Méthodologies écotoxicologiques pour évaluer les biomarqueurs à différentes échelles chez les anoures néotropicaux

Résumé

Dans cet article, des méthodes écotoxicologiques standardisées pour l’évaluation des biomarqueurs chez les espèces d’anoures néotropicales sont présentées. Plus précisément, cet article détaille plusieurs méthodologies à différentes échelles d’évaluation écotoxicologique, telles que les niveaux génétique, cellulaire-histologique, biochimique, morphologique et individuel.

Résumé

Les nouvelles questions en écotoxicologie mettent en évidence l’importance d’appliquer une batterie de biomarqueurs, car cela permet d’obtenir des prédictions écotoxicologiques qui améliorent non seulement l’interprétation des effets des facteurs de stress environnementaux sur les organismes, mais aussi la détermination de leur impact possible. Il est bien connu que l’utilisation de biomarqueurs écotoxicologiques à différents niveaux d’organisation permet de prédire les réponses biologiques des organismes aux facteurs de stress environnementaux, ce qui est utile dans l’évaluation des risques environnementaux.

Néanmoins, il est nécessaire d’envisager l’optimisation des procédures de base, de générer des données historiques dans les groupes témoins et d’utiliser des essais biologiques spécifiques pour évaluer les réponses dans les organes et les tissus afin d’élucider la nature et la variation des effets observés. Par conséquent, le présent travail vise à décrire plusieurs méthodologies écotoxicologiques employées à tous les stades des anoures néotropicaux à différents niveaux écologiques et à les valider en tant que biomarqueurs utiles à utiliser à la fois dans la faune sauvage et dans des conditions de laboratoire. Dans ce travail, ces biomarqueurs ont été appliqués au niveau individuel/organique (indice de condition corporelle), au niveau histologique/physiologique (analyses histopathologiques, histométriques et pigmentaires), au niveau biochimique (enzymes de stress oxydatif) et au niveau génétique (dommages directs et oxydatifs dans l’ADN par dosage des comètes).

Bien que ces méthodologies présentent de petites variations ou modifications selon les espèces, ces techniques fournissent des biomarqueurs efficaces pour évaluer l’effet des xénobiotiques sur les anoures, qui possèdent certaines caractéristiques qui en font des espèces indicatrices utiles des écosystèmes aquatiques et terrestres. En conclusion, la batterie de biomarqueurs utilisés dans la présente étude s’est avérée adéquate pour estimer les réponses toxiques chez les anoures néotropicaux et peut être recommandée comme bioindicateurs pour identifier l’impact des polluants sur les écosystèmes aquatiques de la région. Enfin, il est recommandé de parvenir à la normalisation de ces biomarqueurs importants pour les anoures dans des régions spécifiques ainsi que de les inclure éventuellement dans les évaluations des risques et la prise de décision.

Introduction

L’apport de facteurs de stress environnementaux dans les plans d’eau naturels peut affecter la santé de l’écosystème aquatique¹. L’exposition à ces facteurs de stress environnementaux peut affecter la survie ou la valeur adaptative des organismes aquatiques par différents mécanismes de toxicité, y compris l’exposition directe (à court et à long terme)². Par conséquent, les essais biologiques normalisés en laboratoire visant à évaluer les paramètres toxicologiques liés à la valeur adaptative et à la survie peuvent constituer une estimation peu fiable des nombreux effets indirects du stress sur le terrain. De plus, les modifications des niveaux physiologiques normaux et les effets sur les individus, tels que la capture de proies, peuvent être de meilleurs indicateurs à long terme de l’impact sur la survie et la capacité de reproduction des organismes et, en fin de compte, sur la santé de l’écosystème ^1,3. Il est important de prédire les changements dans la composition et la fonction des écosystèmes, ainsi que dans la santé des organismes, en se fondant sur un ensemble connu de paramètres environnementaux et de concentrations de contaminants, pour améliorer la gestion de la pollution¹.

Les biomarqueurs sont définis comme des changements biochimiques, physiologiques ou histologiques dus à l’exposition à des produits chimiques xénobiotiques ou à leurs effets ^4,5. Les biomarqueurs se sont avérés très utiles en tant que signaux d’alerte précoce ^4,5. Une question importante à laquelle les biomarqueurs aident à répondre est de savoir si certains facteurs de stress sont présents à des concentrations suffisamment élevées dans l’environnement pour provoquer des effets néfastes. Ces informations permettent de déterminer s’il vaut la peine d’enquêter sur la nature et l’étendue des dommages et sur les agents causaux ou s’il ne faut pas investir davantage de ressources dans ce cas ^6,7,8. De plus, étant donné que le concept d’évaluation d’un seul biomarqueur en tant que bioindicateur peut ne pas être adéquat 5,7,8,9,10, il y a une tendance croissante à effectuer une évaluation complète de plusieurs biomarqueurs afin de détecter les signes avant-coureurs et, par conséquent, de prévenir les effets irréversibles sur les écosystèmes.

Il est très important de noter que tous les effets toxiques commencent par l’interaction d’un facteur de stress avec des biomolécules. En ce sens, les effets peuvent se répercuter sur les niveaux d’organisation biochimique, subcellulaire, cellulaire, tissulaire, organique, individuel, population, communauté, écosystème, paysage et biosphérique. Les cellules sont le principal site d’interaction entre les facteurs de stress environnementaux et les systèmes biologiques. Ainsi, la compréhension des effets moléculaires et génétiques permet aux chercheurs d’associer des niveaux faibles et élevés d’organisation écologique et les aide à prédire l’effet des polluants environnementaux, par exemple, sur la santé humaine, qui n’ont pas encore été testés⁵. De plus, en raison de la grande spécificité des cellules, elles sont non seulement utiles pour évaluer les polluants environnementaux, mais aussi pour la santé humaine ^5,11. Par conséquent, la compréhension des effets des facteurs de stress au niveau biochimique peut donner un aperçu des causes des effets observés et permettre de les relier à ceux du niveau supérieur^suivant 5. De plus, en comprenant les mécanismes biochimiques des facteurs de stress, les effets de nouveaux facteurs de stress qui n’ont pas encore été évalués toxicologiquement peuvent être prédits par rapport à d’autres contaminants bien connus en fonction de leurs similitudes de fonction. En présence de divers facteurs de stress environnementaux, les biomarqueurs génétiques et biochimiques peuvent fournir des informations précieuses sur les effets spécifiques observés. En plus de cela, les évaluations histochimiques liées aux changements biochimiques peuvent fournir des informations sur la toxicodynamique⁵. En bref, une analyse complète des biomarqueurs cellulaires, biochimiques et histologiques est nécessaire^10,12, et ce type d’analyse, à son tour, devrait être inclus dans les programmes de biosurveillance des espèces locales ^5,13,14.

L’étude des biomarqueurs en laboratoire peut néanmoins présenter certaines difficultés, notamment des difficultés dans la détection des effets sublétaux et des impacts chroniques après exposition à des polluants et dans la validation et la standardisation des méthodes employées, ainsi que les réponses complexes dépendantes du temps ou de la dose, les liens peu clairs ou indéterminés avec la valeur adaptative et l’absence de modèles mécanistes intégrés^{1, 4}. Épisode 4 Pour résoudre ces problèmes, la solution n’est pas d’augmenter le nombre de biomarqueurs mesurés, mais de concevoir soigneusement des études et des hypothèses vérifiables qui contribuent à expliquer les bases mécanistes des effets chimiques sur des organismes entiers⁴.

Les nouvelles questions en écotoxicologie soulignent l’importance d’appliquer une batterie de biomarqueurs pour générer des prédictions écotoxicologiques qui améliorent l’interprétation des effets des facteurs de stress environnementaux sur les organismes, ainsi que la prise de décision quant à leur impact possible. De plus, l’importance de combiner les deux concepts - biomarqueurs et bioindicateurs - dans l’évaluation des risques environnementaux et la biosurveillance est que cela permettra aux chercheurs de déterminer si les organismes d’un environnement d’intérêt spécifique sont physiologiquement normaux ou stressés. L’approche adoptée dans cette étude ressemble à celle de l’analyse biochimique qui est effectuée chez l’homme. En ce sens, une batterie de biomarqueurs peut être analysée pour voir si un organisme est sain à la fois sur le terrain et en laboratoire⁶. Enfin, les biomarqueurs contribueront à l’évaluation des risques écologiques de deux manières : (1) évaluer l’exposition des espèces rares et/ou à longue durée de vie, et (2) tester des hypothèses sur les mécanismes des impacts chimiques à différents niveaux d’organisation biologique⁴.

Au cours de la dernière décennie, des biomarqueurs ont été utilisés chez les anoures pour la biosurveillance de l’exposition aux contaminants cytotoxiques et génotoxiques. Parmi celles-ci, les techniques les plus fréquemment utilisées sont le dosage des micronoyaux (MN) et le dosage des comètes ou l’induction de cassures d’ADN simple brin par électrophorèse sur gel unicellulaire (SCGE). De plus, ces techniques ont été utilisées avec succès pour estimer les dommages à l’ADN induits par divers facteurs de stress environnementaux chez plusieurs anoures néotropicaux 14,15,16,17,18,19. D’autres biomarqueurs peuvent être utilisés pour examiner les changements dans l’état oxydatif chez les organismes exposés aux polluants environnementaux 16,17,18,19. Le stress oxydatif est une réponse à l’exposition à différents xénobiotiques, entraînant plusieurs effets néfastes, notamment sur la capacité antioxydante des individus exposés 5,6,7,19,20.

Dans les études écotoxicologiques, les espèces bioindicatrices sont utilisées parce qu’il s’agit d’organismes qui identifient les interactions à long terme et les effets néfastes des facteurs de stress environnementaux à des niveaux organisationnels supérieurs (p. ex., organisme, population, communauté et écosystème)10,20,21. En intégrant les deux concepts – biomarqueurs et bioindicateurs – les espèces peuvent être examinées pour définir de manière générale des structures ou des processus biochimiques, physiologiques ou écologiques qui sont corrélés ou liés à des effets biologiques mesurés à un ou plusieurs niveaux d’organisation biologique. Enfin, le grand défi de l’utilisation des deux concepts pour améliorer les estimations de la toxicité d’un facteur de stress concerne l’analyse de biomarqueurs et de bioindicateurs qui ont une grande utilité dans l’évaluation des risques écologiques²⁰. En ce sens, il existe un consensus sur la pertinence d’utiliser des biomarqueurs et des bioindicateurs comme signes d’alerte précoce, car ils offrent des informations pertinentes sur la réponse d’un organisme d’essai aux facteurs de stress environnementaux 12,20,21.

Les amphibiens sont l’un des groupes d’organismes les plus menacés et en déclin rapide dans le monde. L’une des principales raisons de ce déclin est les polluants qui pénètrent dans leur habitat, tels que les pesticides, les métaux et les polluants émergents 22,23,24,25. Les anoures ont plusieurs caractéristiques qui les rendent utiles en tant qu’espèces bioindicatrices, telles que leur peau perméable, leur relation étroite avec l’eau et leur sensibilité à la pollution environnementale ^2,23,24. Ces caractéristiques font des amphibiens des bioindicateurs efficaces de la santé environnementale 7,8,22,23,24,26.

Néanmoins, il est nécessaire non seulement d’envisager l’optimisation des procédures de base et la génération de données historiques dans les groupes témoins, mais aussi d’utiliser des essais biologiques spécifiques pour évaluer les réponses dans les organes et les tissus afin d’élucider la nature et la variation des effets observés dans les bioindicateurs. En ce sens, le présent travail vise à décrire plusieurs méthodologies écotoxicologiques à employer à tous les stades des anoures néotropicaux à différents niveaux écologiques et à les valider en tant que biomarqueurs utiles à utiliser à la fois dans la faune sauvage et en laboratoire. Ce travail présente une batterie de biomarqueurs qui peuvent être intégrés et qui ont fait leurs preuves pour la biosurveillance en laboratoire et chez la faune chez les anoures exposées à des facteurs de stress environnementaux.

Protocole

Les techniques suivantes comprennent le sacrifice antérieur de l’animal, qui a été effectué conformément aux normes éthiques internationales 46,47,48, et la dissection et l’ablation ultérieures des organes. Les animaux ont été capturés en vertu de l’autorisation du ministère de l’Environnement, de l’Agriculture et de la Production de la province de San Luis (résolution 49-PMA2019). Les méthodes de sacrifice et d’euthanasie des animaux ont été dûment approuvées par les protocoles du Comité Institutionnel de Soin et d’Utilisation des Animaux (CICUA, protocole Q-322/19) de l’Université Nationale de San Luis. Les procédures avec des organismes anoures ont été effectuées conformément aux lignes directrices détaillées dans Garber et ^al.46, CONICET⁴⁷ et INTA⁴⁸. De plus, tous les protocoles présentés ici concernent les espèces d’anoures néotropicales dans leurs stades de vie larvaire et adulte ; ils ont déjà été largement acceptés par les chercheurs locaux et sont réalisés selon un protocole strict et avec l’autorisation du « Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (CICUA) » de chaque université impliquée. Une liste des matériaux et solutions utilisés est présentée dans le Tableau des matériaux et le Tableau 1.

1. Niveau individuel : état corporel et indices hépatiques et gonadiques

1. Indice d’état corporel : Indice de masse échelonné
   REMARQUE : Cet indice peut être utilisé aussi bien chez les adultes que chez les juvéniles et les larves. Cette méthodologie est basée sur Peig et Green²⁷, avec des modifications mineures pour les anoures selon Brodeur et ^al.28,30 et MacCracken et Stebbings²⁹.
   1. Enregistrer la masse corporelle de chaque échantillon à l’aide d’une balance analytique de précision.
   2. Placez chaque spécimen sur une feuille millimétrique et prenez une photo à une distance de ~15 cm.
      REMARQUE : Il est important de toujours prendre des photos à la même distance.
   3. Analyse photographique :
      REMARQUE : Les photographies peuvent être analysées avec le programme ImageJ, qui est disponible gratuitement en ligne (https://imagej.nih.gov/ij/index.html), ou avec tout autre programme d’analyse d’images permettant d’effectuer des mesures à partir d’une échelle incluse dans la photographie.
      1. Mesurez la longueur museau-cloaque (SVL) de chaque échantillon à l’aide de l’outil de mesure du programme ImageJ, et reportez-vous d’abord à une mesure connue dans la feuille millimétrique.
         REMARQUE : Chez les têtards, la mesure de la longueur du corps doit être effectuée jusqu’au tube cloacal, sans tenir compte de la nageoire caudale.
   4. Indice de masse échelonné (S)
      1. Avec les données obtenues à partir de la masse corporelle et de la LCS de chaque anoure, construisez une droite de régression de la fonction de puissance non linéaire de la masse corporelle (axe des y) par rapport à la SVL (axe des x).
      2. Calculer la longueur moyenne à l’aide des données SVL de tous les individus mesurés dans la population étudiée.
      3. Enfin, calculez l’indice de masse à l’échelle (S) selon Peig et Green²⁷ et Brodeur et ^al.28 à l’aide de l’équation (1) :
         S = M_i(L₀/L_i)^b (1)
         où M_i et L_i sont respectivement la masse corporelle et la LCS de l’individu i ; b est l’exposant d’échelle estimé par une régression de fonction de puissance non linéaire²⁸ ; L₀ est la longueur moyenne de la population étudiée ; et S est la masse corporelle prédite de l’individu i lorsque sa SVL est normalisée à la valeur L₀ .
         REMARQUE : Il est important de noter que b est une constante spécifique à l’espèce qui pourrait également être spécifique au sexe chez les espèces sexuellement dimorphes.
2. Indice hépatosomatique : Indice hépatique écaillé
   REMARQUE : En ce qui concerne l’indice d’état corporel, cet indice peut être utilisé avec des individus à tous les stades de développement. La méthodologie est basée sur Brodeur et ^al.28.
   1. Consigner la LME de chaque échantillon conformément aux étapes 1.1.2 et 1.1.3.
   2. Euthanasier les individus selon les normes éthiques pour les amphibiens anoures 46,47,48.
   3. Prélevez tout le foie et enregistrez sa masse sur une balance analytique de précision au milligramme près.
   4. Avec les données obtenues à partir de la masse hépatique et de la LCS de chaque anoure, construisez une ligne de régression de la fonction de puissance non linéaire de la masse hépatique (axe y) par rapport à la SVL (axe x).
   5. Calculer la longueur moyenne à l’aide des données SVL de tous les individus mesurés dans la population étudiée.
   6. Calculer l’indice hépatique échelonné (ILS) selon Brodeur et ^al.28 à l’aide de l’équation (2) :
      SLI = Lm_i (L₀/L_i)^b (2)
      où Lm_i et L_i sont respectivement la masse hépatique et la LMC de l’individu i ; b est l’exposant d’échelle estimé par une régression de fonction de puissance non linéaire²⁸ ; L₀ est la longueur moyenne de la population étudiée ; et le SLI est la masse hépatique prédite pour l’individu i lorsque son SVL est normalisé à L₀.
3. Indice gonadique : Indice gonadique à l’échelle
   REMARQUE : Cette méthodologie est basée sur Brodeur et ^al.30 et n’est utile qu’avec des individus adultes. Il est important de noter que les indices masculins et féminins doivent être analysés séparément, car ils varient sur des échelles distinctes.
   1. Consigner la LME de chaque échantillon conformément aux étapes 1.1.2 et 1.1.3.
   2. Euthanasier les individus selon les normes éthiques pour les amphibiens anoures 46,47,48.
   3. Retirez les gonades droite et gauche et enregistrez la masse sur une balance analytique de précision au milligramme près.
   4. Avec les données obtenues à partir de la masse des gonades et de la LCS de chaque anoure, construisez une droite de régression de fonction de puissance non linéaire de la masse des gonades (axe des y) par rapport à la SVL (axe des x), comme aux étapes 1.1.4.1 et 1.2.3.
   5. Calculer la longueur moyenne à l’aide des données SVL de tous les individus mesurés dans la population étudiée.
   6. Estimez l’indice gonadique échelonné (IGG) selon Brodeur et ^al.30 pour chaque animal à l’aide de l’équation (3) :
      SGI = Gm_i(L₀/L_i)^b (3)
      où Gm_i et L_i sont respectivement la masse de la gonade et la SVL de l’individu i, b est l’exposant d’échelle estimé par une régression de la fonction de puissance non linéaire de Brodeur et ^al.30, L 0 est la longueur moyenne de la population étudiée, et SGI est la masse de gonade prédite d’un individu i lorsque sa SVL est normalisée à L₀.

2. Niveau morphologique-histologique

REMARQUE : Pour cette analyse, il est nécessaire d’utiliser des coupes histologiques. La première étape consiste à prélever le tissu.

1. Fixation et déshydratation
   1. Utilisez une solution fixatrice pour préserver les structures. Pour les tissus anoures, utiliser de préférence de la méthacarne ou une solution de Bouin, recommandée par rapport au reste des solutions de fixation (Tableau 1).
      REMARQUE : Toutes les substances doivent être mélangées au moment de l’utilisation.
   2. Placez des têtards ou un fragment de tissu de 50 à 100 mg dans un tube conique contenant 1 à 2 ml de solution fixatrice à 4 °C pendant 3 h. Lavez le mouchoir dans le même volume d’alcool éthylique à 70 % pendant 30 min.
   3. Placez le mouchoir dans une solution fraîche d’alcool éthylique à 70 %.
      REMARQUE : Il est possible d’arrêter la procédure à ce stade pendant quelques jours avant de poursuivre la déshydratation.
   4. Déshydratez le tissu dans une série de solutions alcooliques : alcool éthylique 80 % (10 min), alcool 90 % (10 min), alcool éthylique 100 % (10 min) et alcool éthylique 100 % (10 min).
   5. Effectuer une diaphanisation (éclaircissement) 2 x 10 min dans du xylène.
   6. Faites fondre la paraffine dans un bécher. Faites tremper le mouchoir pendant 10 min. Retirez le tissu et placez-le dans un moule histologique avec de la paraffine fondue. Attendez qu’il se solidifie à température ambiante.
   7. Placez des sections de 3 μm réalisées sur un microtome rotatif sur une lame de verre.
2. Analyse histométrique
   1. Teindre les coupes de tissu avec de l’hématoxyline-éosine³¹.
   2. Utilisez 10 à 20 photomicrographies pour la mesure avec un objectif 100x dans un microscope optique. Analysez 5 à 10 cellules hépatiques dans chaque photomicrographie.
      REMARQUE : Ici, le foie a été utilisé comme modèle pour décrire la technique. Il est possible d’utiliser d’autres tissus ; Assurez-vous que l’objectif du microscope optique à utiliser est adapté au type de tissu. Il est nécessaire de pouvoir voir et identifier les cellules à mesurer.
3. Histopathologie
   1. Après avoir coloré les coupes tissulaires à l’hématoxyline-éosine³², examinez 5 à 10 coupes histologiques sous des objectifs 10x, 20x, 40x et 100x.
   2. Recherchez des changements tissulaires et estimez l’indice de degré de changements tissulaires (DTC) tel que décrit par Bernet et ^al.32 à l’aide de l’équation (4) :
      DTC = Σalt. (une × w)    (4)
      où Σalt est la somme de l’altération ; a représente le stade des dommages (0, absent ; 1, faible ; 2, modéré ; 3, élevé) ; et W représente le degré de réversibilité des dommages (1, réversible ; 2, partiellement réversible ; 3, irréversible).
      REMARQUE : Ici, le foie a été utilisé comme modèle pour décrire la technique. Il est possible d’utiliser d’autres tissus ; Assurez-vous que l’objectif du microscope optique à utiliser est adapté au type de tissu.
4. Système pigmentaire
   1. Après avoir coloré les lames à l’hématoxyline-éosine, examinez 10 à 20 photomicrographies avec un objectif 20x.
   2. Quantifier la surface occupée par la mélanine en mesurant les différences d’intensité de coloration à l’aide du logiciel Image Pro-Plus, selon Santos et ^al.33.
   3. Ouvrez le logiciel Image Pro Plus 6.0®.
   4. Sélectionnez Menu et barre d’outils : Biologique.
   5. Sélectionnez l’étalonnage spatial du grossissement utilisé pour prendre les photomicrographies.
   6. Ouvrez une image histologique.
   7. Sélectionnez Nombre d’outils | Mesurez des objets.
   8. Cliquez sur le bouton Sélectionner les couleurs .
   9. Sélectionnez l’outil compte-gouttes et marquez la coloration à mesurer dans l’image.
   10. Fermez la fenêtre et cliquez sur Compter.
   11. Sélectionnez Afficher | Statistiques pour voir les résultats.

3. Niveau biochimique : Espèces réactives de l’oxygène (ROS) et enzymes cholinergiques

1. Homogénéisation des échantillons
   REMARQUE : Une fois l’expérience terminée, conservez les échantillons (tissus ou têtards) dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) s’ils ne doivent pas être traités à ce moment-là par congélation à -20 °C (pendant 2 mois) ou à -80 °C (pendant 6 mois). Alternativement, ils peuvent être homogénéisés à ce moment-là selon les recommandations proposées ci-dessous.
   1. Têtards
      1. Pesez 1 g d’un têtard ou d’une mare de têtards sur une balance analytique de précision.
      2. Placez 1 g de têtards dans un tube conique de 15 ml contenant 1 ml de PBS et plongez-le dans un bain de glace (4 °C).
      3. Homogénéiser à l’aide d’un homogénéisateur à pointe en téflon adapté à un tube conique, et travailler dans des conditions froides (4 °C).
         ATTENTION : Évitez d’utiliser un nombre élevé de tours, car cela pourrait détruire les protéines et augmenter la température.
      4. Transférez le même volume d’homogénat liquide de chaque échantillon dans deux tubes de microcentrifugation de 2 mL étiquetés et travaillez dans des conditions froides (4 °C).
      5. Centrifuger les échantillons avec l’homogénat liquide pendant 10 min à 4 °C et 9 520 × g.
      6. Enfin, extrayez le surnageant, placez-le dans des tubes de microcentrifugation, étiquetez-le avec des aliquotes de 0,5 mL à 1 mL et conservez-le au congélateur à -80 °C (pendant 6 mois) ou -20 °C (pendant 2 mois) jusqu’au dosage enzymatique.
   2. Adulte
      1. Prélever le tissu d’intérêt (p. ex. foie, muscle, rein) et peser 1 g sur une balance d’analyse de précision.
      2. Placez le mouchoir dans un tube conique de 50 ml contenant 1 ml de PBS et plongez-le dans un bain de glace (4 °C).
      3. Homogénéiser à l’aide d’un homogénéisateur à pointe de téflon adapté à un tube conique, et travailler à froid (4 °C).
         ATTENTION : Évitez d’utiliser un régime élevé, car cela pourrait détruire les protéines et augmenter la température.
      4. Transférez le même volume d’homogénat liquide de chaque échantillon dans deux tubes de microcentrifugation de 2 mL étiquetés et travaillez à froid (4 °C).
      5. Centrifuger les tubes avec l’homogénat de liquide pendant 10 min à 4 °C et 9 520 × g.
      6. Enfin, extrayez le surnageant, placez-le dans des tubes de microcentrifugation, étiquetez-le avec des aliquotes de 0,5 mL à 1 mL et conservez-le au congélateur à −80 °C (pendant 6 mois) ou −20 °C (pendant 2 mois) jusqu’au dosage enzymatique.
2. Détermination des protéines
   REMARQUE : La valeur protéique est obtenue pour estimer l’activité enzymatique par rapport à la quantité totale de protéines tout en évitant la sous-estimation ou la surestimation des valeurs d’activité enzymatique. Cette méthodologie est basée sur Bradford³⁴ avec des modifications mineures pour les anoures :
   1. Préparez le réactif Bradford (voir tableau 1).
   2. Ajouter 100 mL de H₃PO₄ à 85 % (p/v) à Coomassie G-250 + éthanol, et porter à un volume de 1 L avec de l’eau distillée.
   3. Préparer la courbe d’étalonnage en utilisant l’albumine sérique bovine (BSA) comme étalon protéique connu (tableau 1).
   4. Préparer des étalons d’albumine à des concentrations croissantes pour une cuvette de spectrophotomètre de 3 mL. Pour un exemple de la courbe standard, voir le tableau 2.
   5. Mesurez l’absorbance à l’aide d’un spectrophotomètre à 590 nm (c’est la longueur d’onde à laquelle le complexe du réactif et de la protéine se forme).
      REMARQUE : La réalisation de la réaction de Bradford avec l’échantillon pour lecture dans le spectrophotomètre à l’aide d’une cuvette en verre d’un volume maximal de 3 mL et d’un trajet optique de 1 cm facilite la détermination de la protéine.
   6. Placez les réactifs suivants dans une cuvette dans l’ordre suivant : 2 000 μL du réactif de Bradford + X μL de l’échantillon (X = 20 μL de l’échantillon d’homogénat de l’organe d’intérêt d’un anuran adulte, ou 40 μL de l’échantillon d’homogénat d’un têtard).
   7. Enfin, mesurez l’absorbance dans le spectrophotomètre à 590 nm.
      REMARQUE : Il n’est pas nécessaire de travailler à 4 °C.
3. Catalase
   REMARQUE : Cette méthodologie est basée sur Aebi³⁵ avec des modifications mineures pour les anoures.
   1. Incuber 1 900 μL de PBS + 40 μL de peroxyde d’hydrogène (H,₂, 0,₂) + 20 μL de l’échantillon (pur chez les têtards et dilué 1/25 pour les tissus adultes) dans une cuvette de quartz de 3 mL avec une longueur de trajet de 1 cm.
      ATTENTION : Suivre l’ordre indiqué ci-dessus pour l’ajout des réactifs et de l’échantillon pendant l’incubation. Les réactifs peuvent être incubés à température ambiante (25 °C) car les anoures sont physiologiquement ectothermes.
   2. Lire la cinétique de la catalase à 240 nm pendant 2 min dans un spectrophotomètre UV.
   3. Calculez l’activité enzymatique à l’aide de l’équation suivante (5)³⁵ :
      k (mmol∙^min-1∙^mg-1 Prt) = (Δ absorbance/1 000)/concentration en protéines (5)
      REMARQUE : Dans les études avec des préparations enzymatiques purifiées, l’activité spécifique k'0 est obtenue en divisant k par le coefficient d’extinction molaire, (e = 43,6) ; k' = (k/e).
4. Glutathion S-transférase (GST)
   REMARQUE : Cette méthodologie est basée sur Habig et ^al.36 avec des modifications mineures pour les anoures.
   1. Incuber 300 μL de GST + 10 μL de 1-choro-2, 4-dinitrobenzène (CDNB) (0,1 M) + 10 μL de l’échantillon (pur chez les têtards et dilué 1/25 pour les tissus adultes) dans la cuvette.
      ATTENTION : Respectez l’ordre d’ajout des réactifs et de l’échantillon indiqué ci-dessus lors de l’incubation. Les réactifs peuvent être incubés à température ambiante (25 °C) car les anoures sont physiologiquement ectothermes.
   2. Préparez la TPS (tableau 1).
   3. Lire la cinétique GST à 340 nm pendant 2 min dans le spectrophotomètre.
   4. Calculez l’activité enzymatique à l’aide de l’équation suivante (6) :
      Taux d’activité de la GST (mmol/par minute/mg de protéines) = ([Δ absorbance/1 000]/9,6 × 10⁴)/concentration protéique (6)
      Où 9,6 mM⁻¹ cm⁻¹ = coefficient d’extinction molaire.
5. Peroxydation lipidique (TBARS)
   REMARQUE : Cette méthodologie est basée sur Buege et Aust³⁷ avec des modifications mineures pour les anoures.
   1. Construire une courbe d’étalonnage avec MDA comme norme et 0,7 % TBA (tableau 3).
   2. Préparez la solution MDA standard (10 mM) (Tableau 1). Effectuer l’hydrolyse du THP en MDA en plaçant la solution dans un bain-marie à 50 °C pendant 1 h.
   3. Préparez une solution à 0,7 % (p/v) d’ATB (tableau 1) à l’aide d’un agitateur magnétique à plaque chauffante.
   4. Ensuite, centrifuger l’échantillon s’homogénat pendant 30 min à 9 520 × g et 4 °C.
   5. Extraire 500 μL de surnageant, ajouter 100 μL de NaOH 6 M et placer dans un bain thermal à 60 °C pendant 30 min.
   6. Après le bain thermal, ajoutez 250 μL de HClO₄ à 35 %, puis placez dans un bain de glace (4 °C) pendant 30 min.
   7. Après cette période, centrifuger à 9 520 × g pendant 12 min et extraire 300 μL de surnageant.
   8. Ajouter 300 μL de TBA à 0,7 % dans le surnageant (échantillon) et placer dans un bain thermal (97,5 °C) pendant 30 min.
   9. Lire l’absorbance du complexe formé par l’échantillon et l’ATB à 532 nm, et déterminer la concentration de MDA dans les échantillons en substituant les valeurs d’absorbance dans l’équation de la courbe (figure 1).
6. Acétylcholinestérase (AChE)
   REMARQUE : Cette méthode est basée sur celle proposée par Ellman et ^al.38 , avec des modifications mineures pour les anoures.
   1. Au moment de la mesure, mettre en place les réactifs DTNB et iodure d’acétylthiocholine (ATCh).
   2. Préparez la réaction DTNB (Tableau 1).
   3. Préparez la réaction AChE (Tableau 1).
   4. Dans une cellule de verre avec un trajet optique de 1 cm, préparez la réaction AChE en plaçant ces réactifs dans l’ordre suivant : 150 μL de tampon PBS (pH = 8) + 150 μL de DTNB + 50 μL d’ATCh + 10 μL de l’échantillon (pur chez les têtards et dilué 1/10 chez les anoures adultes).
   5. Lire la cinétique AChE à 412 nm pendant 2 min à température ambiante.
   6. Obtenir la valeur de l’activité AChE à l’aide de l’équation suivante (7) :
      Taux d’activité de l’AChE (protéine mmol∙^min-1∙^mg-1 ) = ([Δ absorbance/1 000]/1,36)/concentration protéique (7)

4. Niveau génétique et cellulaire : test du micronoyau et de la comète

1. Dosage du micronoyau (MN)
   NOTE : La méthodologie est en accord avec celle proposée par Fenech³⁹ avec de légères modifications pour les anoures néotropicaux.
   1. Anesthésier les échantillons par immersion dans de l’eau glacée (4 °C), et obtenir des échantillons de sang par sectionnement derrière l’opercule chez les têtards ou par ponction cardiaque chez l’adulte.
   2. Étalez deux gouttes de sang périphérique des échantillons sur des lames pré-nettoyées.
   3. Ensuite, faites sécher les lames à l’air, fixez-les avec du méthanol froid à 100 % (v/v) (4 °C) pendant 20 min, puis colorez-les avec une solution de Giemsa à 5 % pendant 12 min.
   4. Demandez à un chercheur de coder et de coder à l’aveugle les diapositives à un grossissement de 1 000x.
   5. Déterminez la fréquence des MN en analysant 1 000 érythrocytes matures de chaque échantillon, et exprimez-la en nombre total de MN pour 1 000 cellules.
   6. Utilisez les critères suivants pour l’identification correcte des MN :
      1. Recherchez des MN dont le diamètre est inférieur à 1/3 de celui du noyau principal.
      2. Assurez-vous que la coloration du MN n’est pas réfractaire mais a une intensité de coloration égale ou plus claire que celle du noyau principal.
      3. Recherchez une limite MN qui se distingue de la limite du noyau principal sans aucune connexion avec le noyau ou chevauchement avec le noyau principal.
      4. S’assurer que le nombre de MN dans les cellules ne dépasse pas plus de quatre MN associés au noyau.
2. Dosage des comètes ou électrophorèse sur gel unicellulaire (ECGE)
   1. Anesthésie les échantillons par immersion dans de l’eau glacée et obtention d’échantillons de sang par sectionnement derrière l’opercule chez les têtards ou par ponction cardiaque chez l’adulte.
   2. Diluer le sang avec 1 mL de PBS, centrifuger (381 × g, 9 min) et remettre en suspension dans un volume final de 50 mL de PBS.
   3. Mélangez 30 μL de l’échantillon de sang dans 70 μL d’agarose à bas point de fusion (LMPA) à une concentration de 0,5 % d’agarose pour former la couche 2. Par la suite, placez 50 μL de la couche 2 sur une lame préalablement recouverte de la couche 1 contenant 100 μL d’agarose à point de fusion normal à 0,5 %.
   4. Recouvrez la lame d’une lamelle et placez-la au froid (4 °C) pendant 10 minutes pour solidifier la couche 2.
   5. Après solidification, retirez la lamelle et formez la troisième couche en déposant 100 μL de LMPA à 0,5 %.
   6. Lorsque la troisième couche se solidifie, retirer la lamelle et immerger chaque lame dans un bocal Coplin de 100 mL contenant une solution de lyse (tableau 1) préparée le même jour et conservée à 4 °C. Placez les bocaux Coplin dans un bain froid pendant 1 h dans l’obscurité (4 °C) pour que la lyse se produise.
      REMARQUE : L’expérience peut être mise en pause et recommencée plus tard. La période de lyse aurait duré de 1 h à 1 mois.
   7. À la fin de la lyse, retirer les lames et les immerger dans la solution tampon d’électrophorèse (tableau 1) dans la cuve d’électrophorèse. Effectuez cette étape dans l’obscurité pendant 15 min à 4 °C pour permettre à l’ADN de se détendre. Après le déroulement de l’ADN nucléaire, effectuez une électrophorèse sur le même tampon à une température de 4 °C pendant 10 min à 25 V et 250 mA.
   8. A la fin de l’électrophorèse, neutraliser les échantillons contenus dans les lames 3 x 5 min en ajoutant 2 mL de solution de Tris-HCl (Tableau 1).
   9. Dans la dernière étape de la technique de dosage des comètes, déshydratez les échantillons en les plaçant dans des bocaux Coplin de 100 mL contenant de l’alcool (95 %) à 4 °C.
   10. Enfin, colorez les échantillons en plaçant 10 μL de 4′,6-diamino-2-phénylindole (DAPI) au centre de la lame et placez une lamelle qui étale le colorant dans les échantillons. Examinez les lames sous un photomicroscope à fluorescence avec un filtre WB.
       ATTENTION : L’ensemble du processus doit être effectué dans l’obscurité pour éviter la photodégradation de l’ADN.
   11. Quantifiez les dommages à l’ADN en évaluant la durée de migration de l’ADN à partir du nucléoïde. Dans ce cas, déterminez visuellement sur 100 cellules sélectionnées au hasard sans chevauchement. Classez les dommages à l’ADN en quatre classes : 0-I (aucun dommage), II (dommages minimums), III (dommages moyens) et IV (dommages maximums). Exprimez les données sous forme de nombre moyen de cellules endommagées (somme des classes II à IV) et de score moyen de comète pour chaque groupe de traitement. À partir de ces données, calculer l’indice d’atteinte génétique (IDG) pour chaque organisme d’essai à l’aide de l’équation suivante (8) :
       IDB = (1[I] + 2[II] + 3[III] + 4[IV])/N[I-IV]) (8)
       où I-IV représentent le type de lésion nucléoïde, et NI-NIV représentent le nombre total de nucléoïdes notés selon Pitarque et ^al.40.

5. Biomarqueurs corrélés

REMARQUE : Ces derniers temps, les biomarqueurs peuvent être intégrés à tous les niveaux en utilisant l’indice de réponse aux biomarqueurs (IBR) proposé par Beliaeff et Burgeot⁴⁹ et adapté pour les anoures néotropicaux. L’IBR fournit une valeur numérique qui intègre toutes les réponses des biomarqueurs ; des valeurs IBR plus élevées indiquent des niveaux de stress plus élevés⁴⁹. En ce qui concerne l’estimation de l’IBR pour une station donnée ou le traitement d’un levé donné, les étapes successives de traitement des données pour déterminer le score final sont les suivantes :

1. Calculer l’estimation moyenne (X) lorsque les résultats individuels sont disponibles ; Sinon, utilisez la valeur de l’échantillon regroupé à chaque station d’échantillonnage.
2. Pour chaque biomarqueur, calculer la moyenne générale (m) et l’écart-type (s) de X pour toutes les stations et/ou relevés, en fonction des comparaisons à faire.
3. Normalisez X pour obtenir Y. Calculez une valeur appelée Y : Y = (X- m)/s.
4. Calculez la valeur Z comme suit : Z = Y ou Z = −Y, dans le cas d’un effet biologique correspondant, respectivement, à une inhibition ou à une activation en réponse à un facteur de stress.
5. Enfin, calculez le score (S), avec S = Z + |Min|, où S ≥ 0 et |Min| est la valeur absolue minimale déterminée.
6. Tracez un diagramme en étoile ou en étoile après avoir calculé la valeur de S pour chaque biomarqueur (Si) et effectué la sommation pour obtenir l’IBR.
   REMARQUE : reportez-vous au document^{original 49} pour plus de détails sur les calculs.

Résultats

Toutes les techniques de biomarqueurs présentées ici sont des méthodes simples, rapides, pratiques, sensibles, peu coûteuses et précises. Pour chaque biomarqueur, il est important de noter ce qui suit.

Niveau individuel
Indice de masse échelonné
La prise de photos à l’échelle millimétrique est d’une grande importance car cette valeur sera utilisée pour calibrer le logiciel, ce qui se traduit par une meille...

Discussion

Les biomarqueurs au niveau individuel sont très simples à déterminer et très peu coûteux, car l’examen de ces biomarqueurs ne nécessite que quelques pièces d’équipement qui sont généralement disponibles dans n’importe quel laboratoire de recherche. De plus, ces biomarqueurs fournissent des informations générales sur la santé et la forme physique des animaux. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque protocole est essentiel pour obtenir des résultats fiables. En rais...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Analytical scale
Electrophoresis power supply	Enduro	E0203-250V
Eosin	Merck
Fluorescence photomicroscope	Olympus	BX50	Equipped with an appropriate filter combination
Hematoxylin of Harris	Merck
High resolution photo camera			>16 megapixels
Homogenizer
Horizontal electrophoresis chamber	Sigma
Microcentrifuge	Denver Instrument
Microscope	Leica	DM4000 B	Equipped with image capture system Leica DFC 280
Microtome	Leica	2265
Paraplast	Sigma	P3558
Personal Computer			Eqquiped with Mac OS X, Lynux or Windows
Refrigerated centrifuge
UV–Vis spectrophotometer	Rayleigh	723G	With UV-lamp