JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

במאמר זה מוצגות שיטות אקוטוקסיקולוגיות סטנדרטיות להערכת סמנים ביולוגיים במינים ניאוטרופיים של אנורן. באופן ספציפי, מאמר זה מפרט מספר מתודולוגיות בקני מידה שונים של הערכה אקוטוקסיקולוגית, כגון הרמה הגנטית, ההיסטולוגית-תאית, הביוכימית, המורפולוגית והאינדיבידואלית.

Abstract

השאלות החדשות באקוטוקסיקולוגיה מדגישות את החשיבות של יישום סוללה של סמנים ביולוגיים, שכן התוצאה היא תחזיות אקוטוקסיקולוגיות המשפרות לא רק את הפרשנות של ההשפעות של גורמי עקה סביבתיים על אורגניזמים, אלא גם את קביעת ההשפעה האפשרית שלהם. ידוע היטב כי השימוש בסמנים ביולוגיים אקוטוקסיקולוגיים ברמות שונות של ארגון מאפשר חיזוי של תגובות ביולוגיות של אורגניזמים לגורמי עקה סביבתיים, דבר שימושי בהערכת סיכונים סביבתיים.

עם זאת, יש צורך לשקול אופטימיזציה של הליכים בסיסיים, כדי ליצור נתונים היסטוריים בקבוצות ביקורת, ולהעסיק bioassays ספציפיים כדי להעריך תגובות באיברים ורקמות על מנת להבהיר את אופי ושונות של ההשפעות שנצפו. לכן, העבודה הנוכחית שואפת לתאר מספר מתודולוגיות אקוטוקסיקולוגיות המשמשות בכל השלבים של אנוארים ניאוטרופיים ברמות אקולוגיות שונות ולאמת אותם כסמנים ביולוגיים שימושיים לשימוש הן בחיות בר והן בתנאי מעבדה. בעבודה זו, סמנים ביולוגיים אלה יושמו ברמה האישית/אורגניזמית (מדד מצב הגוף), ברמה ההיסטולוגית/פיזיולוגית (היסטופתולוגיה, אנליזות היסטומטריות ופיגמנטריות), ברמה הביוכימית (אנזימי עקה חמצונית) וברמה הגנטית (נזק ישיר וחמצוני בדנ"א על ידי בדיקת שביט).

למרות מתודולוגיות אלה יש וריאציות קטנות או שינויים בהתאם למין, טכניקות אלה לספק סמנים ביולוגיים יעילים להערכת ההשפעה של xenobiotics על anurans, אשר יש מאפיינים מסוימים שהופכים אותם מינים אינדיקטור שימושי של מערכות אקולוגיות ימיות ויבשתיות. לסיכום, סוללת הסמנים הביולוגיים ששימשה במחקר הנוכחי הוכחה כמספקת להערכת תגובות רעילות באנורים נאוטרופיים וניתן להמליץ עליה גם כאינדיקטורים ביולוגיים לזיהוי ההשפעה של מזהמים על המערכות האקולוגיות המימיות באזור. לבסוף, מומלץ להשיג סטנדרטיזציה של סמנים ביולוגיים חשובים אלה עבור אנוארים באזורים ספציפיים, כמו גם לכלול אותם בהערכות סיכונים ובקבלת החלטות.

Introduction

הקלט של גורמי עקה סביבתיים לגופי מים טבעיים יכול להשפיע על בריאות המערכת האקולוגית המימית1. חשיפה לגורמי עקה סביבתיים אלה יכולה להשפיע על הישרדותם או כושרם של אורגניזמים ימיים באמצעות מנגנוני רעילות שונים, כולל חשיפה ישירה (הן לטווח קצר והן לטווח ארוך)2. לפיכך, בדיקות ביולוגיות סטנדרטיות במעבדה להערכת נקודות קצה טוקסיקולוגיות הקשורות לכושר והישרדות עשויות להיות הערכה לא אמינה של ההשפעות העקיפות הרבות של לחץ בתחום. יתר על כן, שינויים ברמות פיזיולוגיות נורמליות והשפעות על פרטים, כגון במונחים של לכידת טרף, עשויים להיות אינדיקטורים ארוכי טווח טובים יותר של ההשפעה על הישרדות וכושר הרבייה באורגניזמים, ובסופו של דבר, על בריאות המערכת האקולוגית 1,3. חיזוי שינויים בהרכב המערכת האקולוגית ובתפקודה, כמו גם בבריאות האורגניזם, בהתבסס על מערך ידוע של פרמטרים סביבתיים וריכוזי מזהמים, חשוב לשיפור ניהול הזיהום1.

סמנים ביולוגיים מוגדרים כשינויים ביוכימיים, פיזיולוגיים או היסטולוגיים עקב חשיפה או השפעות של כימיקלים קסנוביוטיים 4,5. סמנים ביולוגיים הוכיחו את עצמם כיעילים מאוד כאותות אזהרה מוקדמים 4,5. שאלה חשובה שסמנים ביולוגיים עוזרים לענות עליה היא האם גורמי עקה מסוימים נמצאים בריכוזים גבוהים מספיק בסביבה כדי לגרום לתופעות לוואי. מידע זה תורם להערכה האם ראוי לחקור את מהות והיקף הנזק ואת הגורמים הסיבתיים או שמא אין להשקיע משאבים נוספים במקרה זה 6,7,8. יתר על כן, מכיוון שהרעיון של הערכת סמן ביולוגי יחיד כאינדיקטור ביולוגי עשוי שלא להיות מספק 5,7,8,9,10, קיימת מגמה גוברת לביצוע הערכה מקיפה של סמנים ביולוגיים מרובים על מנת לזהות סימני אזהרה מוקדמים, ובכך למנוע השפעות בלתי הפיכות על מערכות אקולוגיות.

חשוב מאוד לציין כי כל ההשפעות הרעילות מתחילות באינטראקציה של גורם לחץ עם ביומולקולות. במובן זה, ההשפעות יכולות להתגלגל דרך רמות הארגון הביוכימיות, התת-תאיות, התאיות, הרקמות, האיברים, הפרט, האוכלוסייה, הקהילה, המערכת האקולוגית, הנוף והביוספריות. תאים הם האתר העיקרי של אינטראקציה בין גורמי עקה סביבתיים ומערכות ביולוגיות. כך, הבנת ההשפעות המולקולריות והגנטיות מאפשרת לחוקרים לקשר בין רמות נמוכות וגבוהות של ארגון אקולוגי ומסייעת להם לחזות את השפעתם של מזהמים סביבתיים, למשל על בריאות האדם, שטרם נבדקו5. יתר על כן, בשל הספציפיות הגבוהה של תאים, הם שימושיים לא רק להערכת מזהמים סביבתיים אלא גם לבריאות האדם 5,11. לכן, הבנת ההשפעות של גורמי לחץ ברמה הביוכימית עשויה לספק תובנות לגבי הגורמים להשפעות הנצפות ולאפשר להם להיות קשורים לאלה ברמה הגבוהה הבאה5. בנוסף, על ידי הבנת המנגנונים הביוכימיים של גורמי דחק, ניתן לחזות את ההשפעות של גורמי עקה חדשים שעדיין לא הוערכו באופן טוקסיקולוגי ביחס למזהמים ידועים אחרים בהתבסס על הדמיון בתפקודם. בנוכחות גורמי עקה סביבתיים שונים, סמנים ביולוגיים גנטיים וביוכימיים עשויים לספק מידע רב ערך על ההשפעות הספציפיות שנצפו. בנוסף לכך, הערכות היסטוכימיות הקשורות לשינויים ביוכימיים יכולות לספק מידע על טוקסיקודינמיקה5. בקיצור, ניתוח מקיף של סמנים ביולוגיים תאיים, ביוכימיים והיסטולוגיים הוא הכרחי10,12, וסוג זה של ניתוח, בתורו, צריך להיכלל בתוכניות ניטור ביולוגי עבור מינים מקומיים 5,13,14.

עם זאת, חקר סמנים ביולוגיים בתנאי מעבדה עשוי לעורר קשיים מסוימים, ובהם קשיים באיתור השפעות תת-קטלניות והשפעות כרוניות לאחר חשיפה למזהמים ובתיקוף ותקינה של השיטות הננקטות, כמו גם התגובות המורכבות התלויות בזמן או במינון, הקשרים הלא ברורים או הבלתי ידועים לכושר, והיעדר מודלים מכניסטיים משולבים1, 4. כדי לפתור בעיות אלה, הפתרון אינו להגדיל את מספר הסמנים הביולוגיים הנמדדים, אלא לתכנן בקפידה מחקרים והשערות הניתנות לבדיקה התורמות להסבר הבסיסים המכניסטיים של השפעות כימיות על אורגניזמים שלמים4.

השאלות החדשות באקוטוקסיקולוגיה מדגישות את החשיבות של יישום סוללה של סמנים ביולוגיים ליצירת תחזיות אקוטוקסיקולוגיות המשפרות את הפרשנות של ההשפעות של גורמי עקה סביבתיים על אורגניזמים, כמו גם קבלת החלטות לגבי השפעתם האפשרית. יתר על כן, החשיבות של שילוב שני מושגים - סמנים ביולוגיים ואינדיקטורים ביולוגיים - בהערכות סיכונים סביבתיים וניטור ביולוגי היא שזה יאפשר לחוקרים לקבוע אם אורגניזמים בסביבה מסוימת של עניין הם נורמליים מבחינה פיזיולוגית או בסטרס. הגישה שננקטה במחקר זה דומה לזו של הניתוח הביוכימי המתבצע בבני אדם. במובן זה, סוללה של סמנים ביולוגיים ניתן לנתח כדי לראות אם אורגניזם בריא הן בשדה והן במעבדה6. לבסוף, סמנים ביולוגיים יתרמו להערכות סיכונים אקולוגיים בשתי דרכים: (1) הערכת החשיפה של מינים נדירים ו/או מאריכי חיים, ו-(2) בדיקת השערות לגבי מנגנוני ההשפעות הכימיות ברמות שונות של ארגון ביולוגי4.

בעשור האחרון נעשה שימוש בסמנים ביולוגיים באנוארים לניטור ביולוגי של החשיפה למזהמים ציטוטוקסיים וגנוטוקסיים. בין אלה, הטכניקות ששימשו בתדירות הגבוהה ביותר הן בדיקת מיקרוגרעין (MN) ובדיקת השביט או השראת שברי DNA חד-גדילי על ידי בדיקת אלקטרופורזה של ג'ל חד-תאי (SCGE). בנוסף, טכניקות אלה שימשו בהצלחה כדי להעריך את הנזק לדנ"א שנגרם על ידי גורמי עקה סביבתיים שונים במספר אנוארים ניאוטרופיים 14,15,16,17,18,19. סמנים ביולוגיים אחרים יכולים לשמש לבחינת שינויים במצב החמצון באורגניזמים החשופים למזהמים סביבתיים 16,17,18,19. עקה חמצונית היא תגובה לחשיפה לקסנוביוטיקה שונה, מה שמוביל למספר השפעות מזיקות, כולל על היכולת נוגדת החמצון של האנשים שנחשפו 5,6,7,19,20.

במחקרים אקוטוקסיקולוגיים, מינים של ביו-אינדיקטור משמשים מכיוון שהם אורגניזמים המזהים אינטראקציות ארוכות טווח והשפעות שליליות של גורמי עקה סביבתיים ברמות ארגוניות גבוהות יותר (למשל, אורגניזם, אוכלוסייה, קהילה ומערכות אקולוגיות)10,20,21. על ידי שילוב שני המושגים - סמנים ביולוגיים ואינדיקטורים ביולוגיים - ניתן לסנן מינים כדי להגדיר באופן רחב מבנים או תהליכים ביוכימיים, פיזיולוגיים או אקולוגיים המתואמים או קשורים להשפעות ביולוגיות נמדדות ברמה אחת או יותר של ארגון ביולוגי. לבסוף, האתגר הגדול של ניצול שני המושגים כדי לשפר את הערכות הרעילות של גורם דחק מתייחס לניתוח סמנים ביולוגיים ואינדיקטורים ביולוגיים שיש להם תועלת גבוהה בהערכת סיכונים אקולוגיים20. במובן זה, קיים קונצנזוס לגבי הרלוונטיות של שימוש בסמנים ביולוגיים ואינדיקטורים ביולוגיים כסימני אזהרה מוקדמים, שכן הם מציעים מידע רלוונטי על תגובת אורגניזם הבדיקה לגורמי עקה סביבתיים 12,20,21.

דו-חיים הם אחת מקבוצות האורגניזמים המאוימות ביותר והדועכות במהירות ברחבי העולם. אחת הסיבות העיקריות לירידה זו היא מזהמים החודרים לבית הגידול שלהם, כגון חומרי הדברה, מתכות ומזהמים חדשים 22,23,24,25. לאנורנים יש מספר מאפיינים שהופכים אותם לשימושיים כמיני אינדיקטורים ביולוגיים, כגון עורם החדיר, קשר הדוק עם מים ורגישות לזיהום סביבתי 2,23,24. מאפיינים אלה הופכים את הדו-חיים לאינדיקטורים ביולוגיים יעילים לבריאות הסביבה 7,8,22,23,24,26.

עם זאת, יש צורך לא רק לשקול אופטימיזציה של נהלים בסיסיים ואת הדור של נתונים היסטוריים בקבוצות ביקורת, אלא גם להעסיק bioassays ספציפיים כדי להעריך תגובות באיברים ורקמות כדי להבהיר את אופי ושונות של השפעות שנצפו bioindicators. במובן זה, העבודה הנוכחית שואפת לתאר מספר מתודולוגיות אקוטוקסיקולוגיות שיופעלו בכל השלבים של אנוארים ניאוטרופיים ברמות אקולוגיות שונות ולאמת אותם כסמנים ביולוגיים שימושיים לשימוש הן בתנאי חיות בר והן בתנאי מעבדה. עבודה זו מציגה סוללה של סמנים ביולוגיים שעשויים להיות משולבים ואשר הוכחו עבור ניטור ביולוגי במעבדה ובחיות בר באנורים שנחשפו לגורמי עקה סביבתיים.

Protocol

הטכניקות הבאות כוללות את ההקרבה הקודמת של החיה, שבוצעה בהתאם לסטנדרטים אתיים בינלאומיים 46,47,48, ואת הנתיחה והאבלציה שלאחר מכן של האיברים. בעלי החיים נלכדו באישור המשרד לאיכות הסביבה, החקלאות והייצור של מחוז סן לואיס (החלטה 49-PMA2019). שיטות ההקרבה והמתת החסד של בעלי החיים אושרו כדין על ידי הפרוטוקולים של הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (CICUA, פרוטוקול Q-322/19) מהאוניברסיטה הלאומית של סן לואיס. ההליכים עם אורגניזמים אנוריים בוצעו על פי הנחיות המפורטות ב- Garber et al.46, CONICET47 ו- INTA48. בנוסף, כל הפרוטוקולים המוצגים כאן מתייחסים למיני אנורן ניאוטרופיים בשלבי החיים הזחלים והבוגרים שלהם; הם כבר התקבלו באופן נרחב על ידי חוקרים מקומיים ומתבצעים תחת פרוטוקול קפדני ובאישור של "Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (CICUA)" של כל אוניברסיטה מעורבת. רשימת החומרים והפתרונות בהם נעשה שימוש מוצגת בטבלת החומרים ובטבלה 1.

1. רמה אישית: מצב הגוף ומדדי כבד וגונדל

  1. מדד מצב הגוף: מדד מסה בקנה מידה
    הערה: ניתן להשתמש באינדקס זה הן עם מבוגרים והן עם צעירים וזחלים. מתודולוגיה זו מבוססת על Peig ו- Green27, עם שינויים קלים עבור anurans על פי Brodeur et al.28,30 ו- MacCracken and Stebbings29.
    1. רשום את מסת הגוף של כל דגימה באמצעות סולם אנליטי מדויק.
    2. הניחו כל דגימה על גיליון מילימטרי, וצלמו במרחק של ~15 ס"מ.
      הערה: חשוב תמיד לצלם מאותו מרחק.
    3. ניתוח תמונות:
      הערה: ניתן לנתח את התצלומים באמצעות תוכנית ImageJ, הזמינה באופן חופשי באינטרנט (https://imagej.nih.gov/ij/index.html), או עם כל תוכנית ניתוח תמונה אחרת המאפשרת לבצע מדידות בקנה מידה הכלול בתצלום.
      1. מדוד את אורך פתח החוטם (SVL) של כל דגימה באמצעות כלי המדידה של תוכנית ImageJ, ועיין תחילה במדידה ידועה בגיליון המילימטרי.
        הערה: בראשנים, מדידת אורך הגוף חייבת להתבצע עד לצינור הקלואקל, תוך התעלמות מהסנפיר הקאודלי.
    4. מדד מסה מתוקנן (S)
      1. בעזרת הנתונים המתקבלים ממסת הגוף וה-SVL של כל אנורן, בנו קו רגרסיה לא ליניארי של פונקציית הכוח של מסת הגוף (ציר y) כנגד SVL (ציר x).
      2. חשב את האורך הממוצע עם נתוני SVL של כל הפרטים שנמדדו מהאוכלוסייה הנחקרת.
      3. לבסוף, חשב את מדד המסה בקנה מידה (S) על פי Peig and Green27 ו- Brodeur et al.28 באמצעות משוואה (1):
        S = Mi(L0/Li)b (1)
        כאשר Mi ו- Li הם מסת גוף ו- SVL מהפרט i, בהתאמה; b הוא מעריך קנה המידה המוערך על ידי רגרסיה של פונקציית כוח לא ליניארית28; L0 הוא האורך הממוצע עבור האוכלוסייה הנחקרת; ו- S היא מסת הגוף החזויה עבור i הפרט כאשר ה- SVL שלו מתוקנן לערך L0 .
        הערה: חשוב לציין כי b הוא קבוע ספציפי למין שיכול להיות ספציפי למין גם במינים דימורפיים מבחינה מינית.
  2. אינדקס הפטוזומטי: אינדקס כבד מותאם
    הערה: באשר למדד מצב הגוף, ניתן להשתמש במדד זה עם אנשים בכל שלבי ההתפתחות. המתודולוגיה מבוססת על Brodeur et al.28.
    1. רשום את SVL של כל דגימה לפי שלב 1.1.2 ושלב 1.1.3.
    2. המתת חסד של אנשים על פי סטנדרטים אתיים עבור דו-חיים אנורן 46,47,48.
    3. הסר את הכבד כולו, ורשום את המסה שלו בקנה מידה אנליטי מדויק למיליגרם הקרוב ביותר.
    4. בעזרת הנתונים המתקבלים ממסת הכבד וה-SVL של כל אנורן, בנו קו רגרסיה לא ליניארי של מסת כבד (ציר y) כנגד SVL (ציר x).
    5. חשב את האורך הממוצע עם נתוני SVL של כל הפרטים שנמדדו מהאוכלוסייה הנחקרת.
    6. חשב את מדד הכבד בקנה מידה (SLI) לפי Brodeur et al.28 באמצעות משוואה (2):
      SLI = Lmi (L0/Li)b (2)
      כאשר Lmi ו- Li הם מסת הכבד ו- SVL מהפרט i, בהתאמה; b הוא מעריך קנה המידה המוערך על ידי רגרסיה של פונקציית כוח לא ליניארית28; L0 הוא האורך הממוצע עבור האוכלוסייה הנחקרת; ו- SLI היא מסת הכבד החזויה עבור i הפרט כאשר ה- SVL שלו מתוקנן ל- L0.
  3. מדד גונדל: אינדקס גונדל בקנה מידה
    הערה: מתודולוגיה זו מבוססת על Brodeur et al.30 והיא שימושית רק עם אנשים בוגרים. חשוב לציין כי יש לנתח את מדדי הגברים והנשים בנפרד מכיוון שהם משתנים בקני מידה שונים.
    1. רשום את SVL של כל דגימה לפי שלב 1.1.2 ושלב 1.1.3.
    2. המתת חסד של אנשים על פי סטנדרטים אתיים עבור דו-חיים אנורן 46,47,48.
    3. הסר את הגונדות הימני והשמאלי, ורשום את המסה בקנה מידה אנליטי מדויק למיליגרם הקרוב ביותר.
    4. בעזרת הנתונים המתקבלים ממסת הגונד ומ-SVL של כל אנוראן, בנו קו רגרסיה של פונקציית כוח לא ליניארית של מסת גונאד (ציר y) כנגד SVL (ציר x), בדומה לשלב 1.1.4.1 ושלב 1.2.3.
    5. חשב את האורך הממוצע עם נתוני SVL של כל הפרטים שנמדדו מהאוכלוסייה הנחקרת.
    6. הערך את מדד גונדל קנה המידה (SGI) לפי Brodeur et al.30 עבור כל חיה באמצעות משוואה (3):
      SGI = Gmi(L0/Li)b (3)
      כאשר Gmi ו- Li הם מסת הגונד ו- SVL מהפרט i, בהתאמה, b הוא מעריך קנה המידה המוערך על ידי רגרסיה של פונקציית כוח לא ליניארית על ידי Brodeur et al.30, L0 הוא האורך הממוצע עבור האוכלוסייה הנחקרת, ו- SGI היא מסת הגונד החזויה עבור פרט i כאשר SVL שלה מתוקנן ל- L0.

2. רמה מורפולוגית-היסטולוגית

הערה: לצורך ניתוח זה, יש צורך להשתמש בקטעים היסטולוגיים. הצעד הראשון הוא לאסוף את הרקמה.

  1. תיקון והתייבשות
    1. השתמש בפתרון מקבע כדי לשמר את המבנים. עבור רקמות אנורן, עדיף להשתמש בתמיסת מתאקרן או בואין, המומלצת על פני שאר תמיסות הקיבוע (טבלה 1).
      הערה: יש לערבב את כל החומרים בזמן השימוש.
    2. מניחים ראשנים או שבר רקמה של 50-100 מ"ג בצינור חרוטי עם 1-2 מ"ל של תמיסה מקובעת ב 4 ° C במשך 3 שעות. שטפו את הרקמה באותו נפח של 70% אלכוהול אתילי למשך 30 דקות.
    3. הניחו את הרקמה בתמיסת אתיל אלכוהול 70% טרייה.
      הערה: ניתן להפסיק את ההליך בשלב זה למשך מספר ימים לפני המשך ההתייבשות.
    4. יש לייבש את הרקמה בסדרה של תמיסות אלכוהול: אתיל אלכוהול 80% (10 דקות), אלכוהול 90% (10 דקות), אתיל אלכוהול 100% (10 דקות) ואתיל אלכוהול 100% (10 דקות).
    5. בצע דיאפניזציה (ניקוי) 2 x 10 דקות בקסילן.
    6. ממיסים את הפרפין בכד. משרים את הרקמה למשך 10 דקות. מוציאים את הרקמה, ומניחים בתבנית היסטולוגית עם פרפין מומס. המתן עד שהוא יתמצק בטמפרטורת החדר.
    7. מניחים מקטעים בגודל 3 מיקרומטר העשויים על מיקרוטום מסתובב על מגלשת זכוכית.
  2. ניתוח היסטומטרי
    1. מכתימים את קטעי הרקמה בהמטוקסילין-אאוסין31.
    2. השתמש 10-20 photomicrographs למדידה עם מטרה 100x במיקרוסקופ אור. לנתח 5-10 תאי כבד בכל photomicrograph.
      הערה: כאן, הכבד שימש כמודל לתיאור הטכניקה. ניתן להשתמש ברקמות אחרות; ודא כי מטרת מיקרוסקופ האור לשימוש מתאימה לסוג הרקמה. יש צורך להיות מסוגל לראות ולזהות את התאים שיש למדוד.
  3. היסטופתולוגיה
    1. לאחר צביעת חלקי הרקמה בהמטוקסילין-אאוסין32, יש לבחון 5-10 חתכים היסטולוגיים תחת מטרות 10x, 20x, 40x ו-100x.
    2. חפש שינויים ברקמה והערך את מדד מידת השינויים ברקמה (DTC) כפי שתואר על ידי Bernet et al.32 באמצעות משוואה (4):
      DTC = Σalt. (א × W)    (4)
      כאשר Σalt הוא סכום השינוי; A מייצג את שלב הנזק (0, נעדר; 1, נמוך; 2, בינוני; 3, גבוה); ו-W מייצג את מידת הפיכות הנזק (1, הפיך; 2, הפיך חלקית; 3, בלתי הפיך).
      הערה: כאן, הכבד שימש כמודל לתיאור הטכניקה. ניתן להשתמש ברקמות אחרות; ודא כי מטרת מיקרוסקופ האור לשימוש מתאימה לסוג הרקמה.
  4. מערכת פיגמנטרית
    1. לאחר צביעת השקופיות בהמטוקסילין-אאוזין, יש לבחון 10-20 פוטומיקרוגרפים במטרה של פי 20.
    2. כמת את השטח שנכבש על ידי מלנין על ידי מדידת הבדלים בעוצמת הצביעה באמצעות תוכנת Image Pro-Plus על פי סנטוס ואחרים 33.
    3. פתח את התוכנה Image Pro Plus 6.0®.
    4. בחר תפריט וסרגל כלים: ביולוגי.
    5. בחר את הכיול המרחבי של ההגדלה המשמש לצילום הפוטומיקרוגרפים.
    6. פתח תמונה היסטולוגית.
    7. בחר ספירת כלים | מדידת עצמים.
    8. לחץ על בחר צבעים לחצן.
    9. בחרו בכלי הטפטפת וסמנו את הצביעה שתימדד בתמונה.
    10. סגור את החלון ולחץ על ספירה.
    11. בחר תצוגה | סטטיסטיקה כדי לראות את התוצאות.

3. רמה ביוכימית: מיני חמצן תגובתי (ROS) ואנזימים כולינרגיים

  1. הומוגניזציה לדוגמה
    הערה: לאחר סיום הניסוי, שמור את הדגימות (רקמות או ראשנים) במי מלח חוצצי פוספט (PBS) אם הם לא הולכים להיות מעובדים באותו זמן על ידי הקפאה ב -20 ° C (במשך חודשיים) או -80 ° C (במשך 6 חודשים). לחילופין, ניתן להפוך אותם להומוגניים באותה עת בהתאם להמלצות המוצעות להלן.
    1. ראשנים
      1. שקלו 1 גרם של ראשנים או בריכה של ראשנים על איזון אנליטי מדויק.
      2. מניחים את 1 גרם של ראשנים בתוך צינור חרוטי 15 מ"ל המכיל 1 מ"ל של PBS, ולטבול אותו באמבט קרח (4 ° C).
      3. הומוגניזציה עם הומוגנייזר עם טפלון מותאם לצינור חרוט, ולעבוד בתנאי קור (4 מעלות צלזיוס).
        זהירות: הימנעו משימוש במספר גבוה של סיבובים, שכן הדבר עלול להרוס חלבונים ולהעלות את הטמפרטורה.
      4. להעביר את אותו נפח של הומוגנט נוזלי של כל דגימה לתוך שני מסומנים 2 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה, ולעבוד בתנאים קרים (4 ° C).
      5. צנטריפוגה את הדגימות עם הומוגנט נוזלי במשך 10 דקות ב 4 ° C ו 9,520 × גרם.
      6. לבסוף, לחלץ את supernatant, לשים אותו צינורות microcentrifuge, לתייג אותו aliquots של 0.5 מ"ל עד 1 מ"ל, ולשמור במקפיא ב -80 ° C (במשך 6 חודשים) או -20 ° C (במשך חודשיים) עד בדיקת האנזים.
    2. מבוגרים
      1. הסר את הרקמה המעניינת (למשל, כבד, שריר, כליה), ושקול 1 גרם על איזון אנליטי מדויק.
      2. מניחים את הרקמה בצינור חרוטי 50 מ"ל המכיל 1 מ"ל PBS, וטובלים אותו באמבט קרח (4 מעלות צלזיוס).
      3. הומוגניזציה עם הומוגנייזר עם טפלון מותאם צינור חרוט, ולעבוד קר (4 ° C).
        אזהרה: הימנע משימוש בסל"ד גבוה, שכן זה עלול להרוס חלבונים ולהעלות את הטמפרטורה.
      4. מעבירים את אותו נפח של ההומוגנט הנוזלי של כל דגימה לשני צינורות מיקרוצנטריפוגה מסומנים של 2 מ"ל, ועובדים קר (4 מעלות צלזיוס).
      5. צנטריפוגה את הצינורות עם הומוגנט נוזלי במשך 10 דקות ב 4 ° C ו 9,520 × גרם.
      6. לבסוף, לחלץ את supernatant, מניחים אותו צינורות microcentrifuge, תווית aliquots של 0.5 מ"ל עד 1 מ"ל, ולשמור במקפיא ב -80 ° C (במשך 6 חודשים) או -20 ° C (במשך 2 חודשים) עד בדיקת האנזים.
  2. קביעת חלבונים
    הערה: ערך החלבון מתקבל כדי להעריך את הפעילות האנזימטית ביחס לכמות הכוללת של החלבון, תוך הימנעות מהערכת חסר או הערכת יתר של ערכי הפעילות האנזימטית. מתודולוגיה זו מבוססת על ברדפורד34 עם שינויים קלים עבור anurans:
    1. הכינו מגיב ברדפורד (ראו טבלה 1).
    2. הוסף 100 מ"ל של H3PO4 ב 85% (p/v) Coomassie G-250 + אתנול, ולהביא לנפח של 1 L עם מים מזוקקים.
    3. הכינו את עקומת הכיול עם אלבומין בסרום בקר (BSA) כתקן חלבון ידוע (טבלה 1).
    4. הכינו תקני אלבומין בריכוזים הולכים וגדלים לקובט ספקטרופוטומטר 3 מ"ל. לדוגמה של העקומה הסטנדרטית, ראו טבלה 2.
    5. למדוד את הספיגה באמצעות ספקטרופוטומטר ב 590 ננומטר (זהו אורך הגל שבו מורכב של מגיב ואת החלבון נוצר).
      הערה: ביצוע תגובת ברדפורד עם הדגימה לקריאה בספקטרופוטומטר באמצעות קובטת זכוכית בנפח מרבי של 3 מ"ל ונתיב אופטי של 1 ס"מ מסייע לקביעת החלבון.
    6. מקם את המגיבים הבאים בקובטה בסדר זה: 2,000 μL של מגיב ברדפורד + X μL של הדגימה (X = 20 μL של הדגימה ההומוגנית של האיבר המעניין מאנוראן בוגר, או 40 μL של הדגימה ההומוגנית מראשן).
    7. לבסוף, למדוד את הספיגה בספקטרופוטומטר ב 590 ננומטר.
      הערה: אין צורך לעבוד ב 4 °C.
  3. קטלאז
    הערה: מתודולוגיה זו מבוססת על Aebi35 עם שינויים קלים עבור anurans.
    1. לדגור 1,900 μL של PBS + 40 μL של מי חמצן (H202) + 20 μL של הדגימה (טהור ראשנים מדולל 1/25 עבור רקמה בוגרת) בקובט קוורץ 3 מ"ל עם אורך נתיב 1 ס"מ.
      זהירות: בצע את ההזמנה שניתנה לעיל להוספת הריאגנטים והדגימה במהלך הדגירה. ניתן לדגור את המגיבים בטמפרטורת החדר (25 מעלות צלזיוס) מכיוון שהאנוארנים הם אקטותרמיים מבחינה פיזיולוגית.
    2. קרא את קינטיקה catalase ב 240 ננומטר במשך 2 דקות בספקטרופוטומטר UV.
    3. חשב את פעילות האנזים באמצעות המשוואה הבאה (5)35:
      k (mmol∙min-1∙mg-1 Prt) = (ספיגת Δ/1,000)/ריכוז חלבון (5)
      הערה: במחקרים עם תכשירי אנזים מטוהרים, הפעילות הספציפית k'0 מתקבלת על ידי חלוקת k במקדם ההכחדה המולרי, (e = 43,6); k' = (k/e).
  4. גלוטתיון S-טרנספראז (GST)
    הערה: מתודולוגיה זו מבוססת על Habig et al.36 עם שינויים קלים עבור anurans.
    1. לדגור 300 μL של GST + 10 μL של 1-choro-2, 4-dinitrobenzeno (CDNB) (0.1 M) + 10 μL של הדגימה (טהור ראשנים מדולל 1/25 עבור רקמה בוגרת) בקובט.
      זהירות: כבדו את סדר הוספת הריאגנטים ואת הדגימה שניתנה לעיל במהלך הדגירה. ניתן לדגור את הריאגנטים בטמפרטורת החדר (25 מעלות צלזיוס) מכיוון שהאנוארנים הם אקטותרמיים מבחינה פיזיולוגית.
    2. הכינו את ה-GST (טבלה 1).
    3. קרא את קינטיקה GST ב 340 ננומטר במשך 2 דקות בספקטרופוטומטר.
    4. חשב את פעילות האנזים באמצעות המשוואה הבאה (6):
      שיעור פעילות GST (mmol / לדקה / מ"ג חלבון) = ([ספיגת Δ/1,000]/9.6 ×10 4)/ריכוז חלבון (6)
      כאשר 9.6 mM−1 cm−1 = מקדם הכחדה מולרי.
  5. חמצון שומנים (TBARS)
    הערה: מתודולוגיה זו מבוססת על Buege ו- Aust37 עם שינויים קלים עבור anurans.
    1. בניית עקומת כיול עם מד"א כתקן ו-0.7% TBA (טבלה 3).
    2. הכינו את הפתרון הסטנדרטי של מד"א (10 מילימטר) (טבלה 1). ביצוע הידרוליזה THP למד"א על ידי הנחת התמיסה באמבט מים של 50 מעלות צלזיוס למשך שעה.
    3. הכינו תמיסה של 0.7% (w/v) של TBA (טבלה 1) באמצעות מערבל פלטה מגנטית.
    4. לאחר מכן, צנטריפוגה את הדגימה הומוגנטים במשך 30 דקות ב 9,520 × גרם ו 4 ° C.
    5. לחלץ 500 μL של supernatant, להוסיף 100 μL של 6 M NaOH, ומניחים באמבט תרמי ב 60 ° C במשך 30 דקות.
    6. לאחר האמבטיה התרמית, להוסיף 250 μL של 35% HClO4, ולאחר מכן מניחים באמבט קרח (4 ° C) למשך 30 דקות.
    7. לאחר זמן זה, צנטריפוגה ב 9,520 × גרם במשך 12 דקות, ולחלץ 300 μL של supernatant.
    8. הוסיפו 300 μL של 0.7% TBA לסופרנאטנט (דגימה), והכניסו לאמבט תרמי (97.5°C) למשך 30 דקות.
    9. קרא את הספיגה של הקומפלקס שנוצר על-ידי הדגימה וה-TBA ב-532 ננומטר, וקבע את ריכוז ה-MDA בדגימות על-ידי החלפת ערכי הספיגה במשוואת העקומה (איור 1).
  6. אצטילכולין אסטראז (AChE)
    הערה: מתודולוגיה זו מבוססת על זו המוצעת על ידי Ellman et al.38 עם שינויים קלים עבור anurans.
    1. ברגע המדידה, הגדר את מגיבי DTNB ואצטילתיוכולין יודיד (ATCh).
    2. הכינו את תגובת DTNB (טבלה 1).
    3. הכן את תגובת AChE (טבלה 1).
    4. בתא זכוכית עם נתיב אופטי של 1 ס"מ, להכין את התגובה AChE על ידי הצבת ריאגנטים אלה בסדר הבא: 150 μL של חיץ PBS (pH = 8) + 150 μL של DTNB + 50 μL של ATCh + 10 μL של הדגימה (טהור ראשנים מדולל 1/10 ב anurans בוגרים).
    5. קרא את קינטיקה AChE ב 412 ננומטר במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר.
    6. קבל את הערך של פעילות AChE באמצעות המשוואה הבאה (7):
      שיעור פעילות AChE (mmol∙min-1∙mg-1 protein) = ([Δ absorbance/1,000]/1.36)/ריכוז חלבון (7)

4. רמה גנטית ותאית: בדיקת מיקרוגרעין ושביט

  1. בדיקת Micronucleus (MN)
    הערה: המתודולוגיה תואמת את זו המוצעת על ידי Fenech39 עם שינויים קלים עבור anurans ניאוטרופי.
    1. מרדימים את הדגימות על ידי טבילה במי קרח (4 מעלות צלזיוס), ומקבלים דגימות דם על ידי חתך מאחורי האופרקולום בראשנים או על ידי ניקוב לב במבוגרים.
    2. מרחו שתי טיפות דם היקפי מהדגימות על שקופיות מנוקות מראש.
    3. לאחר מכן, יבשו את המגלשות באוויר, תקנו עם מתנול קר 100% (v/v) (4°C) למשך 20 דקות, ולאחר מכן הכתימו בתמיסת Giemsa 5% למשך 12 דקות.
    4. דאגו לקוד חוקר אחד ולקודד באופן עיוור את השקופיות בהגדלה של פי 1,000.
    5. לקבוע את התדירות של MNs על ידי ניתוח 1,000 אריתרוציטים בוגרים מכל דגימה, ולבטא כמספר הכולל של MNs לכל 1,000 תאים.
    6. השתמש בקריטריונים הבאים לזיהוי נכון של MNs:
      1. חפש MN שיש להם קטרים קטנים מ 1/3 מזה של הגרעין הראשי.
      2. ודא כי הצבע של MN אינו שביר אבל יש עוצמת צביעה זהה או בהירה יותר מזו של הגרעין הראשי.
      3. חפש גבול MN שניתן להבחין בינו לבין גבול הגרעין הראשי ללא כל חיבור לליבה או חפיפה עם הגרעין הראשי.
      4. ודא כי מספר MNs בתאים אינו עולה על יותר מארבעה MN הקשורים לגרעין.
  2. בדיקת שביט או אלקטרופורזה ג'ל חד-תאי (SCGE)
    1. מרדימים דגימות על ידי טבילה במי קרח, ומקבלים דגימות דם על ידי חתך מאחורי האופרקולום בראשנים או על ידי ניקוב לב במבוגרים.
    2. לדלל את הדם עם 1 מ"ל של PBS, צנטריפוגה (381 × גרם, 9 דקות), ו resuspend בנפח הסופי של 50 מ"ל של PBS.
    3. ערבבו 30 מיקרוליטר של דגימת הדם ב-70 מיקרוליטר של אגרוז נקודת התכה נמוכה (LMPA) בריכוז של 0.5% של אגרוז ליצירת שכבה 2. לאחר מכן, הניחו 50 μL של שכבה 2 על שקופית שצופתה בעבר בשכבה 1 המכילה 100 μL של 0.5% אגרוז נקודת התכה רגילה.
    4. מכסים את המגלשה בכיסוי ומניחים בקור (4°C) למשך 10 דקות למיצוק שכבה 2.
    5. לאחר התמצקות, להסיר את הכיסוי, וליצור את השכבה השלישית על ידי הנחת 100 μL של 0.5% LMPA.
    6. כאשר השכבה השלישית מתמצקת, הסירו את הכיסוי, וטבלו כל שקופית בצנצנת קופלין בנפח 100 מ"ל המכילה תמיסת ליזה (טבלה 1) שהוכנה באותו יום ונשמרה בטמפרטורה של 4°C. הניחו את צנצנות קופלין באמבטיה קרה למשך שעה אחת בחושך (4 מעלות צלזיוס) להתרחשות ליזיס.
      הערה: ניתן להשהות את הניסוי ולהפעיל אותו מחדש מאוחר יותר. דווח כי תקופת הליזיס נמשכת בין שעה לחודש.
    7. בסוף הליזיס, הסר את המגלשות וטבול בתמיסת חיץ האלקטרופורזה (טבלה 1) במיכל האלקטרופורזה. בצעו שלב זה בחושך במשך 15 דקות בטמפרטורה של 4°C כדי לאפשר לדנ"א להירגע. לאחר שחרור הדנ"א הגרעיני, בצע אלקטרופורזה על אותו חיץ בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ב- 25 וולט ו- 250 מיליאמפר.
    8. בסוף האלקטרופורזה, נטרל את הדגימות הכלולות בשקופיות 3 x 5 דקות על ידי הוספת 2 מ"ל של תמיסת Tris-HCl (טבלה 1).
    9. בשלב האחרון של טכניקת בדיקת השביט, יש לייבש את הדגימות על ידי הנחת הדגימות בצנצנות קופלין 100 מ"ל המכילות אלכוהול (95%) בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    10. לבסוף, הכתימו את הדגימות על ידי הנחת 10 μL של 4′,6-diamino-2-phenylindole (DAPI) במרכז השקופית, והניחו מכסה המפזר את הצבע לאורך הדגימות. בחן את השקופיות תחת מיקרוסקופ פוטואורסצנטי עם מסנן WB.
      זהירות: התהליך כולו חייב להתבצע בחושך כדי למנוע פירוק של DNA.
    11. כמת את הנזק לדנ"א על ידי הערכת משך נדידת הדנ"א מהנוקליאואיד. במקרה זה, לקבוע חזותית את זה על 100 תאים שנבחרו באופן אקראי ללא חפיפה. סווג את הנזק לדנ"א לארבעה סוגים: 0-I (ללא נזק), II (נזק מינימלי), III (נזק בינוני) ו- IV (נזק מרבי). בטא את הנתונים כמספר הממוצע של תאים פגומים (סכום המחלקות II-IV) ואת ציון השביט הממוצע עבור כל קבוצת טיפול. מתוך נתונים אלה, חשב את מדד הנזק הגנטי (GDI) עבור כל אורגניזם נבדק באמצעות המשוואה הבאה (8):
      GDI = (1[I] + 2[II] + 3[III] + 4[IV])/N[I-IV]) (8)
      כאשר I-IV מייצג את סוג הנזק לנוקלאואידים, ו- NI-NIV מייצג את המספר הכולל של נוקליואידים שדורגו על פי Pitarque et al.40.

5. סמנים ביולוגיים מתואמים

הערה: בתקופה האחרונה, ניתן לשלב סמנים ביולוגיים בכל הרמות באמצעות מדד תגובת הסמן הביולוגי (IBR) המוצע על ידי Beliaeff ו- Burgeot49 ומותאם לאנורנים ניאוטרופיים. IBR מספק ערך מספרי המשלב את כל תגובות הסמנים הביולוגיים; ערכי IBR גבוהים יותר מצביעים על רמות מתח גבוהות יותר49. במונחים של אומדן IBR עבור תחנה נתונה או טיפול בסקר נתון, שלבי עיבוד הנתונים הרצופים לקביעת הציון הסופי הם כדלקמן:

  1. חשב את האומדן הממוצע (X) כאשר תוצאות בודדות זמינות; אחרת, השתמש בערך מהדגימה המאוגמת בכל תחנת דגימה.
  2. עבור כל סמן ביולוגי, חשב את הממוצע הכללי (m) וסטיית התקן (s) של X עבור כל התחנות ו / או הסקרים, בהתאם להשוואות שיש לבצע.
  3. תקנן X כדי לקבל Y. חישוב ערך בשם Y: Y = (X- m)/s.
  4. חשב את ערך Z באופן הבא: Z = Y או Z = −Y, במקרה של אפקט ביולוגי המתאים, בהתאמה, לעיכוב או הפעלה בתגובה לגורם לחץ.
  5. לבסוף, חשב את הציון (S), עם S = Z + |Min|, כאשר S ≥ 0 ו- |מינימום | הוא הערך המוחלט המינימלי שנקבע.
  6. התווה דיאגרמת עכביש או כוכב לאחר חישוב הערך של S עבור כל סמן ביולוגי (Si) וביצוע הסיכום לקבלת IBR.
    הערה: עיין במסמךהמקורי 49 לקבלת פרטים על החישובים.

תוצאות

כל טכניקות הסמנים הביולוגיים המוצגות כאן הן שיטות פשוטות, מהירות, נוחות, רגישות, זולות ומדויקות. עבור כל סמן ביולוגי, חשוב לציין את הדברים הבאים.

ברמה האישית
מדד מסה מתוקנן
צילום תמונות בקנה מידה מילימטרי הוא בעל חשיבות רבה מכיוון שער?...

Discussion

הסמנים הביולוגיים ברמת הפרט הם פשוטים מאוד לקביעה ובעלות נמוכה מאוד, שכן בחינת סמנים ביולוגיים אלה דורשת רק כמה חלקים של ציוד הזמינים בדרך כלל בכל מעבדת מחקר. בנוסף, סמנים ביולוגיים אלה מספקים מידע כללי על בריאותם וכושרם של בעלי החיים. מספר בעלי החיים המועסקים בכל פרוטוק...

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים.

Acknowledgements

המחברים מודים בהכרת תודה ל-Instituto de Química de San Luis "Dr. Roberto Olsina"- Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Tecnológicas (INQUISAL-CONICET), Universidad Nacional de San Luis (Project PROICO 2-1914), Laboratório de Patologia Experimental (LAPEx) - Instituto de Biociências (INBIO) - Universidade Federal de Mato Grosso do Sul (UFMS), Cátedra de Citología - Universidad Nacional de La Plata (UNLP), ו- Agencia Nacional de Promoción Científica (FONCYT; PICT-2018-02570 ו-PICT-2018-01067) לתמיכה כספית. ברצוננו להודות גם לדוברת לידיה אונגר ול-GAECI-UNSL (מרכז סיוע לכתיבה מדעית) מהאוניברסיטה הלאומית של סן לואיס על ההגהה של כתב היד.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Analytical scale
Electrophoresis power supply Enduro E0203-250V 
Eosin Merck
Fluorescence photomicroscope Olympus BX50Equipped with an appropriate filter combination
Hematoxylin of HarrisMerck
High resolution photo camera  >16 megapixels
Homogenizer
Horizontal electrophoresis chamber Sigma
MicrocentrifugeDenver Instrument
MicroscopeLeicaDM4000 BEquipped with image capture system Leica DFC 280
MicrotomeLeica2265
ParaplastSigmaP3558
Personal Computer Eqquiped with Mac OS X, Lynux or Windows
Refrigerated centrifuge
UV–Vis spectrophotometerRayleigh723GWith UV-lamp

References

  1. Hook, S. E., Gallagher, E. P., Batley, G. E. The role of biomarkers in the assessment of aquatic ecosystem health. Integrated Environmental Assessment and Management. 10 (3), 327-341 (2014).
  2. Connon, R. E., et al. Linking mechanistic and behavioral responses to sublethal esfenvalerate exposure in the endangered delta smelt; Hypomesus transpacificus (Fam. Osmeridae). BMC Genomics. 10, 608 (2009).
  3. Scholz, N. L., et al. A perspective on modern pesticides, pelagic fish declines, and unknown ecological resilience in highly managed ecosystems. Bioscience. 62 (4), 428-434 (2012).
  4. Forbes, V. E., Palmqvist, A., Bach, L. The use and misuse of biomarkers in ecotoxicology. Environmental Toxicology and Chemistry: An International Journal. 25 (1), 272-280 (2006).
  5. Newman, M. C. . Fundamentals of Ecotoxicology: The Science of Pollution., Fifth edition. , (2019).
  6. Walker, C. . Ecotoxicology: Effects of Pollutants on the Natural Environment. , (2014).
  7. Venturino, A., et al. Biomarkers of effect in toads and frogs. Biomarkers. 8 (3-4), 167-186 (2003).
  8. Lajmanovich, R. C., et al. Técnicas para el relevamiento de anfibios en ambientes contaminados. Manual de Técnicas y Protocolos para el Relevamiento y Estudio de Anfibios de Argentina., 1a Edition. , (2021).
  9. Vander Oost, R., Beyer, J., Vermeulen, N. P. Fish bioaccumulation and biomarkers in environmental risk assessment: A review. Environmental Toxicology and Pharmacology. 13 (2), 57-149 (2003).
  10. Pérez-Iglesias, J. M., González, P., Calderón, M. R., Natale, G. S., Almeida, C. A. Comprehensive evaluation of the toxicity of the flame retardant (decabromodiphenyl ether) in a bioindicator fish (Gambusia affinis). Environmental Science and Pollution Research. 29 (33), 50845-50855 (2022).
  11. Bickham, J. W., Sandhu, S., Hebert, P. D., Chikhi, L., Athwal, R. Effects of chemical contaminants on genetic diversity in natural populations: Implications for biomonitoring and ecotoxicology. Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 463 (1), 33-51 (2000).
  12. Adams, S. M., Ham, K. D. Application of biochemical and physiological indicators for assessing recovery of fish populations in a disturbed stream. Environmental Management. 47 (6), 1047-1063 (2011).
  13. Rautenberg, G. E., Amé, M. V., Monferrán, M. V., Bonansea, R. I., Hued, A. C. A multi-level approach using Gambusia affinis as a bioindicator of environmental pollution in the middle-lower basin of Suquía River. Ecological Indicators. 48, 706-720 (2015).
  14. Larramendy, M. L. . Ecotoxicology and Genotoxicology: Non-Traditional Terrestrial Models. , (2017).
  15. Guilherme, S., Gaivão, I., Santos, M. A., Pacheco, M. DNA damage in fish (Anguilla anguilla) exposed to a glyphosate-based herbicide-elucidation of organ-specificity and the role of oxidative stress. Mutation Research. 743 (1-2), 1-9 (2012).
  16. Lajmanovich, R. C., et al. Harmful effects of the dermal intake of commercial formulations containing chlorpyrifos, 2, 4-D, and glyphosate on the common toad Rhinella arenarum (Anura: Bufonidae). Water, Air, & Soil Pollution. 226 (12), 427 (2015).
  17. Pérez-Iglesias, J. M., de Arcaute, C. R., Natale, G. S., Soloneski, S., Larramendy, M. L. Evaluation of imazethapyr-induced DNA oxidative damage by alkaline Endo III-and Fpg-modified single-cell gel electrophoresis assay in Hypsiboas pulchellus tadpoles (Anura, Hylidae). Ecotoxicology and Environmental Safety. 142, 503-508 (2017).
  18. Carvalho, W. F., et al. DNA damage exerted by mixtures of commercial formulations of glyphosate and imazethapyr herbicides in Rhinella arenarum (Anura, Bufonidae) tadpoles. Ecotoxicology. 28 (3), 367-377 (2019).
  19. Jacobsen-Pereira, C. H., et al. Markers of genotoxicity and oxidative stress in farmers exposed to pesticides. Ecotoxicology and Environmental Safety. 148, 177-183 (2018).
  20. Bartell, S. M. Biomarkers, bioindicators, and ecological risk assessment-A brief review and evaluation. Environmental Bioindicators. 1 (1), 60-73 (2006).
  21. Hamza-Chaffai, A. Usefulness of bioindicators and biomarkers in pollution biomonitoring. International Journal of Biotechnology for Wellness Industries. 3 (1), 19-26 (2014).
  22. Kacoliris, F. P., et al. Current threats faced by amphibian populations in the southern cone of South America. Journal for Nature Conservation. 69, 126254 (2022).
  23. Sparling, D. W., Linder, G., Bishop, C. A., Krest, S. K. . Ecotoxicology of Amphibians and Reptiles. , (2010).
  24. Kiesecker, J. M., Blaustein, A. R., Belden, L. K. Complex causes of amphibian population declines. Nature. 410 (6829), 681-684 (2001).
  25. Brühl, C. A., Schmidt, T., Pieper, S., Alscher, A. Terrestrial pesticide exposure of amphibians: An underestimated cause of global decline. Scientific Reports. 3, 1135 (2013).
  26. Wagner, N., Lötters, S., Veith, M., Viertel, B. Effects of an environmentally relevant temporal application scheme of low herbicide concentrations on larvae of two anuran species. Chemosphere. 135, 175-181 (2015).
  27. Peig, J., Green, A. J. New perspectives for estimating body condition from mass/length data: the scaled mass index as an alternative method. Oikos. 118 (12), 1883-1891 (2009).
  28. Brodeur, J. C., et al. Frog body condition: Basic assumptions, comparison of methods and characterization of natural variability with field data from Leptodactylus latrans. Ecological Indicators. 112, 106098 (2020).
  29. MacCracken, J. G., Stebbings, J. L. Test of a body condition index with amphibians. Journal of Herpetology. 46 (3), 346-350 (2012).
  30. Brodeur, J. C., et al. Frog somatic indices: Importance of considering allometric scaling, relation with body condition and seasonal variation in the frog Leptodactylus latrans. Ecological Indicators. 116, 106496 (2020).
  31. Carson, A. F., Hladik, L. C. . Histotechnology: A Self-Instructional Text. , (2009).
  32. Bernet, D., Schmidt, H., Meier, W., Burkhardt-Holm, P., Wahli, T. Histopathology in fish: Proposal for a protocol to assess aquatic pollution. Journal of Fish Diseases. 22 (1), 25-34 (1999).
  33. Santos, L. R. D. S., Franco-Belussi, L., Zieri, R., Borges, R. E., de Oliveira, C. Effects of thermal stress on hepatic melanomacrophages of Eupemphix nattereri (Anura). Anatomical Record. 297 (5), 864-875 (2014).
  34. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  35. Aebi, H. Catalase in vitro. Methods in Enzymology. 105, 121-126 (1984).
  36. Habig, W. H., Pabst, M. J., Jakoby, W. B. Glutathione S-transferases: The first enzymatic step in mercapturic acid formation. Journal of Biological Chemistry. 249 (22), 7130-7139 (1974).
  37. Buege, J. A., Aust, S. D. Microsomal lipid peroxidation. Methods in Enzymology. 52, 302-310 (1978).
  38. Ellman, G. L., Courtney, K. D., Andres, V., Featherstone, R. M. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity. Biochemical Pharmacology. 7 (2), 88-95 (1961).
  39. Fenech, M. Cytokinesis-block micronucleus cytome assay. Nature Protocols. 2 (5), 1084-1104 (2007).
  40. Pitarque, M., et al. Evaluation of DNA damage by the Comet assay in shoe workers exposed to toluene and other organic solvents. Mutation Research. 441 (1), 115-127 (1999).
  41. Nersesyan, A., Kundi, M., Atefie, K., Schulte-Hermann, R., Knasmuller, S. Effect of staining procedures on the results of micronucleus assays with exfoliated oral mucosa cells. Cancer Epidemiology Biomarkers & Prevention. 15 (10), 1835-1840 (2006).
  42. Pérez-Iglesias, J. M., Brodeur, J. C., Larramendy, M. An imazethapyr-based herbicide formulation induces genotoxic, biochemical, and individual organizational effects. Leptodactylus latinasus tadpoles (Anura: Leptodactylidae). Environmental Science and Pollution Research. 27 (2), 2131-2143 (2020).
  43. Pérez-Iglesias, J. M., et al. Multiple level effects of imazethapyr on Leptodactylus latinasus (Anura) adult frogs. Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 81 (3), 492-506 (2021).
  44. Pérez-Iglesias, J. M., et al. The genotoxic effects of the imidacloprid-based insecticide formulation Glacoxan Imida on Montevideo tree frog Hypsiboas pulchellus tadpoles (Anura, Hylidae). Ecotoxicology and Environmental Safety. 104, 120-126 (2014).
  45. Jha, A. N. Ecotoxicological applications and significance of the comet assay. Mutagenesis. 23 (3), 207-221 (2008).
  46. Garber, J. C., Barbee, R. W., Bielitzki, J. T. Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , (2011).
  47. Council, N.S.a.T.R. (Ed.). Reference Ethical Framework for Biomedical Research: Ethical Principles for Research with Laboratory, Farm, and Wild Animals. CONICET. , (2005).
  48. INTA. Guía para cuidado y uso de animales para experimentación. INTA. , (2008).
  49. Beliaeff, B., Burgeot, T. Integrated biomarker response: A useful tool for ecological risk assessment. Environmental Toxicology and Chemistry. 21 (6), 1316-1322 (2002).
  50. Pérez-Iglesias, J. M., Natale, G. S., Brodeur, J. C., Larramendy, M. L. Realistic scenarios of pesticide exposure alters multiple biomarkers in BOANA PULCHELLA (ANURA) adult frogs. Ecotoxicology. , (2023).
  51. Bassó, A., Devin, S., Peltzer, P. M., Attademo, A. M., Lajmanovich, R. C. The integrated biomarker response in three anuran species larvae at sublethal concentrations of cypermethrin, chlorpyrifos, glyphosate, and glufosinate-ammonium. Journal of Environmental Science, Part B. 57 (9), 687-696 (2022).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved