجة الحرارة.
      4. انقل نفس حجم التجانس السائل لكل عينة إلى أنبوبين من أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 2 مل ، واعمل على البارد (4 درجات مئوية).
      5. الطرد المركزي الأنابيب مع التجانس السائل لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية و 9,520 × جم.
      6. أخيرا ، استخرج المادة الطافية ، وضعها في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة ، وقم بتسميته في حصص من 0.5 مل إلى 1 مل ، واحتفظ بها في الفريزر عند -80 درجة مئوية (لمدة 6 أشهر) أو -20 درجة مئوية (لمدة شهرين) حتى فحص الإنزيم.
  2. تحديد البروتين
    ملاحظة: يتم الحصول على قيمة البروتين لتقدير النشاط الأنزيمي فيما يتعلق بالكمية الإجمالية للبروتين مع تجنب التقليل من قيم النشاط الأنزيمي أو المبالغة في تقديرها. تعتمد هذه المنهجية على برادفورد34 مع تعديلات طفيفة للأنوران:
    1. تحضير كاشف برادفورد (انظر الجدول 1).
    2. أضف 100 مل من H3PO4 بنسبة 85٪ (p / v) إلى Coomassie G-250 + الإيثانول ، واجعله حجمه 1 لتر بالماء المقطر.
    3. قم بإعداد منحنى المعايرة باستخدام ألبومين مصل الأبقار (BSA) كمعيار بروتين معروف (الجدول 1).
    4. إعداد معايير الألبومين بتركيزات متزايدة لكوفيت مقياس الطيف الضوئي سعة 3 مل. للحصول على مثال على المنحنى المعياري، انظر الجدول 2.
    5. قم بقياس الامتصاص باستخدام مقياس الطيف الضوئي عند 590 نانومتر (هذا هو الطول الموجي الذي يتشكل عنده مركب الكاشف والبروتين).
      ملاحظة: يساعد إجراء تفاعل برادفورد مع العينة للقراءة في مقياس الطيف الضوئي باستخدام كوفيت زجاجي بحجم أقصى 3 مل ومسار بصري يبلغ 1 سم في تحديد البروتين.
    6. ضع المواد المتفاعلة التالية في كوفيت بهذا الترتيب: 2,000 ميكرولتر من كاشف برادفورد + X ميكرولتر من العينة (X = 20 ميكرولتر من العينة المتجانسة للعضو المعني من أنوران بالغ ، أو 40 ميكرولتر من العينة المتجانسة من الشرغوف).
    7. أخيرا ، قم بقياس الامتصاص في مقياس الطيف الضوئي عند 590 نانومتر.
      ملاحظة: ليس من الضروري العمل عند 4 درجات مئوية.
  3. كاتالاز
    ملاحظة: تستند هذه المنهجية إلى Aebi35 مع تعديلات طفيفة للأنوران.
    1. احتضان 1,900 ميكرولتر من PBS + 40 ميكرولتر من بيروكسيد الهيدروجين (H202) + 20 ميكرولتر من العينة (نقية في الضفادع الصغيرة ومخففة 1/25 للأنسجة البالغة) في كوفيت كوارتز 3 مل بطول مسار 1 سم.
      تنبيه: اتبع الترتيب الوارد أعلاه لإضافة الكواشف والعينة أثناء الحضانة. يمكن تحضين المواد المتفاعلة في درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية) لأن الأنوران مقضى للحرارة من الناحية الفسيولوجية.
    2. اقرأ حركية الكاتلاز عند 240 نانومتر لمدة دقيقتين في مقياس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية.
    3. احسب نشاط الإنزيم بالمعادلة التالية (5)35:
      ك (مليمول ∙ دقيقة -1∙ ملغ -1 بريت) = (امتصاص Δ / 1,000) / تركيز البروتين (5)
      ملاحظة: في الدراسات التي أجريت على مستحضرات الإنزيم المنقى ، يتم الحصول على النشاط المحدد k'0 بقسمة k على معامل الانقراض المولي ، (e = 43،6) ؛ ك '= (ك / ه).
  4. الجلوتاثيون S-transferase (GST)
    ملاحظة: تستند هذه المنهجية إلى Habig et al.36 مع تعديلات طفيفة للأنوران.
