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요약

이 논문에서는 신열대성 아누란 종의 바이오마커 평가를 위한 표준화된 생태독성학적 방법을 제시합니다. 특히, 이 논문은 유전적, 세포-조직학적, 생화학적, 형태학적 및 개별 수준과 같은 다양한 규모의 생태독성학적 평가에서 여러 방법론을 자세히 설명합니다.

초록

생태독성학의 새로운 질문은 유기체에 대한 환경 스트레스 요인의 영향에 대한 해석뿐만 아니라 가능한 영향의 결정을 개선하는 생태독성학적 예측을 도출하기 때문에 일련의 바이오마커를 적용하는 것의 중요성을 강조합니다. 다양한 조직 수준에서 생태독성학적 바이오마커를 사용하면 환경 스트레스 요인에 대한 유기체의 생물학적 반응을 예측할 수 있으며, 이는 환경 위험 평가에 유용하다는 것은 잘 알려져 있습니다.

그럼에도 불구하고, 관찰된 효과의 특성과 변이를 규명하기 위해 기본 절차의 최적화를 고려하고, 대조군에서 이력 데이터를 생성하고, 장기 및 조직의 반응을 평가하기 위해 특정 생물학적 분석을 사용하는 것이 필요합니다. 따라서 본 연구는 다양한 생태학적 수준에서 신열대성 아누란의 모든 단계에서 사용되는 여러 생태독성학적 방법론을 설명하고 이를 야생 동물과 실험실 조건 모두에서 사용할 수 있는 유용한 바이오마커로 검증하는 것을 목표로 합니다. 이 연구에서 이러한 바이오마커는 개체/유기체 수준(신체 상태 지수), 조직학적/생리학적 수준(조직병리학, 조직통계 및 색소 분석), 생화학적 수준(산화 스트레스 효소) 및 유전적 수준(혜성 분석에 의한 DNA의 직접 및 산화 손상)에서 적용되었습니다.

이러한 방법론은 종에 따라 약간의 변형이나 수정이 있지만, 이러한 기술은 수생 및 육상 생태계의 유용한 지표 종이 되는 특정 특성을 가진 아누란에 대한 생체 이물의 효과를 평가하기 위한 효과적인 바이오마커를 제공합니다. 결론적으로, 본 연구에서 사용된 바이오마커 배터리는 신열대성 아누란의 독성 반응을 추정하는 데 적합한 것으로 입증되었으며, 이 지역의 수생 생태계에 대한 오염 물질의 영향을 식별하기 위한 생물지표로 추가로 권장될 수 있습니다. 마지막으로, 특정 지역의 아누란에 대한 이러한 중요한 바이오마커의 표준화를 달성하고 위험 평가 및 의사 결정에 포함할 수 있도록 하는 것이 권장됩니다.

서문

자연 수역에 환경 스트레스 요인을 입력하는 것은 수생 생태계의 건강에 영향을 미칠 수 있습니다1. 이러한 환경 스트레스 요인에 대한 노출은 직접 노출(단기 및 장기 모두)을 포함한 다양한 독성 메커니즘을 통해 수생 생물의 생존 또는 적합성에 영향을 미칠 수 있습니다2. 따라서 적합성 및 생존과 관련된 독성학적 종점을 평가하기 위한 표준화된 실험실 생물학적 분석은 현장에서 스트레스의 많은 간접적인 영향에 대한 신뢰할 수 없는 추정치일 수 있습니다. 또한, 정상적인 생리적 수준의 변화와 먹이 포획과 같은 개체에 미치는 영향은 유기체의 생존 및 생식 적합성에 미치는 영향, 그리고 궁극적으로 생태계의 건강에 미치는 영향에 대한 더 나은 장기 지표가 될 수 있습니다 1,3. 알려진 환경 매개변수와 오염 물질 농도를 기반으로 생태계 구성 및 기능, 유기체 건강의 변화를 예측하는 것은 오염 관리를 개선하는 데 중요합니다1.

바이오마커는 생체 이종 화학 물질에 대한 노출 또는 그 영향으로 인한 생화학적, 생리학적 또는 조직학적 변화로 정의됩니다 4,5. 바이오마커는 조기 경고 신호로 매우 유용한 것으로 입증되었습니다 4,5. 바이오마커가 답하는 데 도움이 되는 중요한 질문은 특정 스트레스 요인이 부작용을 일으킬 만큼 충분히 높은 농도로 환경에 존재하는지 여부입니다. 이 정보는 손상의 성격과 정도, 원인 요인을 조사할 가치가 있는지 또는 해당 사례에 더 이상 자원을 투자해서는 안 되는지 여부를 평가하는 데 기여합니다 6,7,8. 더욱이, 단일 바이오마커를 생체지표로 평가하는 개념은 적절하지 않을 수 있기 때문에 5,7,8,9,10 조기에 경고 신호를 감지하고 생태계에 대한 돌이킬 수 없는 영향을 예방하기 위해 여러 바이오마커에 대한 포괄적인 평가를 수행하는 경향이 증가하고 있습니다.

모든 독성 영향은 스트레스 요인과 생체 분자의 상호 작용으로 시작한다는 점에 유의하는 것이 매우 중요합니다. 이러한 의미에서 영향은 생화학적, 세포하, 세포, 조직, 장기, 개인, 개체군, 커뮤니티, 생태계, 경관 및 생물권 조직 수준을 통해 연쇄적으로 발생할 수 있습니다. 세포는 환경 스트레스 요인과 생물학적 시스템 간의 주요 상호 작용 부위입니다. 따라서 분자 및 유전적 영향을 이해하면 연구자들은 낮은 수준의 생태 조직과 높은 수준의 생태 조직을 연관시킬 수 있으며, 아직 테스트되지 않은 환경 오염 물질(예: 인체 건강에 미치는 영향)을 예측하는 데 도움이 됩니다5. 또한, 세포의 높은 특이성으로 인해 환경 오염 물질을 평가할 뿐만 아니라 인체 건강에도 유용합니다 5,11. 따라서 생화학적 수준에서 스트레스 요인의 영향을 이해하면 관찰된 효과의 원인에 대한 통찰력을 얻을 수 있으며 이를 다음 상위 수준5의 원인과 연결할 수 있습니다. 또한, 스트레스 요인의 생화학적 메커니즘을 이해함으로써, 아직 독성학적으로 평가되지 않은 새로운 스트레스 요인의 영향은 기능상의 유사성을 기반으로 다른 잘 알려진 오염 물질에 대해 예측할 수 있습니다. 다양한 환경적 스트레스 요인이 존재하는 경우, 유전적 및 생화학적 생체지표는 관찰된 특정 효과에 대한 귀중한 정보를 제공할 수 있습니다. 이 외에도 생화학적 변화와 관련된 조직화학적 평가는 독성역학에 대한 정보를 제공할 수 있다5. 요컨대, 세포, 생화학적, 조직학적 생체지표에 대한 포괄적인 분석이 필요하며, 이러한 유형의 분석은 차례로 현지 종에 대한 생물모니터링 프로그램에 포함되어야 한다 5,13,14.

그럼에도 불구하고 실험실 조건에서의 바이오마커 연구는 오염 물질에 노출된 후 치사적 효과 및 만성 영향의 감지, 사용된 방법의 검증 및 표준화의 어려움, 복잡한 시간 또는 용량 의존적 반응, 적합성에 대한 불분명하거나 결정되지 않은 연결, 통합 기계론적 모델의 부족 등 몇 가지 어려움을 제시할 수 있습니다1. 4. 이러한 문제를 해결하기 위한 해결책은 측정되는 바이오마커의 수를 늘리는 것이 아니라 전체 유기체에 대한 화학적 영향의 기계론적 기초를 설명하는 데 기여하는 연구와 테스트 가능한 가설을 신중하게 설계하는 것입니다4.

생태독성학의 새로운 질문은 유기체에 대한 환경 스트레스 요인의 영향에 대한 해석과 가능한 영향에 대한 의사 결정을 개선하는 생태독성학적 예측을 생성하기 위해 바이오마커 배터리를 적용하는 것의 중요성을 강조합니다. 더욱이, 환경 위험 평가 및 생물 모니터링에서 바이오마커와 생물지표라는 두 개념을 결합하는 것의 중요성은 연구자들이 특정 관심 환경에 있는 유기체가 생리학적으로 정상인지 또는 스트레스를 받는지 여부를 결정할 수 있다는 것입니다. 이 연구에서 취한 접근 방식은 인간을 대상으로 수행되는 생화학 분석과 유사합니다. 이러한 의미에서, 유기체가 현장과 실험실 모두에서 건강한지 확인하기 위해 일련의 바이오마커를 분석할 수 있다6. 마지막으로, 바이오마커는 두 가지 방식으로 생태학적 위험 평가에 기여할 것입니다: (1) 희귀 및/또는 장수 종의 노출을 평가하고, (2) 생물학적 조직의 다양한 수준에서 화학적 영향 메커니즘에 대한 가설을 테스트합니다4.

지난 10년 동안 바이오마커는 세포독성 및 유전독성 오염 물질에 대한 노출을 생체 모니터링하기 위해 아누란에서 사용되었습니다. 이 중 가장 많이 사용된 기법은 소핵(MN) 분석과 혜성 분석 또는 단세포 겔 전기영동(SCGE) 분석에 의한 단일 가닥 DNA 절단 유도입니다. 또한, 이러한 기술은 여러 신열대성 아누란 14,15,16,17,18,19에서 다양한 환경 스트레스 요인에 의해 유발된 DNA 손상을 추정하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 다른 바이오마커는 환경 오염 물질에 노출된 유기체의 산화 상태 변화를 조사하는 데 사용할 수 있습니다 16,17,18,19. 산화 스트레스는 다양한 생체 이물질에 대한 노출에 대한 반응으로, 노출된 개체의 항산화 능력을 포함하여 여러 가지 해로운 영향을 초래합니다 5,6,7,19,20.

생태독성학 연구에서 생물지표 종은 더 높은 조직 수준(예: 유기체, 개체군, 커뮤니티 및 생태계 수준)에서 환경 스트레스 요인의 장기적인 상호 작용 및 부작용을 식별하는 유기체이기 때문에 사용됩니다10,20,21. 바이오마커와 바이오인디케이터라는 두 가지 개념을 통합함으로써 종을 스크리닝하여 하나 이상의 생물학적 조직 수준에서 측정된 생물학적 효과와 상관관계가 있거나 연결된 생화학적, 생리학적 또는 생태학적 구조 또는 프로세스를 광범위하게 정의할 수 있습니다. 마지막으로, 스트레스 요인의 독성 추정치를 개선하기 위해 두 개념을 모두 활용하는 큰 과제는 생태학적 위험 평가에서 높은 유용성을 갖는 생물 지표 및 생체 지표를 분석하는 것과 관련이 있습니다20. 이러한 의미에서, 환경 스트레스 요인에 대한 시험 유기체의 반응에 대한 관련 정보를 제공하기 때문에, 바이오마커 및 바이오인디케이터를 조기 경고 신호로 사용하는 것의 관련성에 대한 합의가 있습니다 12,20,21.

양서류는 전 세계적으로 가장 위협받고 빠르게 감소하고 있는 유기체 그룹 중 하나입니다. 이러한 감소의 주요 원인 중 하나는 살충제, 금속 및 신흥 오염 물질 22,23,24,25와 같은 서식지로 들어오는 오염 물질입니다. Anurans는 투과성 피부, 물과의 밀접한 관계, 환경 오염에 대한 민감성과 같은 생물 지표 종으로 유용한 몇 가지 특성을 가지고 있습니다 2,23,24. 이러한 특성으로 인해 양서류는 환경 건강의 효과적인 생체 지표 7,8,22,23,24,26입니다.

그럼에도 불구하고, 기본 절차의 최적화와 대조군의 이력 데이터 생성을 고려하는 것뿐만 아니라 생체 지표에서 관찰되는 효과의 특성과 변이를 설명하기 위해 장기 및 조직의 반응을 평가하기 위해 특정 생물학적 분석을 사용하는 것이 필요합니다. 이러한 의미에서 본 연구는 다양한 생태 수준에서 신열대 anurans의 모든 단계에서 사용될 수있는 몇 가지 생태 독성 학적 방법론을 설명하고 야생 동물 및 실험실 조건 모두에서 사용할 수있는 유용한 바이오 마커로 검증하는 것을 목표로합니다. 이 연구는 환경 스트레스 요인에 노출된 아누란에서 실험실 및 야생 동물 생물 모니터링을 위해 입증되고 통합될 수 있는 일련의 바이오마커를 제시합니다.

프로토콜

다음 기술에는 국제 윤리 기준46,47,48에 따라 수행 된 동물의 이전 희생과 장기의 후속 해부 및 절제가 포함됩니다. 이 동물들은 San Luis 주 환경, 농업 및 생산부(Ministry of Environment, Agriculture and Production, Resolution 49-PMA2019)의 승인에 따라 포획되었습니다. 동물의 희생 및 안락사 방법은 San Luis 국립 대학의 Institutional Animal Care and Use Committee (CICUA, protocol Q-322/19)의 프로토콜에 의해 정식으로 승인되었습니다. 아누란 유기체를 사용한 절차는 Garber et al.46, CONICET47 및 INTA48에 자세히 설명된 지침에 따라 수행되었습니다. 또한, 여기에 제시된 모든 프로토콜은 유충 및 성충 생활 단계에 있는 신열대 아누란 종을 위한 것입니다. 그들은 이미 지역 연구자들에 의해 널리 받아들여졌으며 관련된 각 대학의 "Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (CICUA)"의 승인과 엄격한 프로토콜에 따라 수행됩니다. 사용된 재료 및 솔루션 목록은 재료 표 및 표 1에 나와 있습니다.

1. 개인 수준: 신체 상태, 간 및 생식선 지수

  1. 신체 상태 지수: 스케일된 질량 지수
    알림: 이 지수는 성충과 청소년 및 유충 모두에게 사용할 수 있습니다. 이 방법론은 Peig 및 Green27을 기반으로 하며, Brodeur et al.28,30 및 MacCracken 및 Stebbings29에 따라 anurans에 대한 약간의 수정이 있습니다.
    1. 정밀 분석 저울을 사용하여 각 표본의 체질량을 기록합니다.
    2. 각 표본을 밀리미터 시트에 놓고 ~15cm 거리에서 사진을 찍습니다.
      알림: 항상 같은 거리에서 사진을 찍는 것이 중요합니다.
    3. 사진 분석:
      참고: 사진은 온라인에서 무료로 사용할 수 있는 ImageJ 프로그램(https://imagej.nih.gov/ij/index.html) 또는 사진에 포함된 스케일로 측정할 수 있는 기타 이미지 분석 프로그램을 사용하여 분석할 수 있습니다.
      1. ImageJ 프로그램의 측정 도구를 사용하여 각 표본의 길이(SVL)를 측정하고 먼저 밀리미터 시트에서 알려진 측정값을 참조합니다.
        참고: 올챙이에서 몸 길이의 측정은 꼬리 지느러미를 무시하고 배설관까지 이루어져야 합니다.
    4. 스케일링 질량 지수(S)
      1. 각 anuran의 체질량과 SVL에서 얻은 데이터를 사용하여 SVL(x축)에 대한 체질량(y축)의 비선형 거듭제곱 함수 회귀선을 구성합니다.
      2. 연구된 모집단에서 측정된 모든 개인의 SVL 데이터를 사용하여 평균 길이를 계산합니다.
      3. 마지막으로, 방정식 (1)을 사용하여 Peig and Green27 및 Brodeur et al.28에 따라 스케일링된 질량 지수(S)를 계산합니다.
        S = MI(L0/Li)b (1)
        여기서MI 와LI 는 각각 개별 i의 체질량 및 SVL입니다. b는 비선형 전력 함수 회귀(28)에 의해 추정 된 스케일링 지수입니다. L0 은 연구 된 모집단의 평균 길이입니다. S는 SVL이 L0 값으로 표준화 될 때 개별 i에 대해 예측 된 체질량입니다.
        참고: b는 성적으로 이형성 종에서도 성별 특이적일 수 있는 종 특이적 상수라는 점에 유의하는 것이 중요합니다.
  2. Hepatosomatic index: 스케일링된 간 지수
    참고: 신체 상태 지수의 경우 이 지수는 모든 발달 단계의 개인과 함께 사용할 수 있습니다. 이 방법론은 Brodeur et al.28을 기반으로 합니다.
    1. 1.1.2단계 및 1.1.3단계에 따라 각 표본의 SVL을 기록합니다.
    2. anuran 양서류 46,47,48에 대한 윤리적 기준에 따라 개인을 안락사시킨다.
    3. 간 전체를 제거하고 가장 가까운 밀리그램까지 정밀 분석 저울로 질량을 기록합니다.
    4. 각 anuran의 간 질량 및 SVL에서 얻은 데이터를 사용하여 SVL(x축)에 대한 간 질량(y축)의 비선형 전력 함수 회귀선을 구성합니다.
    5. 연구된 모집단에서 측정된 모든 개인의 SVL 데이터를 사용하여 평균 길이를 계산합니다.
    6. 방정식 (2)를 사용하여 Brodeur et al.28에 따라 스케일링 간 지수(SLI)를 계산합니다.
      SLI = Lmi (L0/Li)b (2)
      여기서 Lmi 및 Li 는 각각 개별 i의 간 질량과 SVL입니다. b는 비선형 전력 함수 회귀(28)에 의해 추정 된 스케일링 지수입니다. L0 은 연구 된 모집단의 평균 길이입니다. SLI는 SVL이 L0으로 표준화 될 때 개별 i에 대해 예측 된 간 질량입니다.
  3. 생식선 지수: 스케일링된 생식선 지수
    참고: 이 방법론은 Brodeur et al.30 을 기반으로 하며 성인 개인에게만 유용합니다. 남성과 여성 지수는 서로 다른 척도에 따라 다르기 때문에 별도로 분석해야 한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다.
    1. 1.1.2단계 및 1.1.3단계에 따라 각 표본의 SVL을 기록합니다.
    2. anuran 양서류 46,47,48에 대한 윤리적 기준에 따라 개인을 안락사시킨다.
    3. 오른쪽 및 왼쪽 생식선을 제거하고 가장 가까운 밀리그램까지 정밀 분석 스케일에 질량을 기록합니다.
    4. 각 anuran의 생식선 질량 및 SVL에서 얻은 데이터를 사용하여 1.1.4.1 단계 및 1.2.3 단계와 유사하게 SVL (x 축)에 대한 생식선 질량 (y 축)의 비선형 전력 함수 회귀 선을 구성합니다.
    5. 연구된 모집단에서 측정된 모든 개인의 SVL 데이터를 사용하여 평균 길이를 계산합니다.
    6. 방정식 (3)을 사용하여 각 동물에 대해 Brodeur et al.30에 따라 스케일링된 생식선 지수(SGI)를 추정합니다.
      SGI = Gmi(L0/Li)b (3)
      여기서 Gmi 및 Li 는 각각 개별 i의 생식선 질량 및 SVL이고, b는 Brodeur et al.30의 비선형 전력 함수 회귀에 의해 추정 된 스케일링 지수이며, L0 은 연구 된 모집단의 평균 길이이며, SGI는 SVL이 L0으로 표준화 될 때 개별 i에 대한 예측 생식선 질량입니다.

2. 형태학적-조직학적 수준

참고: 이 분석을 위해서는 조직학적 단면을 사용해야 합니다. 첫 번째 단계는 조직을 수집하는 것입니다.

  1. 고정 및 탈수
    1. 구조물을 보존하기 위해 고정 용액을 사용하십시오. 아누란 조직의 경우, 가급적이면 나머지 정착 용액보다 권장되는 methacarn 또는 Bouin 용액을 사용하십시오(표 1).
      알림: 모든 물질은 사용 시 혼합해야 합니다.
    2. 올챙이 또는 50-100mg의 조직 조각을 4 ° C에서 3 시간 동안 1-2 mL의 고정 용액과 함께 원추형 튜브에 넣습니다. 같은 부피의 70% 에틸알코올로 티슈를 30분 동안 세척합니다.
    3. 신선한 70% 에틸 알코올 용액에 조직을 넣습니다.
      알림: 탈수를 계속하기 전에 이 시점에서 며칠 동안 절차를 중지할 수 있습니다.
    4. 에틸 알코올 80%(10분), 알코올 90%(10분), 에틸 알코올 100%(10분) 및 에틸 알코올 100%(10분)의 일련의 알코올 용액으로 조직을 탈수합니다.
    5. 크실렌에서 2 x 10분 동안 diaphanization(지우기)을 수행합니다.
    6. 비커에 파라핀을 녹입니다. 티슈를 10분 동안 담가둡니다. 조직을 제거하고 녹인 파라핀이 있는 조직학적 틀에 넣습니다. 실온에서 굳을 때까지 기다리십시오.
    7. 회전하는 마이크로톰에 만든 3μm 절편을 유리 슬라이드에 놓습니다.
  2. 히스토메트릭 분석
    1. hematoxylin-eosin31의 조직 절편을 염색합니다.
    2. 광학 현미경에서 100x 대물렌즈로 측정하기 위해 10-20개의 현미경 사진을 사용하십시오. 각 현미경 사진에서 5-10개의 간 세포를 분석합니다.
      참고: 여기서는 간을 이 기술을 설명하는 모델로 사용했습니다. 다른 티슈를 사용할 수 있습니다. 사용할 광학 현미경의 대물렌즈가 조직 유형에 적합한지 확인하십시오. 측정할 세포를 보고 식별할 수 있어야 합니다.
  3. 조직병리학
    1. hematoxylin-eosin32에서 조직 절편을 염색한 후 10x, 20x, 40x 및 100x 대물렌즈에서 5-10개의 조직학적 절편을 검사합니다.
    2. 조직 변화를 찾고 방정식 (4)를 사용하여 Bernet et al.32에서 설명한 조직 변화 정도(DTC) 지수를 추정합니다.
      DTC =Σalt입니다. (× w)    (4)
      여기서 Σalt는 변경의 합입니다. a는 손상 단계(0, 없음, 1, 낮음, 2, 보통, 3, 높음)를 나타냅니다. w는 손상 가역성의 정도를 나타냅니다(1, 가역 가능, 2, 부분적으로 가역 가능, 3, 비가역).
      참고: 여기서는 간을 이 기술을 설명하는 모델로 사용했습니다. 다른 티슈를 사용할 수 있습니다. 사용할 광학 현미경의 대물렌즈가 조직 유형에 적합한지 확인하십시오.
  4. 색소 체계
    1. 헤마톡실린-에오신으로 슬라이드를 염색한 후 20x 대물렌즈로 10-20개의 현미경 사진을 검사합니다.
    2. Santos et al.33에 따라 Image Pro-Plus 소프트웨어를 사용하여 염색 강도의 차이를 측정하여 멜라닌이 차지하는 면적을 정량화합니다.
    3. 소프트웨어 열기 이미지 프로 플러스 6.0®.
    4. 메뉴 및 도구 모음을 선택합니다: 생물학적.
    5. 현미경 사진을 찍는 데 사용되는 Spatial calibration of magnification(배율의 공간 보정 )을 선택합니다.
    6. 조직학적 이미지를 엽니다.
    7. Tool count(공구 개수) | 물체를 측정합니다.
    8. 색상 선택 버튼을 클릭합니다.
    9. 스포이드 도구를 선택하고 이미지에서 측정할 색상을 표시합니다.
    10. 창을 닫고 개수를 클릭합니다.
    11. 보기 | 결과를 볼 수 있는 통계입니다.

3. 생화학적 수준: 활성산소종(ROS) 및 콜린성 효소

  1. 시료 균질화
    참고: 실험이 끝나면 샘플(조직 또는 올챙이)을 인산염 완충 식염수(PBS)에 보존하여 -20°C(2개월 동안) 또는 -80°C(6개월 동안)에서 동결하여 처리하지 않을 경우 보존합니다. 대안적으로, 이들은 아래에 제안된 권장 사항에 따라 당시에 균질화될 수 있습니다.
    1. 올챙이
      1. 올챙이 또는 올챙이 풀 1g의 무게를 정밀 분석 저울에서 측정합니다.
      2. 올챙이 1g을 PBS 1mL가 들어있는 15mL 원뿔형 튜브에 넣고 얼음 욕조 (4 °C)에 담급니다.
      3. 원뿔형 튜브에 적합한 테프론 팁 균질화기로 균질화하고 추운 조건(4°C)에서 작업합니다.
        주의: 단백질을 파괴하고 온도를 높일 수 있으므로 많은 회전수를 사용하지 마십시오.
      4. 각 샘플의 동일한 부피의 액체 균질액을 라벨이 부착된 2mL 미세 원심분리기 튜브 2개에 옮기고 추운 조건(4°C)에서 작업합니다.
      5. 액체 균질액으로 4°C 및 9,520× g에서 10분 동안 샘플을 원심분리합니다.
      6. 마지막으로, 상층액을 추출하고, 미세 원심분리기 튜브에 넣고, 0.5mL - 1mL의 부분 표본으로 라벨을 붙이고, 효소 분석이 진행될 때까지 -80°C(6개월 동안) 또는 -20°C(2개월 동안)의 냉동고에 보존합니다.
    2. 성인
      1. 관심 조직(예: 간, 근육, 신장)을 제거하고 정밀 분석 저울에서 1g의 무게를 측정합니다.
      2. PBS 1mL가 들어있는 50mL 원뿔형 튜브에 조직을 넣고 얼음 목욕(4°C)에 담뱉습니다.
      3. 원뿔형 튜브에 적합한 테프론 팁 균질화기로 균질화하고 저온(4°C)으로 작업합니다.
        주의: 높은 rpm은 단백질을 파괴하고 온도를 높일 수 있으므로 사용하지 마십시오.
      4. 각 샘플의 동일한 부피의 액체 균질액을 라벨이 부착된 2mL 미세 원심분리기 튜브 2개에 옮기고 저온(4°C)으로 작업합니다.
      5. 액체 균질액으로 튜브를 4°C 및 9,520× g에서 10분 동안 원심분리합니다.
      6. 마지막으로, 상층액을 추출하고, 미세 원심분리기 튜브에 넣고, 0.5mL - 1mL의 부분 표본으로 라벨링하고, 효소 분석이 완료될 때까지 -80°C(6개월 동안) 또는 -20°C(2개월 동안)의 냉동고에 보존합니다.
  2. 단백질 측정
    참고: 단백질 값은 효소 활성 값의 과소 평가 또는 과대 평가를 피하면서 단백질의 총량과 관련하여 효소 활성을 추정하기 위해 얻어집니다. 이 방법론은 Bradford34 를 기반으로 하며 anurans에 대한 약간의 수정이 있습니다.
    1. Bradford 시약을 준비합니다( 표 1 참조).
    2. Coomassie G-250 + 에탄올에 85 % (p / v)에서 H3PO4 100mL를 첨가하고 증류수와 함께 1 L의 부피로 가져옵니다.
    3. 소 혈청 알부민(BSA)을 알려진 단백질 표준물질로 사용하여 보정 곡선을 준비합니다(표 1).
    4. 3mL 분광광도계 큐벳을 위해 농도를 높여 알부민 표준물질을 준비합니다. 표준 곡선의 예는 표 2를 참조하십시오.
    5. 590nm에서 분광 광도계를 사용하여 흡광도를 측정합니다(이것은 시약과 단백질의 복합체가 형성되는 파장입니다).
      참고: 최대 부피가 3mL이고 광학 경로가 1cm인 유리 큐벳을 사용하여 분광 광도계에서 판독하기 위해 샘플과 함께 Bradford 반응을 수행하면 단백질 측정에 도움이 됩니다.
    6. Bradford 시약 2,000 μL + Sample X μL (X = 성체 anuran의 관심 기관의 균질화 샘플 20 μL 또는 올챙이의 균질화 샘플 40 μL)의 순서로 큐벳에 반응물을 넣습니다.
    7. 마지막으로 590nm에서 분광 광도계에서 흡광도를 측정합니다.
      알림: 4 °C에서 작업할 필요는 없습니다.
  3. 카탈라아제
    알림: 이 방법론은 Aebi35 를 기반으로 하며 anurans에 대해 약간의 수정이 있습니다.
    1. 1,900 μL의 PBS + 40 μL의 과산화수소(H2, 0,2) + 20 μL의 시료(올챙이는 순수하고 성체 조직의 경우 1/25로 희석됨)를 경로 길이가 1cm인 3mL 석영 큐벳에 배양합니다.
      주의: 배양 중 시약과 샘플을 추가하려면 위에 제공된 순서를 따르십시오. 반응물은 실온(25°C)에서 배양할 수 있는데, 이는 아누란이 생리학적으로 외열성이기 때문입니다.
    2. UV 분광 광도계에서 240nm에서 2분 동안 카탈라아제 동역학을 판독합니다.
    3. 다음 수학식 (5)35를 사용하여 효소 활성을 계산합니다.
      k (mmol∙min-1∙mg-1 Prt) = (Δ 흡광도/1,000)/단백질 농도 (5)
      참고: 정제된 효소 제제를 사용한 연구에서 특정 활성 k'0 는 k 를 몰 흡광 계수(e = 43,6)로 나누어 얻습니다. k' = (k/e)입니다.
  4. 글루타치온 S-전이효소(GST)
    참고: 이 방법론은 Habig et al.36 을 기반으로 하며 anurans에 대해 약간 수정되었습니다.
    1. 큐벳에서 GST 300 μL + 1-choro-2, 4-dinitrobenzeno (CDNB) 10 μL(0.1 M) + 시료 10 μL(올챙이 순수, 성체 조직의 경우 1/25 희석)를 배양합니다.
      주의: 배양 중에 위에 제공된 시약과 샘플의 첨가 순서를 준수하십시오. 시약은 실온(25°C)에서 배양할 수 있는데, 이는 아누란이 생리학적으로 외열성이기 때문입니다.
    2. GST를 준비합니다(표 1).
    3. 분광 광도계에서 340nm에서 2분 동안 GST 동역학을 판독합니다.
    4. 다음 방정식 (6)으로 효소 활성을 계산합니다.
      GST의 활성율(mmol/분당/mg 단백질) = ([Δ 흡광도/1,000]/9.6 × 104)/단백질 농도(6)
      여기서 9.6 mM−1 cm−1 = 몰 흡광 계수.
  5. 지질 과산화(TBARS)
    참고: 이 방법론은 Buege 및 Aust37 을 기반으로 하며 anurans에 대한 약간의 수정이 있습니다.
    1. MDA를 표준으로 하고 0.7% TBA를 사용하여 검량선을 구성합니다(표 3).
    2. 표준 MDA 용액(10mM)을 준비합니다(표 1). 용액을 50°C 수조에 1시간 동안 넣어 MDA에 대한 THP 가수분해를 수행합니다.
    3. 마그네틱 핫 플레이트 교반기를 사용하여 TBA 0.7%(w/v) 용액(표 1)을 준비합니다.
    4. 그런 다음 9,520 × g 및 4 °C에서 30분 동안 시료 균질액을 원심분리합니다.
    5. 상층액 500μL를 추출하고 100μL의 6M NaOH를 첨가한 다음 60°C의 열탕에 30분 동안 둡니다.
    6. 열탕 후 250μL의 35%HClO 4를 첨가한 다음 얼음 목욕(4°C)에 30분 동안 둡니다.
    7. 그 후 9,520 × g 에서 12 분 동안 원심 분리하고 300 μL의 상층액을 추출합니다.
    8. 상층액(샘플)에 300μL의 0.7% TBA를 추가하고 열탕(97.5°C)에 30분 동안 넣습니다.
    9. 532nm에서 시료와 TBA에 의해 형성된 복합체의 흡광도를 판독하고 곡선 방정식의 흡광도 값을 대체하여 시료의 MDA 농도를 측정합니다(그림 1).
  6. 아세틸콜린에스테라아제(AChE)
    참고: 이 방법론은 Ellman et al.38 이 제안한 방법을 기반으로 하며 anurans에 대한 약간의 수정이 있습니다.
    1. 측정 순간 DTNB 및 아세틸티오콜린 요오드화물(ATCh) 시약을 설정합니다.
    2. DTNB 반응을 준비합니다(표 1).
    3. AChE 반응을 준비합니다(표 1).
    4. 광학 경로가 1cm인 유리 셀에서 이러한 시약을 PBS 완충액 150μL(pH = 8) + DTNB 150μL + ATCh 50μL + 시료 10μL(올챙이에서 순수하고 성체 아누란에서 1/10로 희석됨)의 순서로 배치하여 AChE 반응을 준비합니다.
    5. 실온에서 412nm에서 2분 동안 AChE 동역학을 판독합니다.
    6. 다음 방정식 (7)을 사용하여 AChE 활성의 값을 얻습니다.
      AChE의 활성률(mmol∙min-1∙mg-1 단백질) = ([Δ 흡광도/1,000]/1.36)/단백질 농도(7)

4. 유전 및 세포 수준: 소핵 및 혜성 분석

  1. 소핵(MN) 분석
    참고 : 이 방법론은 Fenech39 가 제안한 것과 일치하며 신 열대성 anurans에 대해 약간의 수정을 가했습니다.
    1. 얼음물(4°C)에 담가 검체를 마취시키고 올챙이의 경우 수술 뒤를 절개하거나 성체의 경우 심장 천자로 혈액 샘플을 얻습니다.
    2. 검체의 말초 혈액 두 방울을 미리 세척된 슬라이드에 바릅니다.
    3. 그 후, 슬라이드를 자연 건조시키고 100%(v/v)의 차가운 메탄올(4°C)로 20분 동안 고정한 다음 5% Giemsa 용액으로 12분 동안 염색합니다.
    4. 한 명의 연구원이 코드를 작성하고 1,000배 배율로 슬라이드를 블라인드 코딩합니다.
    5. 각 검체에서 1,000개의 성숙한 적혈구를 분석하여 MN의 빈도를 결정하고 1,000개 세포당 총 MN 수로 표현합니다.
    6. MN을 올바르게 식별하기 위해 다음 기준을 사용하십시오.
      1. 직경이 주핵의 1/3보다 작은 MN을 찾으십시오.
      2. MN의 착색이 굴절되지 않지만 주핵의 착색과 같거나 가벼운 염색 강도를 갖는지 확인하십시오.
      3. 코어에 연결되지 않거나 주핵과 겹치지 않고 주핵 경계와 구별할 수 있는 MN 경계를 찾습니다.
      4. 세포의 MN 수가 핵과 연결된 MN을 4개 이상 초과하지 않는지 확인합니다.
  2. 혜성 분석 또는 단세포 겔 전기영동(SCGE)
    1. 얼음물에 담가 표본을 마취하고, 올챙이의 경우 수술 뒤를 절개하거나 성체의 경우 심장 천자로 혈액 샘플을 얻습니다.
    2. 혈액을 PBS 1mL로 희석하고 원심분리기(381 × g, 9분)한 다음 최종 부피의 PBS 50mL에 재현탁합니다.
    3. 혈액 샘플 30μL를 0.5% 농도의 저융점 아가로스(LMPA) 70μL에 혼합하여 레이어 2를 형성합니다. 그 후, 0.5% 정상 융점 아가로스 100μL를 포함하는 층 1로 미리 코팅된 슬라이드에 50μL의 층 2를 놓습니다.
    4. 슬라이드를 커버슬립으로 덮고 찬(4°C)에 10분 동안 두어 레이어 2를 응고시킵니다.
    5. 응고 후 커버 슬립을 제거하고 0.5 % LMPA의 100 μL를 깔아 제 3 층을 형성합니다.
    6. 세 번째 층이 응고되면 커버슬립을 제거하고 같은 날 준비되어 4°C로 유지된 용해 용액(표 1)이 포함된 100mL 코플린 병에 각 슬라이드를 담그십시오. Coplin 항아리를 용해가 일어나도록 어두운 곳(4°C)에서 1시간 동안 냉탕에 넣습니다.
      참고: 실험을 일시 중지했다가 나중에 다시 시작할 수 있습니다. 용해 기간은 1시간에서 1개월까지 지속되는 것으로 보고되었습니다.
    7. 용해가 끝나면 슬라이드를 제거하고 전기영동 탱크의 전기영동 완충 용액(표 1)에 담그십시오. DNA가 풀릴 수 있도록 4°C에서 15분 동안 어두운 곳에서 이 단계를 수행합니다. 핵 DNA를 푼 후 동일한 완충액에서 4°C의 온도에서 25V 및 250mA에서 10분 동안 전기영동을 수행합니다.
    8. 전기 영동이 끝나면 2mL의 Tris-HCl 용액을 추가하여 슬라이드 3 x 5 분에 포함 된 샘플을 중화합니다 (표 1).
    9. 혜성 분석 기법의 마지막 단계에서는 4°C에서 알코올(95%)이 포함된 100mL Coplin 병에 샘플을 넣어 샘플을 탈수합니다.
    10. 마지막으로 슬라이드 중앙에 10μL의 4′,6-diamino-2-phenylindole(DAPI)을 놓아 샘플을 염색하고 염료를 샘플 전체에 펴 바르는 커버슬립을 놓습니다. WB 필터가 있는 형광 광현미경으로 슬라이드를 검사합니다.
      주의: DNA 광분해를 피하기 위해 전체 과정을 어두운 곳에서 수행해야 합니다.
    11. 핵체에서 DNA 이동 길이를 평가하여 DNA 손상을 정량화합니다. 이 경우 겹치지 않고 무작위로 선택된 100개의 셀에서 시각적으로 결정하십시오. DNA 손상을 0-I(손상 없음), II(최소 손상), III(중간 손상) 및 IV(최대 손상)의 네 가지 등급으로 분류합니다. 데이터를 손상된 세포의 평균 수(클래스 II-IV의 합)와 각 처리 그룹에 대한 평균 혜성 점수로 표현합니다. 이 데이터에서 다음 방정식 (8)을 사용하여 각 테스트 유기체에 대한 유전적 손상 지수(GDI)를 계산합니다.
      GDI = (1[I] + 2[II] + 3[III] + 4[IV])/N[I-IV]) (8)
      여기서 I-IV는 뉴클레오이드 손상의 유형을 나타내고, NI-NIV는 Pitarque et al.40에 따라 점수가 매겨진 총 뉴클레오이드 수를 나타냅니다.

5. 상관 바이오마커

참고: 최근에는 Beliaeff와 Burgeot49 가 제안하고 신열대성 아누란에 맞게 조정된 IBR(biomarker response) 지수를 사용하여 바이오마커를 모든 수준에서 통합할 수 있습니다. IBR은 모든 바이오마커 반응을 통합하는 숫자 값을 제공합니다. IBR 값이 높을수록 응력 수준이 높음을 나타냅니다49. 주어진 스테이션에 대한 IBR 추정 또는 주어진 설문 조사의 처리와 관련하여 최종 점수를 결정하기 위한 연속적인 데이터 처리 단계는 다음과 같습니다.

  1. 개별 결과를 사용할 수 있는 경우 평균 추정치(X)를 계산합니다. 그렇지 않으면 각 샘플링 스테이션에서 합동 샘플의 값을 사용합니다.
  2. 각 바이오마커에 대해 비교할 항목에 따라 모든 스테이션 및/또는 조사에 대한 X 의 일반 평균(m) 및 표준 편차(s)를 계산합니다.
  3. X를 표준화하여 Y를 구합니다. Y라는 값을 계산합니다: Y = (X- m)/s.
  4. Z 값을 다음과 같이 계산합니다: Z = Y 또는 Z = −Y, 생물학적 효과의 경우 각각 스트레스 요인에 대한 반응으로 억제 또는 활성화에 해당합니다.
  5. 마지막으로 S = Z + |Min|, 여기서 S ≥ 0 및 |최소| 는 결정된 최소 절대값입니다.
  6. 각 바이오마커(Si)에 대한 S 값을 계산하고 요약을 수행하여 IBR을 얻은 후 스파이더 또는 스타 다이어그램을 플로팅합니다.
    참고: 계산에 대한 자세한 내용은 원본 논문49를 참조하십시오.

결과

여기에 제시된 모든 바이오마커 기법은 간단하고, 빠르고, 편리하고, 민감하고, 저렴하고, 정확한 방법입니다. 각 바이오마커에 대해 다음 사항에 유의하는 것이 중요합니다.

개인 수준
스케일된 질량 지수
밀리미터 단위로 사진을 찍는 것은 이 값이 소프트웨어를 보정하는 데 사용되기 때문에 매우 중요하며, 이로 인해 ...

토론

개별 수준의 바이오마커는 측정이 매우 간단하고 비용이 매우 저렴하며, 이러한 바이오마커를 검사하는 데 일반적으로 모든 연구 실험실에서 사용할 수 있는 몇 가지 장비만 필요하기 때문입니다. 또한 이러한 바이오마커는 동물의 건강 및 적합성에 대한 일반 정보를 제공합니다. 각 프로토콜에 사용된 동물의 수는 신뢰할 수 있는 결과를 얻는 데 매우 중요합니다. 데이?...

공개

저자는 상충되는 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 말

저자들은 Instituto de Química de San Luis "Dr. Roberto Olsina"- Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Tecnológicas (INQUISAL-CONICET), Universidad Nacional de San Luis (Project PROICO 2-1914), Laboratório de Patologia Experimental (LAPEx) - Instituto de Biociências (INBIO) - Universidade Federal de Mato Grosso do Sul (UFMS), Cátedra de Citología - Universidad Nacional de La Plata (UNLP) 및 Agencia Nacional de Promoción Científica (FONCYT; PICT-2018-02570 및 PICT-2018-01067)을 통해 재정 지원을 받을 수 있습니다. 또한 원고 교정을 맡아준 원어민 Lidia Unger와 National University of San Luis의 GAECI-UNSL(scientific writing assistance center)에게도 감사의 뜻을 전합니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Analytical scale
Electrophoresis power supply Enduro E0203-250V 
Eosin Merck
Fluorescence photomicroscope Olympus BX50Equipped with an appropriate filter combination
Hematoxylin of HarrisMerck
High resolution photo camera  >16 megapixels
Homogenizer
Horizontal electrophoresis chamber Sigma
MicrocentrifugeDenver Instrument
MicroscopeLeicaDM4000 BEquipped with image capture system Leica DFC 280
MicrotomeLeica2265
ParaplastSigmaP3558
Personal Computer Eqquiped with Mac OS X, Lynux or Windows
Refrigerated centrifuge
UV–Vis spectrophotometerRayleigh723GWith UV-lamp

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