Ökotoxikologische Methoden zur Bewertung von Biomarkern auf verschiedenen Skalen in neotropischen Anuren

Zusammenfassung

In dieser Arbeit werden standardisierte ökotoxikologische Methoden zur Bewertung von Biomarkern in neotropischen Anura-Arten vorgestellt. Insbesondere werden in diesem Artikel verschiedene Methoden auf verschiedenen Ebenen der ökotoxikologischen Bewertung beschrieben, wie z. B. auf genetischer, zellulär-histologischer, biochemischer, morphologischer und individueller Ebene.

Zusammenfassung

Die neuen Fragestellungen in der Ökotoxikologie unterstreichen die Bedeutung der Anwendung einer Batterie von Biomarkern, da dies zu ökotoxikologischen Vorhersagen führt, die nicht nur die Interpretation der Auswirkungen von Umweltstressoren auf Organismen, sondern auch die Bestimmung ihrer möglichen Auswirkungen verbessern. Es ist allgemein bekannt, dass die Verwendung ökotoxikologischer Biomarker auf verschiedenen Organisationsebenen die Vorhersage der biologischen Reaktionen von Organismen auf Umweltstressoren ermöglicht, was für die Bewertung von Umweltrisiken nützlich ist.

Nichtsdestotrotz ist es notwendig, die Optimierung grundlegender Verfahren in Betracht zu ziehen, historische Daten in Kontrollgruppen zu generieren und spezifische Bioassays zur Bewertung des Ansprechens in Organen und Geweben einzusetzen, um die Art und Variation der beobachteten Effekte aufzuklären. Daher zielt die vorliegende Arbeit darauf ab, verschiedene ökotoxikologische Methoden zu beschreiben, die in allen Stadien neotropischer Anuren auf verschiedenen ökologischen Ebenen eingesetzt werden, und sie als nützliche Biomarker zu validieren, die sowohl in Wildtieren als auch unter Laborbedingungen eingesetzt werden können. In dieser Arbeit wurden diese Biomarker auf individueller/organismischer Ebene (Body Condition Index), histologischer/physiologischer Ebene (histopathologische, histometrische und pigmentäre Analysen), biochemischer Ebene (oxidative Stressenzyme) und genetischer Ebene (direkte und oxidative Schädigung der DNA durch Kometenassay) angewendet.

Obwohl diese Methoden je nach Art kleine Variationen oder Modifikationen aufweisen, bieten diese Techniken wirksame Biomarker für die Bewertung der Wirkung von Xenobiotika auf Anurane, die bestimmte Eigenschaften besitzen, die sie zu nützlichen Indikatorarten aquatischer und terrestrischer Ökosysteme machen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass sich die in der vorliegenden Studie verwendete Batterie von Biomarkern als ausreichend für die Abschätzung toxischer Reaktionen bei neotropischen Anuren erwiesen hat und als Bioindikatoren zur Identifizierung der Auswirkungen von Schadstoffen auf die aquatischen Ökosysteme der Region empfohlen werden kann. Schließlich wird empfohlen, die Standardisierung dieser wichtigen Biomarker für Anuren in bestimmten Regionen zu erreichen und sie möglicherweise in Risikobewertungen und Entscheidungsfindungen einzubeziehen.

Einleitung

Der Eintrag von Umweltstressoren in natürliche Gewässer kann die Gesundheit des aquatischen Ökosystems beeinträchtigen¹. Die Exposition gegenüber diesen Umweltstressoren kann das Überleben oder die Fitness von Wasserorganismen durch verschiedene Toxizitätsmechanismen beeinträchtigen, einschließlich der direkten Exposition (sowohl kurz- als auch langfristig)². Daher können standardisierte Labor-Bioassays zur Bewertung toxikologischer Endpunkte in Bezug auf Fitness und Überleben eine unzuverlässige Abschätzung der vielen indirekten Auswirkungen von Stress im Feld sein. Darüber hinaus können Veränderungen des normalen physiologischen Niveaus und Auswirkungen auf Individuen, z. B. in Bezug auf den Beutefang, bessere langfristige Indikatoren für die Auswirkungen auf das Überleben und die Fortpflanzungsfähigkeit von Organismen und letztlich auf die Gesundheit des Ökosystems sein ^1,3. Die Vorhersage von Veränderungen der Zusammensetzung und Funktion von Ökosystemen sowie der Gesundheit von Organismen auf der Grundlage eines bekannten Satzes von Umweltparametern und Schadstoffkonzentrationen ist wichtig für die Verbesserung des Verschmutzungsmanagements¹.

Biomarker sind definiert als biochemische, physiologische oder histologische Veränderungen, die entweder auf die Exposition gegenüber oder die Auswirkungen xenobiotischer Chemikalien zurückzuführen^{sind 4,5}. Biomarker haben sich als Frühwarnsignale als sehr nützlich erwiesen ^4,5. Eine wichtige Frage, die Biomarker beantworten helfen, ist, ob bestimmte Stressoren in der Umwelt in ausreichenden Konzentrationen vorhanden sind, um nachteilige Auswirkungen zu haben. Diese Informationen tragen zur Beurteilung bei, ob es sich lohnt, Art und Ausmaß des Schadens und die Verursacher zu untersuchen oder ob in diesem Fall keine weiteren Ressourcen investiert werden sollten ^6,7,8. Da das Konzept, einen einzelnen Biomarker als Bioindikator zu bewerten, möglicherweise nicht ausreichend ist 5,7,8,9,10, gibt es einen zunehmenden Trend zu einer umfassenden Bewertung mehrerer Biomarker, um Frühwarnzeichen zu erkennen und so irreversible Auswirkungen auf Ökosysteme zu verhindern.

Es ist sehr wichtig zu beachten, dass alle toxischen Wirkungen mit der Wechselwirkung eines Stressors mit Biomolekülen beginnen. In diesem Sinne können Effekte durch die biochemische, subzelluläre, zelluläre, Gewebe-, Organ-, Individuen-, Populations-, Gemeinschafts-, Ökosystem-, Landschafts- und biosphärische Organisationsebene kaskadieren. Zellen sind der primäre Interaktionsort zwischen Umweltstressoren und biologischen Systemen. Das Verständnis molekularer und genetischer Effekte ermöglicht es den Forschern, ein niedriges und ein hohes Maß an ökologischer Organisation miteinander zu verknüpfen, und hilft ihnen, die Auswirkungen von Umweltschadstoffen, z. B. auf die menschliche Gesundheit, vorherzusagen, die noch nicht getestet wurden⁵. Darüber hinaus sind sie aufgrund der hohen Spezifität der Zellen nicht nur für die Bewertung von Umweltschadstoffen, sondern auch für die menschliche Gesundheit nützlich ^5,11. Daher kann das Verständnis der Auswirkungen von Stressoren auf biochemischer Ebene Einblicke in die Ursachen der beobachteten Effekte geben und es ermöglichen, sie mit denen auf der nächsthöheren Ebene in Verbindung zu bringen⁵. Darüber hinaus können durch das Verständnis der biochemischen Mechanismen von Stressoren die Auswirkungen neuer Stressoren, die noch nicht toxikologisch bewertet wurden, in Bezug auf andere bekannte Kontaminanten aufgrund ihrer Ähnlichkeiten in der Funktion vorhergesagt werden. In Gegenwart verschiedener Umweltstressoren können genetische und biochemische Biomarker wertvolle Informationen über die beobachteten spezifischen Wirkungen liefern. Darüber hinaus können histochemische Untersuchungen im Zusammenhang mit biochemischen Veränderungen Aufschluss über die Toxikodynamik^{geben 5}. Kurz gesagt, eine umfassende Analyse zellulärer, biochemischer und histologischer Biomarker ist notwendig^10,12, und diese Art der Analyse sollte wiederum in Biomonitoring-Programme für lokale Spezies aufgenommen werden ^5,13,14.

Die Untersuchung von Biomarkern unter Laborbedingungen kann jedoch einige Schwierigkeiten mit sich bringen, darunter Schwierigkeiten beim Nachweis subletaler und chronischer Wirkungen nach Schadstoffexposition und bei der Validierung und Standardisierung der angewandten Methoden, sowie die komplexen zeit- oder dosisabhängigen Reaktionen, die unklaren oder unbestimmten Zusammenhänge mit der Fitness und das Fehlen integrierter mechanistischer Modelle^{1. 4}. Anmelden Um diese Probleme zu lösen, besteht die Lösung nicht darin, die Anzahl der gemessenen Biomarker zu erhöhen, sondern darin, sorgfältig Studien und überprüfbare Hypothesen zu entwerfen, die dazu beitragen, die mechanistischen Grundlagen chemischer Wirkungen auf ganze Organismen zu erklären⁴.

Die neuen Fragen in der Ökotoxikologie unterstreichen, wie wichtig es ist, eine Reihe von Biomarkern anzuwenden, um ökotoxikologische Vorhersagen zu erstellen, die die Interpretation der Auswirkungen von Umweltstressoren auf Organismen sowie die Entscheidungsfindung über ihre möglichen Auswirkungen verbessern. Darüber hinaus ist die Kombination beider Konzepte - Biomarker und Bioindikatoren - bei Umweltrisikobewertungen und Biomonitoring von großer Bedeutung, da die Forscher so feststellen können, ob Organismen in einer bestimmten Umgebung von Interesse physiologisch normal oder gestresst sind. Der in dieser Studie verfolgte Ansatz ähnelt dem der biochemischen Analyse, die am Menschen durchgeführt wird. In diesem Sinne kann eine Reihe von Biomarkern analysiert werden, um festzustellen, ob ein Organismus sowohl im Feld als auch im Labor gesund ist⁶. Schließlich werden Biomarker auf zweierlei Weise zur ökologischen Risikobewertung beitragen: (1) zur Bewertung der Exposition seltener und/oder langlebiger Arten und (2) zum Testen von Hypothesen über die Mechanismen chemischer Auswirkungen auf verschiedenen Ebenen der biologischen Organisation⁴.

In den letzten zehn Jahren wurden Biomarker in Anuranen für das Biomonitoring der Exposition gegenüber zytotoxischen und genotoxischen Kontaminanten verwendet. Zu den am häufigsten verwendeten Techniken gehören der Mikronukleus-Assay (MN) und der Comet-Assay oder die Induktion von einzelsträngigen DNA-Brüchen durch einen Einzelzell-Gelelektrophorese-Assay (SCGE). Darüber hinaus wurden diese Techniken erfolgreich eingesetzt, um die DNA-Schäden abzuschätzen, die durch verschiedene Umweltstressoren bei mehreren neotropischen Anuren induziert werden 14,15,16,17,18,19. Andere Biomarker können verwendet werden, um Veränderungen des oxidativen Status von Organismen zu untersuchen, die Umweltschadstoffen ausgesetzt sind 16,17,18,19. Oxidativer Stress ist eine Reaktion auf die Exposition gegenüber verschiedenen Xenobiotika, was zu mehreren nachteiligen Auswirkungen führt, einschließlich auf die antioxidative Kapazität der exponierten Personen 5,6,7,19,20.

In ökotoxikologischen Studien werden Bioindikatorarten verwendet, da es sich um Organismen handelt, die die langfristigen Wechselwirkungen und nachteiligen Auswirkungen von Umweltstressoren auf höheren Organisationsebenen (z. B. Organismus-, Populations-, Gemeinschafts- und Ökosystemebene) identifizieren10,20,21. Durch die Integration der beiden Konzepte - Biomarker und Bioindikatoren - können Spezies gescreent werden, um biochemische, physiologische oder ökologische Strukturen oder Prozesse zu definieren, die mit gemessenen biologischen Effekten auf einer oder mehreren Ebenen der biologischen Organisation korreliert oder verknüpft sind. Die große Herausforderung bei der Nutzung beider Konzepte zur Verbesserung der Abschätzung der Toxizität eines Stressors bezieht sich schließlich auf die Analyse von Biomarkern und Bioindikatoren, die einen hohen Nutzen für die Bewertung ökologischer Risiken haben²⁰. In diesem Sinne besteht Einigkeit über die Relevanz des Einsatzes von Biomarkern und Bioindikatoren als Frühwarnzeichen, da sie relevante Informationen über die Reaktion eines Testorganismus auf Umweltstressoren liefern 12,20,21.

Amphibien sind eine der am stärksten bedrohten und am schnellsten schrumpfenden Organismengruppen weltweit. Einer der Hauptgründe für diesen Rückgang sind Schadstoffe, die in ihren Lebensraum gelangen, wie Pestizide, Metalle und neu auftretende Schadstoffe 22,23,24,25. Anurane haben mehrere Eigenschaften, die sie als Bioindikatorarten nützlich machen, wie z. B. ihre durchlässige Haut, ihre enge Beziehung zum Wasser und ihre Empfindlichkeit gegenüber Umweltverschmutzung ^2,23,24. Diese Eigenschaften machen Amphibien zu effektiven Bioindikatoren für die Umweltgesundheit 7,8,22,23,24,26.

Dennoch ist es notwendig, nicht nur die Optimierung grundlegender Verfahren und die Generierung historischer Daten in Kontrollgruppen in Betracht zu ziehen, sondern auch spezifische Bioassays zur Bewertung des Ansprechens in Organen und Geweben einzusetzen, um die Art und Variation der bei Bioindikatoren beobachteten Wirkungen aufzuklären. In diesem Sinne zielt die vorliegende Arbeit darauf ab, verschiedene ökotoxikologische Methoden zu beschreiben, die in allen Stadien neotropischer Anuren auf verschiedenen ökologischen Ebenen eingesetzt werden können, und sie als nützliche Biomarker zu validieren, die sowohl in Wildtieren als auch unter Laborbedingungen eingesetzt werden können. Diese Arbeit stellt eine Reihe von Biomarkern vor, die integriert werden können und die sich für das Labor- und Wildtier-Biomonitoring bei Anuranen, die Umweltstressoren ausgesetzt waren, bewährt haben.

Protokoll

Zu den folgenden Techniken gehören die vorherige Opferung des Tieres, die in Übereinstimmung mit den internationalen ethischen Standards 46,47,48 durchgeführt wurde, und die anschließende Dissektion und Ablation der Organe. Die Tiere wurden mit Genehmigung des Ministeriums für Umwelt, Landwirtschaft und Produktion der Provinz San Luis gefangen (Resolution 49-PMA2019). Die Methoden der Tötung und Euthanasie der Tiere wurden durch die Protokolle des Institutionellen Ausschusses für Tierpflege und -verwendung (CICUA, Protokoll Q-322/19) der Nationalen Universität von San Luis ordnungsgemäß genehmigt. Die Eingriffe mit Anura-Organismen wurden nach den Richtlinien von Garber et ^al.46, CONICET⁴⁷ und INTA⁴⁸ durchgeführt. Darüber hinaus beziehen sich alle hier vorgestellten Protokolle auf neotropische Anura-Arten in ihren Larven- und adulten Lebensstadien; Sie wurden bereits von lokalen Forschern weitgehend akzeptiert und werden nach einem strengen Protokoll und mit Genehmigung des "Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (CICUA)" jeder beteiligten Universität durchgeführt. Eine Liste der verwendeten Materialien und Lösungen ist in der Werkstofftabelle und in Tabelle 1 enthalten.

1. Individuelle Ebene: Körperzustand und Leber- und Gonadenindex

1. Körperzustandsindex: Skalierter Massenindex
   HINWEIS: Dieser Index kann sowohl bei adulten Tieren als auch bei Jungtieren und Larven verwendet werden. Diese Methodik basiert auf Peig und Green²⁷, mit geringfügigen Modifikationen für Anuren nach Brodeur et ^al.28,30 und MacCracken und Stebbings²⁹.
   1. Erfassen Sie die Körpermasse jeder Probe mit einer Präzisionsanalysewaage.
   2. Legen Sie jedes Exemplar auf ein Millimeterblatt und machen Sie ein Foto in einem Abstand von ~15 cm.
      HINWEIS: Es ist wichtig, immer aus der gleichen Entfernung zu fotografieren.
   3. Fotoanalyse:
      HINWEIS: Die Fotos können mit dem Programm ImageJ analysiert werden, das online kostenlos verfügbar ist (https://imagej.nih.gov/ij/index.html), oder mit jedem anderen Bildanalyseprogramm, das Messungen von einer im Foto enthaltenen Skala ermöglicht.
      1. Messen Sie die Schnauzen-Entlüftungslänge (SVL) jeder Probe mit dem Messwerkzeug aus dem ImageJ-Programm und beziehen Sie sich zunächst auf ein bekanntes Maß im Millimeterblatt.
         HINWEIS: Bei Kaulquappen muss die Messung der Körperlänge bis zur Kloakenröhre erfolgen, ohne Berücksichtigung der Schwanzflosse.
   4. Skalierter Massenindex (S)
      1. Konstruieren Sie mit den Daten, die Sie aus der Körpermasse und der SVL jedes Anurans erhalten, eine nichtlineare Regressionslinie der Potenzfunktion der Körpermasse (y-Achse) gegen die SVL (x-Achse).
      2. Berechnen Sie die mittlere Länge mit den SVL-Daten aller gemessenen Individuen aus der untersuchten Population.
      3. Berechnen Sie schließlich den skalierten Massenindex (S) nach Peig und Green²⁷ und Brodeur et ^al.28 mit Hilfe von Gleichung (1):
         S = M_i(L₀/L_i)^b (1)
         wobei M_i und L_i die Körpermasse und SVL jeweils vom Individuum i sind; b ist der Skalierungsexponent, der durch eine nichtlineare Potenzfunktionsregression^{geschätzt wird 28}; L₀ ist die mittlere Länge für die untersuchte Population; und S ist die vorhergesagte Körpermasse für das Individuum i, wenn seine SVL auf den Wert L₀ standardisiert ist.
         HINWEIS: Es ist wichtig zu beachten, dass b eine speziesspezifische Konstante ist, die auch bei sexuell dimorphen Spezies geschlechtsspezifisch sein kann.
2. Hepatosomatischer Index: Skalierter Leberindex
   HINWEIS: Was den Body Condition Index betrifft, so kann dieser Index für Personen in allen Entwicklungsstadien verwendet werden. Die Methodik basiert auf Brodeur et ^al.28.
   1. Die SVL jedes Exemplars ist gemäß den Schritten 1.1.2 und 1.1.3 aufzuzeichnen.
   2. Euthanasieren Sie Individuen gemäß den ethischen Standards für Anura-Amphibien 46,47,48.
   3. Entnehmen Sie die gesamte Leber und notieren Sie ihre Masse auf einer Präzisionsanalysewaage auf das Milligramm genau.
   4. Konstruieren Sie mit den Daten aus der Lebermasse und der SVL jedes Anurans eine nichtlineare Regressionslinie der Potenzfunktionsregression der Lebermasse (y-Achse) gegen die SVL (x-Achse).
   5. Berechnen Sie die mittlere Länge mit den SVL-Daten aller gemessenen Individuen aus der untersuchten Population.
   6. Berechnen Sie den skalierten Leberindex (SLI) nach Brodeur et ^al.28 mit Hilfe von Gleichung (2):
      SLI = Lm_i (L₀/L_i)^b (2)
      wobei Lm_i und L_i die Lebermasse und SVL vom Individuum i sind; b ist der Skalierungsexponent, der durch eine nichtlineare Potenzfunktionsregression^{geschätzt wird 28}; L₀ ist die mittlere Länge für die untersuchte Population; und SLI ist die vorhergesagte Lebermasse für das Individuum i, wenn seine SVL auf L₀ standardisiert ist.
3. Gonadenindex: Skalierter Gonadenindex
   HINWEIS: Diese Methodik basiert auf Brodeur et ^al.30 und ist nur bei erwachsenen Personen nützlich. Es ist wichtig zu beachten, dass männliche und weibliche Indizes getrennt analysiert werden müssen, da sie auf unterschiedlichen Skalen variieren.
   1. Die SVL jedes Exemplars ist gemäß den Schritten 1.1.2 und 1.1.3 aufzuzeichnen.
   2. Euthanasieren Sie Individuen gemäß den ethischen Standards für Anura-Amphibien 46,47,48.
   3. Entfernen Sie die rechte und linke Gonaden und zeichnen Sie die Masse auf einer Präzisionsanalysewaage auf das Milligramm genau auf.
   4. Konstruieren Sie mit den Daten aus der Gonadenmasse und SVL jedes Anurans eine nichtlineare Regressionslinie der Potenzfunktionsmasse (y-Achse) gegen SVL (x-Achse), ähnlich wie in Schritt 1.1.4.1 und Schritt 1.2.3.
   5. Berechnen Sie die mittlere Länge mit den SVL-Daten aller gemessenen Individuen aus der untersuchten Population.
   6. Schätzen Sie den skalierten Gonadenindex (SGI) nach Brodeur et ^al.30 für jedes Tier unter Verwendung von Gleichung (3):
      SGI = Gm_i(L₀/L_i)^b (3)
      wobei Gm_i und L_i die Gonadenmasse und SVL aus dem Individuum i sind, b der Skalierungsexponent ist, der durch eine nichtlineare Potenzfunktionsregression von Brodeur et al. geschätzt ^wird.30, L₀ die mittlere Länge für die untersuchte Population ist und SGI die vorhergesagte Gonadenmasse für ein Individuum i ist, wenn seine SVL auf L₀ standardisiert ist.

2. Morphologisch-histologische Ebene

HINWEIS: Für diese Analyse ist es notwendig, histologische Schnitte zu verwenden. Der erste Schritt besteht darin, das Gewebe zu sammeln.

1. Fixierung und Dehydrierung
   1. Verwenden Sie eine Fixierlösung, um die Strukturen zu erhalten. Verwenden Sie für Anuragewebe vorzugsweise Methacarn oder Bouin-Lösung, die über den restlichen Fixierlösungen empfohlen wird (Tabelle 1).
      HINWEIS: Alle Substanzen müssen zum Zeitpunkt der Verwendung gemischt werden.
   2. Kaulquappen oder ein Gewebefragment von 50-100 mg in ein konisches Röhrchen mit 1-2 ml Fixierlösung bei 4 °C für 3 h geben. Waschen Sie das Tuch 30 Minuten lang in der gleichen Menge 70%igen Ethylalkohols.
   3. Legen Sie das Taschentuch in eine frische 70%ige Ethylalkohollösung.
      HINWEIS: Es ist möglich, den Vorgang zu diesem Zeitpunkt für einige Tage zu unterbrechen, bevor Sie mit der Dehydrierung fortfahren.
   4. Dehydrieren Sie das Gewebe in einer Reihe von Alkohollösungen: Ethylalkohol 80% (10 min), Alkohol 90% (10 min), Ethylalkohol 100% (10 min) und Ethylalkohol 100% (10 min).
   5. Diaphanisierung (Clearing) 2 x 10 min in Xylol durchführen.
   6. Das Paraffin in einem Becherglas schmelzen. Weichen Sie das Tuch 10 Minuten lang ein. Entfernen Sie das Gewebe und legen Sie es in eine histologische Form mit geschmolzenem Paraffin. Warten Sie, bis es bei Raumtemperatur fest geworden ist.
   7. Legen Sie 3 μm-Schnitte, die auf einem rotierenden Mikrotom erstellt wurden, auf einen Objektträger.
2. Histometrische Analyse
   1. Die Gewebeschnitte werden mit Hämatoxylin-Eosin³¹ eingefärbt.
   2. Verwenden Sie 10-20 Mikroaufnahmen für Messungen mit einem 100-fach-Objektiv in einem Lichtmikroskop. Analysieren Sie 5-10 Leberzellen in jeder Mikroaufnahme.
      HINWEIS: Hier wurde die Leber als Modell verwendet, um die Technik zu beschreiben. Es ist möglich, andere Gewebe zu verwenden; Stellen Sie sicher, dass das Objektiv des zu verwendenden Lichtmikroskops für die Art des Gewebes geeignet ist. Es ist notwendig, die zu messenden Zellen sehen und identifizieren zu können.
3. Histopathologie
   1. Nach der Färbung der Gewebeschnitte mit Hämatoxylin-Eosin³² sind 5-10 histologische Schnitte unter 10x-, 20x-, 40x- und 100x-Objektiven zu untersuchen.
   2. Suchen Sie nach Gewebeveränderungen und schätzen Sie den Grad der Gewebeveränderungen (DTC) Index, wie von Bernet et ^al.32 unter Verwendung von Gleichung (4) beschrieben:
      DTC = Σalt. (ein × W)    (4)
      wobei Σalt die Summe der Änderung ist; a steht für die Schadensstufe (0, nicht vorhanden; 1, niedrig; 2, mäßig; 3, hoch); und w steht für den Grad der Reversibilität des Schadens (1, reversibel; 2, teilweise reversibel; 3, irreversibel).
      HINWEIS: Hier wurde die Leber als Modell verwendet, um die Technik zu beschreiben. Es ist möglich, andere Gewebe zu verwenden; Stellen Sie sicher, dass das Objektiv des zu verwendenden Lichtmikroskops für die Art des Gewebes geeignet ist.
4. Pigmentäres System
   1. Nach dem Färben der Objektträger mit Hämatoxylin-Eosin werden 10-20 Mikroaufnahmen mit einem 20-fachen Objektiv untersucht.
   2. Quantifizieren Sie die von Melanin eingenommene Fläche durch Messung von Unterschieden in der Färbeintensität mit der Image Pro-Plus-Software nach Santos et ^al.33.
   3. Öffnen Sie die Software Image Pro Plus 6.0®.
   4. Wählen Sie Menü und Symbolleiste: Biologisch.
   5. Wählen Sie die räumliche Kalibrierung der Vergrößerung, die für die Aufnahme der Mikroaufnahmen verwendet wird.
   6. Öffnen Sie ein histologisches Bild.
   7. Wählen Sie Werkzeuganzahl | Messen Sie Objekte.
   8. Klicken Sie auf die Schaltfläche Farben auswählen .
   9. Wählen Sie das Pipettenwerkzeug aus und markieren Sie die Farbe, die im Bild gemessen werden soll.
   10. Schließen Sie das Fenster und klicken Sie auf Anzahl.
   11. Wählen Sie Ansicht | Statistiken , um die Ergebnisse zu sehen.

3. Biochemische Ebene: Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) und cholinerge Enzyme

1. Homogenisierung von Proben
   HINWEIS: Nach Beendigung des Versuchs sind die Proben (Gewebe oder Kaulquappen) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) aufzubewahren, wenn sie zu diesem Zeitpunkt nicht verarbeitet werden sollen, indem sie bei -20 °C (für 2 Monate) oder -80 °C (für 6 Monate) eingefroren werden. Alternativ können sie zu diesem Zeitpunkt gemäß den unten vorgeschlagenen Empfehlungen homogenisiert werden.
   1. Kaulquappen
      1. Wiegen Sie 1 g einer Kaulquappe oder eines Kaulquappenpools auf einer Präzisionsanalysewaage.
      2. Legen Sie die 1 g Kaulquappen in ein konisches 15-ml-Röhrchen mit 1 mL PBS und tauchen Sie es in ein Eisbad (4 °C).
      3. Homogenisieren Sie mit einem Homogenisator mit Teflonspitze, der an ein konisches Rohr angepasst ist, und arbeiten Sie unter kalten Bedingungen (4 °C).
         ACHTUNG: Vermeiden Sie eine hohe Drehzahl, da dies Proteine zerstören und die Temperatur erhöhen kann.
      4. Übertragen Sie das gleiche Volumen des flüssigen Homogenats jeder Probe in zwei markierte 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und arbeiten Sie unter kalten Bedingungen (4 °C).
      5. Zentrifugieren Sie die Proben mit dem flüssigen Homogenat für 10 min bei 4 °C und 9.520 × g.
      6. Zum Schluss extrahieren Sie den Überstand, geben Sie ihn in Mikrozentrifugenröhrchen, markieren Sie ihn in Aliquoten von 0,5 ml bis 1 ml und bewahren Sie ihn in einem Gefrierschrank bei -80 °C (für 6 Monate) oder -20 °C (für 2 Monate) bis zum Enzymassay auf.
   2. Erwachsene
      1. Entfernen Sie das interessierende Gewebe (z. B. Leber, Muskel, Niere) und wiegen Sie 1 g auf einer Präzisionsanalysewaage.
      2. Legen Sie das Gewebe in ein konisches 50-ml-Röhrchen mit 1 ml PBS und tauchen Sie es in ein Eisbad (4 °C).
      3. Mit einem teflonbestückten Homogenisator, der an ein konisches Rohr angepasst ist, homogenisieren und kalt (4 °C) arbeiten.
         ACHTUNG: Vermeiden Sie die Verwendung einer hohen Drehzahl, da dies Proteine zerstören und die Temperatur erhöhen kann.
      4. Das gleiche Volumen des flüssigen Homogenats jeder Probe wird in zwei markierte 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführt und kalt (4 °C) gearbeitet.
      5. Die Röhrchen werden mit dem flüssigen Homogenat 10 min bei 4 °C und 9.520 × g zentrifugiert.
      6. Zum Schluss wird der Überstand extrahiert, in Mikrozentrifugenröhrchen gegeben, in Aliquoten von 0,5 ml bis 1 ml markiert und in einem Gefrierschrank bei -80 °C (für 6 Monate) oder -20 °C (für 2 Monate) bis zum Enzymassay aufbewahrt.
2. Bestimmung von Proteinen
   HINWEIS: Der Proteinwert wird ermittelt, um die enzymatische Aktivität im Verhältnis zur Gesamtproteinmenge abzuschätzen, wobei eine Unter- oder Überschätzung der enzymatischen Aktivitätswerte vermieden wird. Diese Methodik basiert auf Bradford³⁴ mit geringfügigen Modifikationen für Anurane:
   1. Bereiten Sie das Bradford-Reagenz vor (siehe Tabelle 1).
   2. 100 ml H₃PO₄ mit 85 % (p/v) zu Coomassie G-250 + Ethanol geben und mit destilliertem Wasser auf ein Volumen von 1 l bringen.
   3. Die Kalibrierungskurve ist mit Rinderserumalbumin (BSA) als bekanntem Proteinstandard zu erstellen (Tabelle 1).
   4. Bereiten Sie Albuminstandards in steigenden Konzentrationen für eine 3-ml-Spektralphotometerküvette vor. Ein Beispiel für die Standardkurve finden Sie in Tabelle 2.
   5. Messen Sie die Extinktion mit einem Spektralphotometer bei 590 nm (dies ist die Wellenlänge, bei der der Komplex aus dem Reagenz und dem Protein gebildet wird).
      HINWEIS: Die Durchführung der Bradford-Reaktion mit der Probe zum Ablesen im Spektralphotometer unter Verwendung einer Glasküvette mit einem maximalen Volumen von 3 ml und einem optischen Weg von 1 cm hilft bei der Proteinbestimmung.
   6. Geben Sie die folgenden Reaktanten in dieser Reihenfolge in eine Küvette: 2.000 μl des Bradford-Reagenzes + X μl der Probe (X = 20 μl der Homogenatprobe des interessierenden Organs aus einem adulten Anuran oder 40 μl der Homogenatprobe aus einer Kaulquappe).
   7. Messen Sie abschließend die Extinktion im Spektralphotometer bei 590 nm.
      HINWEIS: Es ist nicht erforderlich, bei 4 °C zu arbeiten.
3. Katalase
   HINWEIS: Diese Methodik basiert auf Aebi³⁵ mit geringfügigen Modifikationen für Anuraner.
   1. 1.900 μl PBS + 40 μl Wasserstoffperoxid (H₂0₂) + 20 μl der Probe (rein in Kaulquappen und verdünnt 1/25 für adultes Gewebe) in einer 3 mL Quarzküvette mit einer Schichtdicke von 1 cm inkubieren.
      ACHTUNG: Halten Sie sich während der Inkubation an die oben angegebene Reihenfolge für die Zugabe der Reagenzien und der Probe. Die Reaktanten können bei Raumtemperatur (25 °C) inkubiert werden, da Anurane physiologisch ektotherm sind.
   2. Lesen Sie die Katalase-Kinetik bei 240 nm für 2 Minuten in einem UV-Spektralphotometer ab.
   3. Berechnen Sie die Enzymaktivität mit der folgenden Gleichung (5)³⁵:
      k (mmol∙^min-1∙^mg-1 Prt) = (Δ Extinktion/1.000)/Proteinkonzentration (5)
      ANMERKUNG: In Studien mit gereinigten Enzymzubereitungen wird die spezifische Aktivität k'0 erhalten, indem k durch den molaren Extinktionskoeffizienten dividiert wird (e = 43,6); k' = (k/e).
4. Glutathion-S-Transferase (GST)
   HINWEIS: Diese Methodik basiert auf Habig et ^al.36 mit geringfügigen Modifikationen für Anurane.
   1. 300 μl GST + 10 μl 1-Choro-2, 4-Dinitrobenzeno (CDNB) (0,1 M) + 10 μl der Probe (rein in Kaulquappen und verdünnt 1/25 für adultes Gewebe) in der Küvette inkubieren.
      ACHTUNG: Beachten Sie während der Inkubation die Reihenfolge der Zugabe der Reagenzien und der oben angegebenen Probe. Die Reagenzien können bei Raumtemperatur (25 °C) inkubiert werden, da Anurane physiologisch ektotherm sind.
   2. Bereiten Sie die GST vor (Tabelle 1).
   3. Lesen Sie die GST-Kinetik bei 340 nm für 2 min im Spektralphotometer ab.
   4. Berechnen Sie die Enzymaktivität mit der folgenden Gleichung (6):
      Aktivitätsrate von GST (mmol/pro Minute/mg Protein) = ([Δ Absorption/1.000]/9,6 × 10⁴)/Proteinkonzentration (6)
      Dabei ist 9,6 mM⁻¹ cm⁻¹ = molarer Extinktionskoeffizient.
5. Lipidperoxidation (TBARS)
   HINWEIS: Diese Methodik basiert auf Buege und Aust³⁷ mit geringfügigen Modifikationen für Anurane.
   1. Erstellen Sie eine Kalibrierkurve mit MDA als Standard und 0,7 % TBA (Tabelle 3).
   2. Bereiten Sie die Standard-MDA-Lösung (10 mM) vor (Tabelle 1). Führen Sie die THP-Hydrolyse zu MDA durch, indem Sie die Lösung 1 h lang in ein 50 °C heißes Wasserbad legen.
   3. Bereiten Sie eine 0,7%ige (w/v) Lösung von TBA (Tabelle 1) mit einem magnetischen Heizplattenrührer vor.
   4. Anschließend werden die Probenhomogenate 30 Minuten lang bei 9.520 × g und 4 °C zentrifugiert.
   5. 500 μl des Überstands extrahieren, 100 μl 6 M NaOH zugeben und für 30 min in ein Thermalbad bei 60 °C stellen.
   6. Nach dem Thermalbad 250 μL 35 %_{HClO 4} zugeben und dann für 30 min in ein Eisbad (4 °C) stellen.
   7. Nach dieser Zeit 12 min bei 9.520 × g zentrifugieren und 300 μl des Überstands extrahieren.
   8. 300 μl 0,7 % TBA in den Überstand (Probe) geben und 30 Minuten lang in ein Thermalbad (97,5 °C) stellen.
   9. Lesen Sie die Extinktion des aus der Probe und TBA gebildeten Komplexes bei 532 nm ab und bestimmen Sie die MDA-Konzentration in den Proben, indem Sie die Absorptionswerte in der Gleichung der Kurve ersetzen (Abbildung 1).
6. Acetylcholinesterase (AChE)
   ANMERKUNG: Diese Methodik basiert auf der von Ellman et ^al.38 vorgeschlagenen Methodik, mit geringfügigen Modifikationen für Anurane.
   1. Richten Sie zum Zeitpunkt der Messung die DTNB- und Acetylthiocholiniodid (ATCh)-Reagenzien ein.
   2. Bereiten Sie die DTNB-Reaktion vor (Tabelle 1).
   3. Bereiten Sie die AChE-Reaktion vor (Tabelle 1).
   4. Bereiten Sie die AChE-Reaktion in einer Glaszelle mit einem optischen Weg von 1 cm vor, indem Sie diese Reagenzien in der folgenden Reihenfolge platzieren: 150 μl PBS-Puffer (pH = 8) + 150 μl DTNB + 50 μl ATCh + 10 μl der Probe (rein in Kaulquappen und verdünnt 1/10 in adulten Anuranen).
   5. Lesen Sie die AChE-Kinetik bei 412 nm für 2 Minuten bei Raumtemperatur ab.
   6. Ermitteln Sie den Wert der AChE-Aktivität mit der folgenden Gleichung (7):
      Aktivitätsrate von AChE (mmol∙^min-1∙^mg-1 Protein) = ([Δ Absorption/1.000]/1,36)/Proteinkonzentration (7)

4. Genetische und zelluläre Ebene: Mikronukleus- und Kometen-Assay

1. Mikronukleus (MN) Assay
   ANMERKUNG: Die Methodik stimmt mit der von Fenech³⁹ vorgeschlagenen überein, mit leichten Modifikationen für neotropische Anurane.
   1. Betäubung der Proben durch Eintauchen in Eiswasser (4 °C) und Entnahme von Blutproben durch Schneiden hinter dem Operculum bei Kaulquappen oder durch Herzpunktion bei Erwachsenen.
   2. Schmieren Sie zwei Tropfen peripheres Blut aus den Proben auf vorgereinigte Objektträger.
   3. Anschließend die Objektträger an der Luft trocknen, 20 min lang mit 100 % (v/v) kaltem Methanol (4 °C) fixieren und anschließend 12 min mit 5%iger Giemsa-Lösung färben.
   4. Lassen Sie einen Forscher die Folien bei 1.000-facher Vergrößerung codieren und blind codieren.
   5. Bestimmen Sie die Häufigkeit von MNs, indem Sie 1.000 reife Erythrozyten aus jeder Probe analysieren und als Gesamtzahl der MNs pro 1.000 Zellen ausdrücken.
   6. Verwenden Sie die folgenden Kriterien für die korrekte Identifizierung von multinationalen Unternehmen:
      1. Suchen Sie nach MNs, die einen Durchmesser haben, der kleiner als 1/3 des Durchmessers des Hauptkerns ist.
      2. Stellen Sie sicher, dass die Färbung des MN nicht brechbar ist, aber eine Färbeintensität hat, die gleich oder heller ist als die des Hauptkerns.
      3. Suchen Sie nach einer MN-Grenze, die von der Hauptkerngrenze unterscheidbar ist, ohne dass eine Verbindung zum Kern besteht oder sich mit dem Hauptkern überschneidet.
      4. Stellen Sie sicher, dass die Anzahl der MNs in den Zellen nicht mehr als vier MNs überschreitet, die mit dem Zellkern verbunden sind.
2. Comet-Assay oder Einzelzell-Gelelektrophorese (SCGE)
   1. Betäubung von Proben durch Eintauchen in Eiswasser und Entnahme von Blutproben durch Schneiden hinter dem Operculum bei Kaulquappen oder durch Herzpunktion bei Erwachsenen.
   2. Verdünnen Sie das Blut mit 1 ml PBS, zentrifugieren Sie es (381 × g, 9 min) und resuspendieren Sie es in einem Endvolumen von 50 ml PBS.
   3. Mischen Sie 30 μl der Blutprobe mit 70 μl Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt (LMPA) bei einer Konzentration von 0,5 % Agarose, um Schicht 2 zu bilden. Anschließend werden 50 μl Schicht 2 auf einen Objektträger gelegt, der zuvor mit Schicht 1 beschichtet war und 100 μl 0,5 % Agarose mit normalem Schmelzpunkt enthält.
   4. Decken Sie den Objektträger mit einem Deckglas ab und legen Sie ihn 10 Minuten lang in die Kälte (4 °C), um Schicht 2 zu verfestigen.
   5. Entfernen Sie nach dem Erstarren das Deckglas und bilden Sie die dritte Schicht, indem Sie 100 μl 0,5 % LMPA auftragen.
   6. Wenn die dritte Schicht fest wird, entfernen Sie das Deckglas und tauchen Sie jeden Objektträger in ein 100-ml-Coplin-Glas mit Lyselösung (Tabelle 1), das am selben Tag zubereitet und bei 4 °C aufbewahrt wurde. Stellen Sie die Coplin-Gläser für 1 h im Dunkeln (4 °C) in ein kaltes Bad, damit die Lyse erfolgen kann.
      HINWEIS: Das Experiment kann pausiert und später neu gestartet werden. Es wurde berichtet, dass die Lyseperiode zwischen 1 h und 1 Monat dauert.
   7. Entfernen Sie am Ende der Lyse die Objektträger und tauchen Sie sie in die Elektrophorese-Pufferlösung (Tabelle 1) in den Elektrophoresetank. Führen Sie diesen Schritt 15 Minuten lang im Dunkeln bei 4 °C durch, damit sich die DNA entspannen kann. Nach dem Abwickeln der Kern-DNA ist die Elektrophorese an demselben Puffer bei einer Temperatur von 4 °C für 10 min bei 25 V und 250 mA durchzuführen.
   8. Am Ende der Elektrophorese neutralisieren Sie die in den Objektträgern enthaltenen Proben 3 x 5 min durch Zugabe von 2 mL Tris-HCl-Lösung (Tabelle 1).
   9. Im letzten Schritt der Comet-Assay-Technik dehydrieren Sie die Proben, indem Sie die Proben in 100-ml-Coplin-Gläser mit Alkohol (95 %) bei 4 °C geben.
   10. Zum Schluss färben Sie die Proben, indem Sie 10 μl 4′,6-Diamino-2-phenylindol (DAPI) in die Mitte des Objektträgers geben und ein Deckglas anbringen, das den Farbstoff in den Proben verteilt. Untersuchen Sie die Objektträger unter einem Fluoreszenz-Fotomikroskop mit einem WB-Filter.
       ACHTUNG: Der gesamte Prozess muss im Dunkeln durchgeführt werden, um einen DNA-Photoabbau zu vermeiden.
   11. Quantifizieren Sie den DNA-Schaden, indem Sie die Länge der DNA-Migration aus dem Nukleoid bewerten. Bestimmen Sie es in diesem Fall visuell anhand von 100 zufällig ausgewählten Zellen ohne Überlappung. Klassifizieren Sie den DNA-Schaden in vier Klassen: 0-I (kein Schaden), II (minimaler Schaden), III (mittlerer Schaden) und IV (maximaler Schaden). Geben Sie die Daten als mittlere Anzahl geschädigter Zellen (Summe der Klassen II-IV) und den mittleren Comet-Score für jede Behandlungsgruppe an. Berechnen Sie aus diesen Daten den genetischen Schadensindex (GDI) für jeden Prüforganismus anhand der folgenden Gleichung (8):
       GDI = (1[I] + 2[II] + 3[III] + 4[IV])/N[I-IV]) (8)
       wobei I-IV die Art der Nukleoidschädigung und NI-NIV die Gesamtzahl der bewerteten Nukleoide gemäß Pitarque et ^al.40 darstellen.

5. Korrelierte Biomarker

HINWEIS: In jüngster Zeit können Biomarker auf allen Ebenen integriert werden, indem der von Beliaeff und Burgeot⁴⁹ vorgeschlagene und für neotropische Anuren angepasste Biomarker-Response-Index (IBR) verwendet wird. Die IBR liefert einen numerischen Wert, der alle Biomarker-Antworten integriert. höhere IBR-Werte weisen auf höhere Belastungsniveaus^{hin 49}. In Bezug auf die IBR-Schätzung für eine bestimmte Station oder die Behandlung einer bestimmten Erhebung sind die aufeinanderfolgenden Datenverarbeitungsschritte zur Ermittlung des endgültigen Ergebnisses wie folgt:

1. Berechnen Sie die mittlere Schätzung (X), wenn einzelne Ergebnisse verfügbar sind. Andernfalls verwenden Sie den Wert aus der gepoolten Probe an jeder Probenahmestation.
2. Berechnen Sie für jeden Biomarker den allgemeinen Mittelwert (m) und die Standardabweichung (s) von X für alle Stationen und/oder Erhebungen, abhängig von den durchzuführenden Vergleichen.
3. Standardisieren Sie X, um Y zu erhalten.Berechnen Sie einen Wert mit dem Namen Y: Y = (X- m)/s.
4. Berechnen Sie den Z-Wert wie folgt: Z = Y oder Z = -Y, im Falle einer biologischen Wirkung, die einer Hemmung bzw. Aktivierung als Reaktion auf einen Stressor entspricht.
5. Berechnen Sie abschließend die Punktzahl (S) mit S = Z + |Min|, wobei S ≥ 0 und |Min| ist der ermittelte minimale Absolutwert.
6. Zeichnen Sie ein Spinnen- oder Sterndiagramm, nachdem Sie den Wert von S für jeden Biomarker (Si) berechnet und die Summierung durchgeführt haben, um die IBR zu erhalten.
   HINWEIS: Einzelheiten zu den Berechnungen finden Sie in der Originalarbeit⁴⁹.

Ergebnisse

Alle hier vorgestellten Biomarker-Techniken sind einfache, schnelle, bequeme, empfindliche, kostengünstige und genaue Methoden. Für jeden Biomarker ist es wichtig, Folgendes zu beachten.

Individuelle Ebene
Skalierter Massenindex
Das Fotografieren im Millimetermaßstab ist von großer Bedeutung, da dieser Wert für die Kalibrierung der Software verwendet wird, was zu einer besseren Objektivität in Bezug auf die Messsch...

Diskussion

Die Biomarker auf individueller Ebene sind sehr einfach zu bestimmen und sehr kostengünstig, da für die Untersuchung dieser Biomarker nur wenige Geräte benötigt werden, die normalerweise in jedem Forschungslabor zur Verfügung stehen. Darüber hinaus liefern diese Biomarker allgemeine Informationen über die Gesundheit und Fitness der Tiere. Die Anzahl der Tiere, die in jedem Protokoll verwendet werden, ist entscheidend, um zuverlässige Ergebnisse zu erzielen. Aufgrund der Variabili...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Analytical scale
Electrophoresis power supply	Enduro	E0203-250V
Eosin	Merck
Fluorescence photomicroscope	Olympus	BX50	Equipped with an appropriate filter combination
Hematoxylin of Harris	Merck
High resolution photo camera			>16 megapixels
Homogenizer
Horizontal electrophoresis chamber	Sigma
Microcentrifuge	Denver Instrument
Microscope	Leica	DM4000 B	Equipped with image capture system Leica DFC 280
Microtome	Leica	2265
Paraplast	Sigma	P3558
Personal Computer			Eqquiped with Mac OS X, Lynux or Windows
Refrigerated centrifuge
UV–Vis spectrophotometer	Rayleigh	723G	With UV-lamp