    1. احتضان 300 ميكرولتر من ضريبة السلع والخدمات + 10 ميكرولتر من 1-choro-2 ، 4-dinitrobenzeno (CDNB) (0.1 م) + 10 ميكرولتر من العينة (نقية في الضفادع الصغيرة ومخففة 1/25 للأنسجة البالغة) في الكوفيت.
      تنبيه: احترم ترتيب إضافة الكواشف والعينة المذكورة أعلاه أثناء الحضانة. يمكن تحضين الكواشف في درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية) لأن الأنوران مقضى للحرارة من الناحية الفسيولوجية.
    2. قم بإعداد ضريبة السلع والخدمات (الجدول 1).
    3. اقرأ حركية GST عند 340 نانومتر لمدة دقيقتين في مقياس الطيف الضوئي.
    4. احسب نشاط الإنزيم بالمعادلة التالية (6):
      معدل نشاط ضريبة السلع والخدمات (مليمول / دقيقة / مجم بروتين) = ([امتصاص Δ / 1،000] / 9.6 × 104) / تركيز البروتين (6)
      حيث 9.6 ملم −1 سم −1 = معامل الانقراض المولي.
  5. بيروكسيد الدهون (TBARS)
    ملاحظة: تستند هذه المنهجية إلى Buege و Aust37 مع تعديلات طفيفة للأنوران.
    1. قم ببناء منحنى معايرة باستخدام MDA كمعيار و 0.7٪ TBA (الجدول 3).
    2. قم بإعداد محلول MDA القياسي (10 مل) (الجدول 1). قم بإجراء التحلل المائي THP إلى MDA عن طريق وضع المحلول في حمام مائي 50 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    3. قم بإعداد محلول 0.7٪ (وزن / حجم) من TBA (الجدول 1) باستخدام محرك لوح تسخين مغناطيسي.
    4. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي لتجانس العينة لمدة 30 دقيقة عند 9,520 × جم و 4 درجات مئوية.
    5. استخرج 500 ميكرولتر من المادة الطافية ، وأضف 100 ميكرولتر من 6 M هيدروكسيد الصوديوم ، وضعها في حمام حراري عند 60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    6. بعد الحمام الحراري ، أضف 250 ميكرولتر من 35٪ HClO4 ، ثم ضعه في حمام جليدي (4 درجات مئوية) لمدة 30 دقيقة.
    7. بعد ذلك الوقت ، جهاز الطرد المركزي عند 9,520 × جم لمدة 12 دقيقة ، واستخرج 300 ميكرولتر من المادة الطافية.
    8. أضف 300 ميكرولتر من 0.7٪ TBA إلى المادة الطافية (العينة) ، وضعها في حمام حراري (97.5 درجة مئوية) لمدة 30 دقيقة.
    9. اقرأ امتصاص المركب الذي تتكون من العينة و TBA عند 532 نانومتر ، وحدد تركيز MDA في العينات عن طريق استبدال قيم الامتصاص في معادلة المنحنى (الشكل 1).
  6. أستيل كولينستراز (AChE)
    ملاحظة: تستند هذه المنهجية إلى تلك التي اقترحها Ellman et al.38 مع تعديلات طفيفة على anurans.
    1. في لحظة القياس ، قم بإعداد كواشف DTNB و acetylthiocholine iodide (ATCh).
    2. تحضير تفاعل DTNB (الجدول 1).
    3. تحضير تفاعل AChE (الجدول 1).
    4. في خلية زجاجية ذات مسار بصري يبلغ 1 سم ، قم بإعداد تفاعل AChE عن طريق وضع هذه الكواشف بالترتيب التالي: 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت PBS (الرقم الهيدروجيني = 8) + 150 ميكرولتر من DTNB + 50 ميكرولتر من ATCh + 10 ميكرولتر من العينة (نقي في الضفادع الصغيرة ومخفف 1/10 في الأنوران البالغين).
    5. اقرأ حركية AChE عند 412 نانومتر لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة.
    6. احصل على قيمة نشاط AChE باستخدام المعادلة التالية (7):
      معدل نشاط AChE (بروتين مليمول دقيقة -1 ملغم-1) = ([امتصاص Δ / 1,000] / 1.36) / تركيز البروتين (7)

4. المستوى الجيني والخلوي: فحص النواة الدقيقة والمذنب

  1. فحص النواة الدقيقة (MN)
    ملاحظة: تتفق المنهجية مع تلك التي اقترحها Fenech39 مع تعديلات طفيفة للأنوران الاستوائية الجديدة.
    1. تخدير العينات عن طريق الغمر في الماء المثلج (4 درجات مئوية) ، والحصول على عينات الدم عن طريق التقسيم خلف الطبقة الصغيرة في الضفادع الصغيرة أو عن طريق ثقب القلب عند البالغين.
    2. قم بتشويه قطرتين من الدم المحيطي من العينات على شرائح نظيفة مسبقا.
    3. بعد ذلك ، جفف الشرائح في الهواء ، وثبتها بالميثانول البارد بنسبة 100٪ (حجم / حجم) (4 درجات مئوية) لمدة 20 دقيقة ، ثم قم بتلطيخ محلول Giemsa بنسبة 5٪ لمدة 12 دقيقة.
    4. احصل على كود باحث واحد وقم بترميز الشرائح بشكل أعمى بتكبير 1,000 مرة.
    5. حدد تواتر MNs عن طريق تحليل 1,000 كريات الدم الحمراء الناضجة من كل عينة ، والتعبير عن العدد الإجمالي للخلايا الحمراءة لكل 1,000 خلية.
    6. استخدم المعايير التالية للتعرف الصحيح على شبكات MNs:
      1. ابحث عن MNs التي لها أقطار أصغر من 1/3 أقطار النواة الرئيسية.
      2. تأكد من أن لون MN غير قابل للانكسار ولكن له شدة تلطيخ مماثلة أو أخف من تلك الموجودة في النواة الرئيسية.
      3. ابحث عن حدود MN يمكن تمييزها عن حدود النواة الرئيسية دون أي اتصال بالنواة أو تتداخل مع النواة الرئيسية.
      4. تأكد من أن عدد MNs في الخلايا لا يتجاوز أكثر من أربعة MNs مرتبطة بالنواة.
  2. مقايسة المذنب أو الرحلان الكهربائي للهلام أحادي الخلية (SCGE)
    1. تخدير العينات عن طريق الغمر في الماء المثلج ، والحصول على عينات الدم عن طريق التقسيم خلف الجراحة في الضفادع الصغيرة أو عن طريق ثقب القلب عند البالغين.
    2. خفف الدم ب 1 مل من PBS ، جهاز طرد مركزي (381 × جم ، 9 دقائق) ، وأعد تعليقه في حجم نهائي قدره 50 مل من PBS.
    3. امزج 30 ميكرولتر من عينة الدم في 70 ميكرولتر من الاغاروز منخفض نقطة الانصهار (LMPA) بتركيز 0.5٪ من الاغاروز لتشكيل الطبقة 2. بعد ذلك ، ضع 50 ميكرولتر من الطبقة 2 على شريحة مغلفة مسبقا بالطبقة 1 تحتوي على 100 ميكرولتر من 0.5٪ من نقطة الانصهار العادية.
    4. غطي الشريحة بغطاء ، وضعيها في البرد (4 درجات مئوية) لمدة 10 دقائق لتصلب الطبقة 2.
    5. بعد التصلب ، قم بإزالة الغطاء ، وقم بتشكيل الطبقة الثالثة عن طريق وضع 100 ميكرولتر من 0.5٪ LMPA.
    6. عندما تصلب الطبقة الثالثة ، قم بإزالة الغطاء ، واغمر كل شريحة في وعاء كوبلين سعة 100 مل يحتوي على محلول تحلل (الجدول 1) تم تحضيره في نفس اليوم وحفظه عند 4 درجات مئوية. ضع برطمانات كوبلين في حمام بارد لمدة ساعة واحدة في الظلام (4 درجات مئوية) حتى يحدث التحلل.
      ملاحظة: يمكن إيقاف التجربة مؤقتا وإعادة تشغيلها لاحقا. تم الإبلاغ عن أن فترة التحلل تستمر من 1 ساعة إلى 1 شهر.
    7. في نهاية التحلل ، قم بإزالة الشرائح ، واغمرها في محلول المخزن المؤقت للرحلان الكهربائي (الجدول 1) في خزان الرحلان الكهربائي. قم بتنفيذ هذه الخطوة في الظلام لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية للسماح للحمض النووي بالاسترخاء. بعد فك الحمض النووي النووي ، قم بإجراء الرحلان الكهربائي على نفس المخزن المؤقت عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق عند 25 فولت و 250 مللي أمبير.
    8. في نهاية الرحلان الكهربائي ، قم بتحييد العينات الموجودة في الشرائح 3 × 5 دقائق عن طريق إضافة 2 مل من محلول Tris-HCl (الجدول 1).
    9. في الخطوة الأخيرة من تقنية فحص المذنب ، قم بتجفيف العينات عن طريق وضع العينات في 100 مل من برطمانات كوبلين تحتوي على الكحول (95٪) عند 4 درجات مئوية.
    10. أخيرا ، قم بتلطيخ العينات عن طريق وضع 10 ميكرولتر من 4 ′ ، 6-diamino-2-phenylindole (DAPI) في وسط الشريحة ، ووضع غطاء ينشر الصبغة في جميع أنحاء العينات. افحص الشرائح تحت المجهر الضوئي الفلوري باستخدام مرشح WB.
      تنبيه: يجب تنفيذ العملية برمتها في الظلام لتجنب التحلل الضوئي للحمض النووي.
    11. حدد كمية تلف الحمض النووي من خلال تقييم طول هجرة الحمض النووي من النواة. في هذه الحالة ، حدده بصريا على 100 خلية مختارة عشوائيا دون تداخل. صنف تلف الحمض النووي إلى أربع فئات: 0-I (لا ضرر) ، II (الحد الأدنى من الضرر) ، III (ضرر متوسط) ، و IV (أقصى ضرر). عبر عن البيانات كمتوسط عدد الخلايا التالفة (مجموع الفئات II-IV) ومتوسط درجة المذنب لكل مجموعة علاجية. من هذه البيانات، احسب مؤشر الضرر الوراثي (GDI) لكل كائن اختبار باستخدام المعادلة التالية (8):
      GDI = (1 [I] + 2 [II] + 3 [III] + 4 [IV]) / N [I-IV]) (8)
      حيث يمثل I-IV نوع تلف النوكليويد ، ويمثل NI-NIV العدد الإجمالي للنيوكليويدات المسجلة وفقا ل Pitarque et al.40.

5. المؤشرات الحيوية المرتبطة

ملاحظة: في الآونة الأخيرة ، يمكن دمج المؤشرات الحيوية على جميع المستويات باستخدام مؤشر استجابة المؤشرات الحيوية (IBR) الذي اقترحه Beliaeff و Burgeot49 وتكييفه مع anurans الاستوائية الجديدة. يوفر IBR قيمة رقمية تدمج جميع استجابات المؤشرات الحيوية. تشير قيم IBR الأعلى إلى مستويات ضغط أعلى49. وفيما يتعلق بتقدير معدل المراجعة المرجعية للبيانات لمحطة معينة أو معالجة مسح معين، فإن خطوات معالجة البيانات المتتالية لتحديد النتيجة النهائية هي كما يلي:

  1. احسب متوسط التقدير (X) عند توفر النتائج الفردية؛ وإلا، استخدم القيمة من العينة المجمعة في كل محطة أخذ عينات.
  2. وبالنسبة لكل مؤشر حيوي، احسب المتوسط العام (م) والانحراف المعياري (السيارات) ل X لجميع المحطات و/أو المسوح، اعتمادا على المقارنات التي يتعين إجراؤها.
  3. توحيد X للحصول على Y. احسب قيمة تسمى Y: Y = (X- m) / s.
  4. احسب قيمة Z على النحو التالي: Z = Y أو Z = −Y ، في حالة التأثير البيولوجي الذي يتوافق ، على التوالي ، مع التثبيط أو التنشيط استجابة لمصدر ضغوط.
  5. أخيرا ، احسب النتيجة (S) ، باستخدام S = Z + |Min|، حيث S ≥ 0 و |دقيقة | هي الحد الأدنى للقيمة المطلقة المحددة.
  6. ارسم مخططا عنكبوتيا أو نجميا بعد حساب قيمة S لكل علامة حيوية (Si) وإجراء التلخيص للحصول على IBR.
    ملاحظة: راجع الورقة الأصلية49 للحصول على أي تفاصيل عن الحسابات.

النتائج

جميع تقنيات العلامات الحيوية المعروضة هنا هي طرق بسيطة وسريعة ومريحة وحساسة ومنخفضة التكلفة ودقيقة. لكل علامة حيوية ، من المهم ملاحظة ما يلي.

المستوى الفردي
مؤشر الكتلة المتدرج
يعد التقاط الصور الفوتوغرافية على مقياس المليمتر ذا أه?...

Discussion

المؤشرات الحيوية على المستوى الفردي سهلة التحديد ومنخفضة التكلفة للغاية ، حيث لا يتطلب فحص هذه المؤشرات الحيوية سوى بضع قطع من المعدات المتوفرة عادة في أي مختبر بحث. بالإضافة إلى ذلك ، توفر هذه المؤشرات الحيوية معلومات عامة عن صحة ولياقتها. يعد عدد المستخدمة في كل بروتو?...

Disclosures

ويعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصالح متضاربة.

Acknowledgements

يعرب المؤلفون عن امتنانهم لمعهد الكيميكا في سان لويس "الدكتور روبرتو أولسينا" - المجلس الوطني للتحقيقات العلمية والتقنية (INQUISAL-CONICET) ، والجامعة الوطنية في سان لويس (Project PROICO 2-1914) ، ومختبرات المواد التجريبية (LAPEx) - Instituto de Biociências (INBIO) - Universidade Federal de Mato Grosso do Sul (UFMS) ، و Cátedra de Citología - Universidad Nacional de La Plata (UNLP) ، و Agencia Nacional de Promoción Científica (FONCYT; PICT-2018-02570 و PICT-2018-01067) للدعم المالي. نود أيضا أن نشكر المتحدثة الأصلية ليديا أنجر و GAECI-UNSL (مركز مساعدة الكتابة العلمية) من جامعة سان لويس الوطنية على التدقيق اللغوي للمخطوطة.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Analytical scale
Electrophoresis power supply Enduro E0203-250V 
Eosin Merck
Fluorescence photomicroscope Olympus BX50Equipped with an appropriate filter combination
Hematoxylin of HarrisMerck
High resolution photo camera  >16 megapixels
Homogenizer
Horizontal electrophoresis chamber Sigma
MicrocentrifugeDenver Instrument
MicroscopeLeicaDM4000 BEquipped with image capture system Leica DFC 280
MicrotomeLeica2265
ParaplastSigmaP3558
Personal Computer Eqquiped with Mac OS X, Lynux or Windows
Refrigerated centrifuge
UV–Vis spectrophotometerRayleigh723GWith UV-lamp

References

  1. Hook, S. E., Gallagher, E. P., Batley, G. E. The role of biomarkers in the assessment of aquatic ecosystem health. Integrated Environmental Assessment and Management. 10 (3), 327-341 (2014).
  2. Connon, R. E., et al. Linking mechanistic and behavioral responses to sublethal esfenvalerate exposure in the endangered delta smelt; Hypomesus transpacificus (Fam. Osmeridae). BMC Genomics. 10, 608 (2009).
  3. Scholz, N. L., et al. A perspective on modern pesticides, pelagic fish declines, and unknown ecological resilience in highly managed ecosystems. Bioscience. 62 (4), 428-434 (2012).
  4. Forbes, V. E., Palmqvist, A., Bach, L. The use and misuse of biomarkers in ecotoxicology. Environmental Toxicology and Chemistry: An International Journal. 25 (1), 272-280 (2006).
  5. Newman, M. C. . Fundamentals of Ecotoxicology: The Science of Pollution., Fifth edition. , (2019).
  6. Walker, C. . Ecotoxicology: Effects of Pollutants on the Natural Environment. , (2014).
  7. Venturino, A., et al. Biomarkers of effect in toads and frogs. Biomarkers. 8 (3-4), 167-186 (2003).
  8. Lajmanovich, R. C., et al. Técnicas para el relevamiento de anfibios en ambientes contaminados. Manual de Técnicas y Protocolos para el Relevamiento y Estudio de Anfibios de Argentina., 1a Edition. , (2021).
  9. Vander Oost, R., Beyer, J., Vermeulen, N. P. Fish bioaccumulation and biomarkers in environmental risk assessment: A review. Environmental Toxicology and Pharmacology. 13 (2), 57-149 (2003).
  10. Pérez-Iglesias, J. M., González, P., Calderón, M. R., Natale, G. S., Almeida, C. A. Comprehensive evaluation of the toxicity of the flame retardant (decabromodiphenyl ether) in a bioindicator fish (Gambusia affinis). Environmental Science and Pollution Research. 29 (33), 50845-50855 (2022).
  11. Bickham, J. W., Sandhu, S., Hebert, P. D., Chikhi, L., Athwal, R. Effects of chemical contaminants on genetic diversity in natural populations: Implications for biomonitoring and ecotoxicology. Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 463 (1), 33-51 (2000).
  12. Adams, S. M., Ham, K. D. Application of biochemical and physiological indicators for assessing recovery of fish populations in a disturbed stream. Environmental Management. 47 (6), 1047-1063 (2011).
  13. Rautenberg, G. E., Amé, M. V., Monferrán, M. V., Bonansea, R. I., Hued, A. C. A multi-level approach using Gambusia affinis as a bioindicator of environmental pollution in the middle-lower basin of Suquía River. Ecological Indicators. 48, 706-720 (2015).
  14. Larramendy, M. L. . Ecotoxicology and Genotoxicology: Non-Traditional Terrestrial Models. , (2017).
  15. Guilherme, S., Gaivão, I., Santos, M. A., Pacheco, M. DNA damage in fish (Anguilla anguilla) exposed to a glyphosate-based herbicide-elucidation of organ-specificity and the role of oxidative stress. Mutation Research. 743 (1-2), 1-9 (2012).
  16. Lajmanovich, R. C., et al. Harmful effects of the dermal intake of commercial formulations containing chlorpyrifos, 2, 4-D, and glyphosate on the common toad Rhinella arenarum (Anura: Bufonidae). Water, Air, & Soil Pollution. 226 (12), 427 (2015).
  17. Pérez-Iglesias, J. M., de Arcaute, C. R., Natale, G. S., Soloneski, S., Larramendy, M. L. Evaluation of imazethapyr-induced DNA oxidative damage by alkaline Endo III-and Fpg-modified single-cell gel electrophoresis assay in Hypsiboas pulchellus tadpoles (Anura, Hylidae). Ecotoxicology and Environmental Safety. 142, 503-508 (2017).
  18. Carvalho, W. F., et al. DNA damage exerted by mixtures of commercial formulations of glyphosate and imazethapyr herbicides in Rhinella arenarum (Anura, Bufonidae) tadpoles. Ecotoxicology. 28 (3), 367-377 (2019).
  19. Jacobsen-Pereira, C. H., et al. Markers of genotoxicity and oxidative stress in farmers exposed to pesticides. Ecotoxicology and Environmental Safety. 148, 177-183 (2018).
  20. Bartell, S. M. Biomarkers, bioindicators, and ecological risk assessment-A brief review and evaluation. Environmental Bioindicators. 1 (1), 60-73 (2006).
  21. Hamza-Chaffai, A. Usefulness of bioindicators and biomarkers in pollution biomonitoring. International Journal of Biotechnology for Wellness Industries. 3 (1), 19-26 (2014).
  22. Kacoliris, F. P., et al. Current threats faced by amphibian populations in the southern cone of South America. Journal for Nature Conservation. 69, 126254 (2022).
  23. Sparling, D. W., Linder, G., Bishop, C. A., Krest, S. K. . Ecotoxicology of Amphibians and Reptiles. , (2010).
  24. Kiesecker, J. M., Blaustein, A. R., Belden, L. K. Complex causes of amphibian population declines. Nature. 410 (6829), 681-684 (2001).
  25. Brühl, C. A., Schmidt, T., Pieper, S., Alscher, A. Terrestrial pesticide exposure of amphibians: An underestimated cause of global decline. Scientific Reports. 3, 1135 (2013).
  26. Wagner, N., Lötters, S., Veith, M., Viertel, B. Effects of an environmentally relevant temporal application scheme of low herbicide concentrations on larvae of two anuran species. Chemosphere. 135, 175-181 (2015).
  27. Peig, J., Green, A. J. New perspectives for estimating body condition from mass/length data: the scaled mass index as an alternative method. Oikos. 118 (12), 1883-1891 (2009).
  28. Brodeur, J. C., et al. Frog body condition: Basic assumptions, comparison of methods and characterization of natural variability with field data from Leptodactylus latrans. Ecological Indicators. 112, 106098 (2020).
  29. MacCracken, J. G., Stebbings, J. L. Test of a body condition index with amphibians. Journal of Herpetology. 46 (3), 346-350 (2012).
  30. Brodeur, J. C., et al. Frog somatic indices: Importance of considering allometric scaling, relation with body condition and seasonal variation in the frog Leptodactylus latrans. Ecological Indicators. 116, 106496 (2020).
  31. Carson, A. F., Hladik, L. C. . Histotechnology: A Self-Instructional Text. , (2009).
  32. Bernet, D., Schmidt, H., Meier, W., Burkhardt-Holm, P., Wahli, T. Histopathology in fish: Proposal for a protocol to assess aquatic pollution. Journal of Fish Diseases. 22 (1), 25-34 (1999).
  33. Santos, L. R. D. S., Franco-Belussi, L., Zieri, R., Borges, R. E., de Oliveira, C. Effects of thermal stress on hepatic melanomacrophages of Eupemphix nattereri (Anura). Anatomical Record. 297 (5), 864-875 (2014).
  34. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  35. Aebi, H. Catalase in vitro. Methods in Enzymology. 105, 121-126 (1984).
  36. Habig, W. H., Pabst, M. J., Jakoby, W. B. Glutathione S-transferases: The first enzymatic step in mercapturic acid formation. Journal of Biological Chemistry. 249 (22), 7130-7139 (1974).
  37. Buege, J. A., Aust, S. D. Microsomal lipid peroxidation. Methods in Enzymology. 52, 302-310 (1978).
  38. Ellman, G. L., Courtney, K. D., Andres, V., Featherstone, R. M. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity. Biochemical Pharmacology. 7 (2), 88-95 (1961).
  39. Fenech, M. Cytokinesis-block micronucleus cytome assay. Nature Protocols. 2 (5), 1084-1104 (2007).
  40. Pitarque, M., et al. Evaluation of DNA damage by the Comet assay in shoe workers exposed to toluene and other organic solvents. Mutation Research. 441 (1), 115-127 (1999).
  41. Nersesyan, A., Kundi, M., Atefie, K., Schulte-Hermann, R., Knasmuller, S. Effect of staining procedures on the results of micronucleus assays with exfoliated oral mucosa cells. Cancer Epidemiology Biomarkers & Prevention. 15 (10), 1835-1840 (2006).
  42. Pérez-Iglesias, J. M., Brodeur, J. C., Larramendy, M. An imazethapyr-based herbicide formulation induces genotoxic, biochemical, and individual organizational effects. Leptodactylus latinasus tadpoles (Anura: Leptodactylidae). Environmental Science and Pollution Research. 27 (2), 2131-2143 (2020).
  43. Pérez-Iglesias, J. M., et al. Multiple level effects of imazethapyr on Leptodactylus latinasus (Anura) adult frogs. Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 81 (3), 492-506 (2021).
  44. Pérez-Iglesias, J. M., et al. The genotoxic effects of the imidacloprid-based insecticide formulation Glacoxan Imida on Montevideo tree frog Hypsiboas pulchellus tadpoles (Anura, Hylidae). Ecotoxicology and Environmental Safety. 104, 120-126 (2014).
  45. Jha, A. N. Ecotoxicological applications and significance of the comet assay. Mutagenesis. 23 (3), 207-221 (2008).
  46. Garber, J. C., Barbee, R. W., Bielitzki, J. T. Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , (2011).
  47. Council, N.S.a.T.R. (Ed.). Reference Ethical Framework for Biomedical Research: Ethical Principles for Research with Laboratory, Farm, and Wild Animals. CONICET. , (2005).
  48. INTA. Guía para cuidado y uso de animales para experimentación. INTA. , (2008).
  49. Beliaeff, B., Burgeot, T. Integrated biomarker response: A useful tool for ecological risk assessment. Environmental Toxicology and Chemistry. 21 (6), 1316-1322 (2002).
  50. Pérez-Iglesias, J. M., Natale, G. S., Brodeur, J. C., Larramendy, M. L. Realistic scenarios of pesticide exposure alters multiple biomarkers in BOANA PULCHELLA (ANURA) adult frogs. Ecotoxicology. , (2023).
  51. Bassó, A., Devin, S., Peltzer, P. M., Attademo, A. M., Lajmanovich, R. C. The integrated biomarker response in three anuran species larvae at sublethal concentrations of cypermethrin, chlorpyrifos, glyphosate, and glufosinate-ammonium. Journal of Environmental Science, Part B. 57 (9), 687-696 (2022).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved