Neotropik Anuranlarda Biyobelirteçleri Farklı Ölçeklerde Değerlendirmek için Ekotoksikolojik Metodolojiler

Özet

Bu yazıda, neotropikal anuran türlerinde biyobelirteçlerin değerlendirilmesi için standartlaştırılmış ekotoksikolojik yöntemler sunulmuştur. Spesifik olarak, bu makale genetik, hücresel-histolojik, biyokimyasal, morfolojik ve bireysel seviyeler gibi farklı ekotoksikolojik değerlendirme ölçeklerinde çeşitli metodolojileri detaylandırmaktadır.

Özet

Ekotoksikolojideki yeni sorular, bir dizi biyobelirteç uygulamanın önemini vurgulamaktadır, çünkü bu, yalnızca çevresel stres faktörlerinin organizmalar üzerindeki etkilerinin yorumlanmasını değil, aynı zamanda olası etkilerinin belirlenmesini de geliştiren ekotoksikolojik tahminlerle sonuçlanır. Ekotoksikolojik biyobelirteçlerin farklı organizasyon seviyelerinde kullanılmasının, organizmaların çevresel stres faktörlerine biyolojik tepkilerinin tahmin edilmesine izin verdiği ve bunun çevresel risk değerlendirmesinde yararlı olduğu iyi bilinmektedir.

Bununla birlikte, gözlemlenen etkilerin doğasını ve varyasyonunu aydınlatmak için temel prosedürlerin optimizasyonunu göz önünde bulundurmak, kontrol gruplarında tarihsel veriler oluşturmak ve organ ve dokulardaki yanıtları değerlendirmek için spesifik biyotahliller kullanmak gerekir. Bu nedenle, bu çalışma, farklı ekolojik seviyelerde neotropikal anuranların tüm aşamalarında kullanılan çeşitli ekotoksikolojik metodolojileri tanımlamayı ve bunları hem vahşi yaşamda hem de laboratuvar koşullarında kullanılacak yararlı biyobelirteçler olarak doğrulamayı amaçlamaktadır. Bu çalışmada, bu biyobelirteçler bireysel/organizma düzeyinde (vücut kondisyon indeksi), histolojik/fizyolojik düzeyde (histopatoloji, histometrik ve pigmenter analizler), biyokimyasal düzeyde (oksidatif stres enzimleri) ve genetik düzeyde (kuyruklu yıldız tahlili ile DNA'da doğrudan ve oksidatif hasar) uygulanmıştır.

Bu metodolojiler, türe bağlı olarak küçük varyasyonlara veya modifikasyonlara sahip olsa da, bu teknikler, ksenobiyotiklerin, onları sucul ve karasal ekosistemlerin yararlı gösterge türleri haline getiren belirli özelliklere sahip olan anuranlar üzerindeki etkisini değerlendirmek için etkili biyobelirteçler sağlar. Sonuç olarak, bu çalışmada kullanılan biyobelirteç bataryasının Neotropik anuranlardaki toksik tepkileri tahmin etmek için yeterli olduğu kanıtlanmıştır ve kirleticilerin bölgenin su ekosistemleri üzerindeki etkisini belirlemek için biyoindikatör olarak da önerilebilir. Son olarak, belirli bölgelerdeki anuranlar için bu önemli biyobelirteçlerin standardizasyonunun sağlanması ve muhtemelen risk değerlendirmelerine ve karar verme süreçlerine dahil edilmesi önerilmektedir.

Giriş

Çevresel stres faktörlerinin doğal su kütlelerine girişi, su ekosisteminin sağlığını etkileyebilir¹. Bu çevresel stres faktörlerine maruz kalmak, doğrudan maruz kalma (hem kısa hem de uzun süreli) dahil olmak üzere farklı toksisite mekanizmaları yoluyla suda yaşayan organizmaların hayatta kalmasını veya zindeliğini ^{etkileyebilir2}. Bu nedenle, zindelik ve sağkalım ile ilgili toksikolojik uç noktaları değerlendirmek için standartlaştırılmış laboratuvar biyo-tahlilleri, sahadaki stresin birçok dolaylı etkisinin güvenilmez bir tahmini olabilir. Ayrıca, normal fizyolojik seviyelerdeki değişiklikler ve av yakalama gibi bireyler üzerindeki etkiler, organizmalarda hayatta kalma ve üreme uygunluğu ve nihayetinde ekosistemin sağlığı üzerindeki etkinin daha iyi uzun vadeli göstergeleri olabilir ^1,3. Bilinen bir dizi çevresel parametreye ve kirletici konsantrasyonlarına dayalı olarak ekosistem bileşimi ve işlevinin yanı sıra organizma sağlığındaki değişiklikleri tahmin etmek, kirlilik yönetiminin iyileştirilmesi için önemlidir¹.

Biyobelirteçler, ksenobiyotik kimyasallara maruz kalma veya bunların etkilerinden kaynaklanan biyokimyasal, fizyolojik veya histolojik değişiklikler olarak tanımlanır ^4,5. Biyobelirteçlerin erken uyarı sinyalleri olarak çok yararlı olduğu kanıtlanmıştır ^4,5. Biyobelirteçlerin cevaplamaya yardımcı olduğu önemli bir soru, belirli stres faktörlerinin çevrede olumsuz etkilere neden olacak kadar yüksek konsantrasyonlarda bulunup bulunmadığıdır. Bu bilgi, hasarın ve nedensel faktörlerin niteliğini ve kapsamını araştırmaya değip değmeyeceğinin veya bu durumda daha fazla kaynak yatırılmaması gerekip gerekmediğinin değerlendirilmesine katkıda bulunur ^6,7,8. Ayrıca, tek bir biyobelirteç olarak tek bir biyobelirteç olarak değerlendirilmesi kavramı yeterli olmayabileceğinden 5,7,8,9,10, erken uyarı işaretlerini tespit etmek ve böylece ekosistemler üzerindeki geri dönüşü olmayan etkileri önlemek için çoklu biyobelirteçlerin kapsamlı bir değerlendirmesini gerçekleştirmeye yönelik artan bir eğilim vardır.

Tüm toksik etkilerin, bir stres etkeninin biyomoleküllerle etkileşimi ile başladığına dikkat etmek çok önemlidir. Bu anlamda, etkiler biyokimyasal, hücre altı, hücresel, doku, organ, birey, popülasyon, topluluk, ekosistem, peyzaj ve biyosferik organizasyon seviyeleri boyunca basamaklanabilir. Hücreler, çevresel stres faktörleri ve biyolojik sistemler arasındaki etkileşimin birincil bölgesidir. Bu nedenle, moleküler ve genetik etkilerin anlaşılması, araştırmacıların düşük ve yüksek ekolojik organizasyon seviyelerini ilişkilendirmelerine olanak tanır ve örneğin henüz test edilmemiş olan çevresel kirleticilerin insan sağlığı üzerindeki etkisini tahmin etmelerine yardımcı olur⁵. Ayrıca, hücrelerin yüksek özgüllüğü nedeniyle, sadece çevresel kirleticileri değerlendirmek için değil, aynı zamanda insan sağlığını da değerlendirmek için faydalıdırlar ^5,11. Bu nedenle, stresörlerin biyokimyasal düzeydeki etkilerini anlamak, gözlemlenen etkilerin nedenleri hakkında fikir verebilir ve bunların bir sonraki yüksek seviyedeki^etkilerle bağlantılı olmasına izin verebilir 5. Ek olarak, stresörlerin biyokimyasal mekanizmalarını anlayarak, henüz toksikolojik olarak değerlendirilmemiş yeni stresörlerin etkileri, işlev benzerliklerine dayalı olarak diğer iyi bilinen kirleticilere göre tahmin edilebilir. Çeşitli çevresel stres faktörlerinin varlığında, genetik ve biyokimyasal biyobelirteçler gözlemlenen spesifik etkiler hakkında değerli bilgiler sağlayabilir. Bunun yanı sıra biyokimyasal değişimlerle ilgili histokimyasal değerlendirmeler toksikodinamik hakkında bilgi verebilir⁵. Kısacası, hücresel, biyokimyasal ve histolojik biyobelirteçlerin kapsamlı bir analizi gereklidir^10,12 ve bu tür analizler de yerel türler için biyoizleme programlarına dahil edilmelidir ^5,13,14.

Bununla birlikte, laboratuvar koşulları altında biyobelirteçlerin incelenmesi, kirleticilere maruz kaldıktan sonra ölümcül olmayan etkilerin ve kronik etkilerin tespit edilmesinde ve kullanılan yöntemlerin doğrulanması ve standardizasyonunda zorlukların yanı sıra karmaşık zaman veya doza bağlı tepkiler, uygunluk ile belirsiz veya belirsiz bağlantılar ve entegre mekanik modellerin eksikliği dahil olmak üzere bazı zorluklar ortaya çıkarabilir^{1, 4}. Bu sorunları çözmek için çözüm, ölçülen biyobelirteç sayısını artırmak değil, tüm organizmalar üzerindeki kimyasal etkilerin mekanik temellerini açıklamaya katkıda bulunan çalışmaları ve test edilebilir hipotezleri dikkatli bir şekilde tasarlamaktır⁴.

Ekotoksikolojideki yeni sorular, çevresel stres faktörlerinin organizmalar üzerindeki etkilerinin yorumlanmasını ve olası etkileri hakkında karar vermeyi geliştiren ekotoksikolojik tahminler üretmek için bir dizi biyobelirteç uygulamanın önemini vurgulamaktadır. Ayrıca, çevresel risk değerlendirmelerinde ve biyoizlemede hem kavramların (biyobelirteçler hem de biyoindikatörler) birleştirilmesinin önemi, araştırmacıların belirli bir ilgi ortamındaki organizmaların fizyolojik olarak normal mi yoksa stresli mi olduğunu belirlemelerine izin vermesidir. Bu çalışmada benimsenen yaklaşım, insanlarda gerçekleştirilen biyokimyasal analize benzemektedir. Bu anlamda, bir organizmanın hem sahada hem de laboratuvarda sağlıklı olup olmadığını görmek için bir dizi biyobelirteç analiz edilebilir⁶. Son olarak, biyobelirteçler ekolojik risk değerlendirmelerine iki şekilde katkıda bulunacaktır: (1) nadir ve/veya uzun ömürlü türlerin maruziyetinin değerlendirilmesi ve (2) biyolojik organizasyonun farklı seviyelerinde kimyasal etkilerin mekanizmaları hakkındaki hipotezlerin test edilmesi⁴.

Son on yılda, sitotoksik ve genotoksik kirleticilere maruz kalmanın biyolojik olarak izlenmesi için anuranlarda biyobelirteçler kullanılmıştır. Bunlar arasında en sık kullanılan teknikler, mikronükleus (MN) testi ve kuyruklu yıldız testi veya tek hücreli jel elektroforezi (SCGE) testi ile tek sarmallı DNA kırılmalarının indüksiyonudur. Ek olarak, bu teknikler, çeşitli neotropikal anuranlarda çeşitli çevresel stres faktörlerinin neden olduğu DNA hasarını tahmin etmek için başarıyla kullanılmıştır 14,15,16,17,18,19. Çevresel kirleticilere maruz kalan organizmalarda oksidatif durumdaki değişiklikleri incelemek için diğer biyobelirteçler^{kullanılabilir} 16,17,18,19. Oksidatif stres, farklı ksenobiyotiklere maruz kalmaya verilen bir yanıttır ve maruz kalan bireylerin antioksidan kapasitesi de dahil olmak üzere çeşitli zararlı etkilere yol açar 5,6,7,19,20.

Ekotoksikolojik çalışmalarda, biyoindikatör türler, çevresel stres faktörlerinin uzun vadeli etkileşimlerini ve olumsuz etkilerini daha yüksek organizasyonel düzeylerde (örneğin, organizma, popülasyon, topluluk ve ekosistem seviyeleri) tanımlayan organizmalar oldukları için kullanılır10,20,21. Biyobelirteçler ve biyoindikatörler olmak üzere iki kavramı entegre ederek, türler, bir veya daha fazla biyolojik organizasyon düzeyinde ölçülen biyolojik etkilerle ilişkili veya bağlantılı biyokimyasal, fizyolojik veya ekolojik yapıları veya süreçleri geniş bir şekilde tanımlamak için taranabilir. Son olarak, bir stres etkeninin toksisitesine ilişkin tahminleri iyileştirmek için her iki kavramı kullanmanın en büyük zorluğu, ekolojik risklerin değerlendirilmesinde yüksek faydaya sahip biyobelirteçlerin ve biyoindikatörlerin analiz edilmesiyle ilgilidir²⁰. Bu anlamda, bir test organizmasının çevresel stres faktörlerine^tepkisi hakkında ilgili bilgiler sundukları için biyobelirteçlerin ve biyoindikatörlerin erken uyarı işaretleri olarak kullanılmasının uygunluğu konusunda fikir birliği vardır ^12,20,21.

Amfibiler, dünya çapında en çok tehdit altında olan ve hızla azalan organizma gruplarından biridir. Bu düşüşün ana nedenlerinden biri, pestisitler, metaller ve ortaya çıkan kirleticiler^gibi yaşam alanlarına giren kirleticilerdir 22,23,24,25. Anuranlar, geçirgen derileri, su ile yakın ilişkileri ve çevre kirliliğine duyarlılıkları gibi onları biyoindikatör türler olarak faydalı kılan çeşitli özelliklere sahiptir ^2,23,24. Bu özellikler amfibileri çevre sağlığının etkili biyoindikatörleri^yapar 7,8,22,23,24,26.

Bununla birlikte, sadece kontrol gruplarında temel prosedürlerin optimizasyonunu ve tarihsel verilerin oluşturulmasını dikkate almak değil, aynı zamanda biyoindikatörlerde gözlemlenen etkilerin doğasını ve çeşitliliğini aydınlatmak için organ ve dokulardaki yanıtları değerlendirmek için spesifik biyoanalizler kullanmak da gereklidir. Bu anlamda, bu çalışma, farklı ekolojik düzeylerde neotropikal anuranların tüm aşamalarında kullanılacak çeşitli ekotoksikolojik metodolojileri tanımlamayı ve bunları hem yaban hayatı hem de laboratuvar koşullarında kullanılacak yararlı biyobelirteçler olarak doğrulamayı amaçlamaktadır. Bu çalışma, çevresel stres faktörlerine maruz kalan anuranlarda laboratuvar ve yaban hayatı biyoizlemesi için entegre edilebilecek ve kanıtlanmış bir biyobelirteç bataryası sunmaktadır.

Protokol

Aşağıdaki teknikler, uluslararası etik standartlar ^46,47,48'e uygun olarak gerçekleştirilen hayvanın önceki kurban edilmesini ve ardından organların diseksiyonu ve ablasyonunu içerir. Hayvanlar, San Luis Eyaleti Çevre, Tarım ve Üretim Bakanlığı'nın yetkisi altında yakalandı (Karar 49-PMA2019). Hayvanların kurban ve ötenazi yöntemleri, San Luis Ulusal Üniversitesi'nden Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (CICUA, protokol Q-322/19) protokolleri tarafından usulüne uygun olarak onaylanmıştır. Anuran organizmaları ile yapılan prosedürler, Garber ve ^ark.46, CONICET⁴⁷ ve INTA^48'de ayrıntılı olarak açıklanan kılavuzlara göre gerçekleştirildi. Ek olarak, burada sunulan tüm protokoller larva ve yetişkin yaşam evrelerindeki neotropikal anuran türleri içindir; yerel araştırmacılar tarafından zaten geniş çapta kabul görmüşlerdir ve sıkı bir protokol altında ve ilgili her üniversitenin "Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (CICUA)" izniyle yürütülmektedir. Kullanılan malzeme ve çözümlerin bir listesi Malzeme Tablosu ve Tablo 1'de sunulmuştur.

1. Bireysel seviye: Vücut kondisyonu ve hepatik ve gonadal indeksler

1. Vücut kondisyon indeksi: Ölçekli kütle indeksi
   NOT: Bu indeks hem yetişkinlerde hem de gençlerde ve larvalarda kullanılabilir. Bu metodoloji, Brodeur ve ^ark.28,30 ve MacCracken ve Stebbings^29'a göre anuranlar için küçük değişikliklerle birlikte Peig ve Green^27'ye dayanmaktadır.
   1. Hassas bir analitik terazi kullanarak her numunenin vücut kütlesini kaydedin.
   2. Her örneği bir milimetre kağıda yerleştirin ve ~ 15 cm mesafeden bir fotoğraf çekin.
      NOT: Her zaman aynı mesafeden fotoğraf çekmek önemlidir.
   3. Fotoğraf analizi:
      NOT: Fotoğraflar, çevrimiçi olarak ücretsiz olarak sunulan (https://imagej.nih.gov/ij/index.html) ImageJ programı ile veya fotoğrafta bulunan bir ölçekten ölçüm yapılmasına izin veren başka herhangi bir görüntü analiz programı ile analiz edilebilir.
      1. ImageJ programındaki ölçüm aracını kullanarak her numunenin burun-havalandırma uzunluğunu (SVL) ölçün ve önce milimetre sayfasındaki bilinen bir ölçüme bakın.
         NOT: Kurbağa yavrularında, vücut uzunluğunun ölçümü, kuyruk yüzgeci göz ardı edilerek, kloakal tüpe kadar yapılmalıdır.
   4. Ölçekli kütle indeksi (S)
      1. Her bir anuranın vücut kütlesinden ve SVL'sinden elde edilen verilerle, SVL'ye (x ekseni) karşı vücut kütlesinin (y ekseni) doğrusal olmayan bir güç fonksiyonu regresyon çizgisi oluşturun.
      2. İncelenen popülasyondan ölçülen tüm bireylerin SVL verileriyle ortalama uzunluğu hesaplayın.
      3. Son olarak, denklem (1)'i kullanarak Peig ve Green²⁷ ve Brodeur ve ^ark.28'e göre ölçekli kütle indeksini (S) hesaplayın:
         S = M_i(L₀/L_i)^b (1)
         burada M_i ve L_i , sırasıyla i bireyinden vücut kütlesi ve SVL'dir; b, doğrusal olmayan bir kuvvet fonksiyonu regresyonu²⁸ ile tahmin edilen ölçeklendirme üssüdür; L₀ , incelenen popülasyon için ortalama uzunluktur; ve S, SVL'si L₀ değerine standardize edildiğinde i bireyi için tahmin edilen vücut kütlesidir.
         NOT: b'nin, cinsel olarak dimorfik türlerde cinsiyete özgü de olabilen türe özgü bir sabit olduğuna dikkat etmek önemlidir.
2. Hepatosomatik indeks: Ölçekli karaciğer indeksi
   NOT: Vücut kondisyon indeksine gelince, bu indeks gelişimin her aşamasındaki bireylerde kullanılabilir. Metodoloji Brodeur ve ^ark.28'e dayanmaktadır.
   1. Her numunenin SVL'sini adım 1.1.2 ve adım 1.1.3'e göre kaydedin.
   2. Anuran amfibileri için etik standartlara göre bireylere ötenazi yapın 46,47,48.
   3. Tüm karaciğeri çıkarın ve kütlesini hassas bir analitik ölçekte en yakın miligrama kaydedin.
   4. Her bir anuranın karaciğer kütlesinden ve SVL'sinden elde edilen verilerle, SVL'ye (x ekseni) karşı karaciğer kütlesinin (y ekseni) doğrusal olmayan bir güç fonksiyonu regresyon çizgisi oluşturun.
   5. İncelenen popülasyondan ölçülen tüm bireylerin SVL verileriyle ortalama uzunluğu hesaplayın.
   6. Denklem (2)'yi kullanarak Brodeur ve ^ark.28'e göre ölçekli karaciğer indeksini (SLI) hesaplayın:
      SLI = Lm_i (L₀/L_i)^b (2)
      burada Lm_i ve L_i , sırasıyla i bireyinden alınan karaciğer kütlesi ve SVL'dir; b, doğrusal olmayan bir kuvvet fonksiyonu regresyonu²⁸ ile tahmin edilen ölçeklendirme üssüdür; L₀ , incelenen popülasyon için ortalama uzunluktur; ve SLI, SVL'si L_0'a standardize edildiğinde birey i için tahmin edilen karaciğer kütlesidir.
3. Gonadal indeks: Ölçekli gonadal indeks
   NOT: Bu metodoloji Brodeur ve ^ark.30'a dayanmaktadır ve yalnızca yetişkin bireylerde yararlıdır. Erkek ve kadın endekslerinin, farklı ölçeklerde farklılık gösterdikleri için ayrı ayrı analiz edilmesi gerektiğine dikkat etmek önemlidir.
   1. Her numunenin SVL'sini adım 1.1.2 ve adım 1.1.3'e göre kaydedin.
   2. Anuran amfibileri için etik standartlara göre bireylere ötenazi yapın 46,47,48.
   3. Sağ ve sol gonadları çıkarın ve kütleyi en yakın miligrama kadar hassas bir analitik ölçekte kaydedin.
   4. Her bir anuranın gonad kütlesinden ve SVL'sinden elde edilen verilerle, adım 1.1.4.1 ve adım 1.2.3'e benzer şekilde, SVL'ye (x ekseni) karşı gonad kütlesinin (y ekseni) doğrusal olmayan bir güç fonksiyonu regresyon çizgisi oluşturun.
   5. İncelenen popülasyondan ölçülen tüm bireylerin SVL verileriyle ortalama uzunluğu hesaplayın.
   6. Denklem (3) kullanarak her hayvan için Brodeur ve ^ark.30'a göre ölçekli gonadal indeksi (SGI) tahmin edin:
      SGI = Gm_i(L₀/L_i)^b (3)
      burada Gm_i ve L_i , sırasıyla i bireyinden gelen gonad kütlesi ve SVL'dir, b, Brodeur ve ^ark.30 tarafından doğrusal olmayan bir güç fonksiyonu regresyonu ile tahmin edilen ölçeklendirme üssüdür, L₀ , incelenen popülasyon için ortalama uzunluktur ve SGI, SVL'si L_0'a standardize edildiğinde bir birey i için tahmin edilen gonad kütlesidir.

2. Morfolojik-histolojik düzey

NOT: Bu analiz için histolojik bölümlerin kullanılması gereklidir. İlk adım dokuyu toplamaktır.

1. Sabitleme ve dehidrasyon
   1. Yapıları korumak için sabitleyici bir çözelti kullanın. Anuran dokuları için, tercihen sabitleme solüsyonlarının geri kalanı üzerinde önerilen methacarn veya Bouin solüsyonu kullanın (Tablo 1).
      NOT: Kullanım sırasında tüm maddeler karıştırılmalıdır.
   2. Kurbağa yavrularını veya 50-100 mg'lık bir doku parçasını, 3 saat boyunca 4 ° C'de 1-2 mL fiksatif çözelti içeren konik bir tüpe yerleştirin. Dokuyu aynı hacimde% 70 etil alkolde 30 dakika boyunca yıkayın.
   3. Dokuyu taze% 70 etil alkol çözeltisine yerleştirin.
      NOT: Dehidrasyona devam etmeden önce bu noktada prosedürü birkaç gün durdurmak mümkündür.
   4. Dokuyu bir dizi alkol solüsyonunda kurutun: etil alkol% 80 (10 dakika), alkol% 90 (10 dakika), etil alkol% 100 (10 dakika) ve% 100 (10 dakika).
   5. Ksilen içinde 2 x 10 dakika diyafanizasyon (temizleme) gerçekleştirin.
   6. Parafini bir beherde eritin. Dokuyu 10 dakika bekletin. Dokuyu çıkarın ve erimiş parafin ile histolojik bir kalıba yerleştirin. Oda sıcaklığında katılaşmasını bekleyin.
   7. Dönen bir mikrotom üzerinde yapılan 3 μm'lik bölümleri bir cam slayt üzerine yerleştirin.
2. Histometrik analiz
   1. Doku bölümlerini hematoksilen-eozin^31'de boyayın.
   2. Işık mikroskobunda 100x objektifle ölçüm için 10-20 fotomikrograf kullanın. Her fotomikrografta 5-10 karaciğer hücresini analiz edin.
      NOT: Burada, tekniği tanımlamak için bir model olarak karaciğer kullanılmıştır. Diğer dokuları kullanmak mümkündür; Kullanılacak ışık mikroskobunun amacının doku tipine uygun olduğundan emin olun. Ölçülecek hücreleri görebilmek ve tanımlayabilmek gerekir.
3. Histopatoloji
   1. Hematoksilen-eozin^32'deki doku kesitlerini boyadıktan sonra, 10x, 20x, 40x ve 100x hedefleri altında 5-10 histolojik kesiti inceleyin.
   2. Doku değişikliklerini arayın ve denklem (4) kullanarak Bernet ve ^ark.32 tarafından tanımlandığı gibi doku değişikliklerinin derecesi (DTC) indeksini tahmin edin:
      DTC =Σalt. (bir × w)    (4)
      burada Σalt, değişimin toplamıdır; a hasar aşamasını temsil eder (0, yok; 1, düşük; 2, orta; 3, yüksek); ve w, hasarın tersinirlenebilirlik derecesini temsil eder (1, tersinir; 2, kısmen tersinir; 3, tersinmez).
      NOT: Burada, tekniği tanımlamak için bir model olarak karaciğer kullanılmıştır. Diğer dokuları kullanmak mümkündür; Kullanılacak ışık mikroskobunun amacının doku tipine uygun olduğundan emin olun.
4. Pigment sistemi
   1. Slaytları hematoksilen-eozin içinde boyadıktan sonra, 20x objektifli 10-20 fotomikrografı inceleyin.
   2. Santos ve ^ark.33'e göre Image Pro-Plus yazılımını kullanarak boyama yoğunluğundaki farklılıkları ölçerek melaninin kapladığı alanı ölçün.
   3. Image Pro Plus 6.0® yazılımını açın.
   4. Menü ve Araç Çubuğu'nu seçin: Biyolojik.
   5. Fotomikrografları çekmek için kullanılan Büyütmenin uzamsal kalibrasyonunu seçin.
   6. Histolojik bir görüntü açın.
   7. Araç sayısı | öğesini seçin Nesneleri ölçün.
   8. Renk seç düğmesine tıklayın.
   9. Damlalık aracını seçin ve görüntüde ölçülecek rengi işaretleyin.
   10. Pencereyi kapatın ve Sayım'a tıklayın.
   11. Görüntüle'yi seçin | Sonuçları görmek için istatistikler.

3. Biyokimyasal seviye: Reaktif oksijen türleri (ROS) ve kolinerjik enzimler

1. Numune homojenizasyonu
   NOT: Deney bittikten sonra, numuneleri (dokular veya kurbağa yavruları) o sırada işlenmeyeceklerse -20 °C'de (2 ay) veya -80 °C'de (6 ay) dondurarak fosfat tamponlu salin (PBS) içinde saklayın. Alternatif olarak, aşağıda önerilen önerilere göre aynı anda homojenize edilebilirler.
   1. Kurbağa yavruları
      1. Hassas bir analitik terazide 1 g kurbağa yavrusu veya kurbağa yavrusu havuzunu tartın.
      2. 1 g kurbağa yavrularını 1 mL PBS içeren 15 mL'lik konik bir tüpe yerleştirin ve bir buz banyosuna (4 °C) daldırın.
      3. Konik bir tüpe uyarlanmış teflon uçlu bir homojenizatör ile homojenize edin ve soğuk koşullarda (4 °C) çalışın.
         DİKKAT: Proteinleri yok edebileceği ve sıcaklığı artırabileceği için yüksek sayıda devir kullanmaktan kaçının.
      4. Her numunenin aynı hacimdeki sıvı homojenatını etiketli iki adet 2 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve soğuk koşullarda (4 °C) çalışın.
      5. Numuneleri sıvı homojenat ile 4 °C'de ve 9.520 × g'da 10 dakika santrifüjleyin.
      6. Son olarak, süpernatanı çıkarın, mikrosantrifüj tüplerine koyun, 0.5 mL ila 1 mL alikotlarda etiketleyin ve enzim tahliline kadar -80 ° C'de (6 ay) veya -20 ° C'de (2 ay) bir dondurucuda saklayın.
   2. Yetişkin
      1. İlgilenilen dokuyu (örn. karaciğer, kas, böbrek) çıkarın ve hassas bir analitik terazide 1 g tartın.
      2. Dokuyu 1 mL PBS içeren 50 mL'lik konik bir tüpe yerleştirin ve bir buz banyosuna (4 °C) daldırın.
      3. Konik bir tüpe uyarlanmış teflon uçlu bir homojenizatör ile homojenize edin ve soğuk (4 °C) çalışın.
         DİKKAT: Proteinleri yok edebileceği ve sıcaklığı yükseltebileceği için yüksek devir kullanmaktan kaçının.
      4. Her numunenin aynı hacmindeki sıvı homojenatı iki etiketli 2 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve soğuk çalışın (4 °C).
      5. Tüpleri sıvı homojenat ile 4 ° C'de ve 9.520 × g'da 10 dakika santrifüjleyin.
      6. Son olarak, süpernatanı çıkarın, mikrosantrifüj tüplerine koyun, 0.5 mL ila 1 mL'lik alikotlar halinde etiketleyin ve enzim tahlili yapılana kadar -80 ° C'de (6 ay boyunca) veya -20 ° C'de (2 ay boyunca) bir dondurucuda saklayın.
2. Protein tayini
   NOT: Protein değeri, enzimatik aktivite değerlerinin küçümsenmesinden veya fazla tahmin edilmesinden kaçınırken, toplam protein miktarına göre enzimatik aktiviteyi tahmin etmek için elde edilir. Bu metodoloji, anuranlar için küçük değişikliklerle Bradford^34'e dayanmaktadır:
   1. Bradford reaktifini hazırlayın (bakınız Tablo 1).
   2. Coomassie G-250 + etanole %85 (p/h) oranında 100 mL H₃PO₄ ekleyin ve damıtılmış su ile 1 L'lik bir hacme getirin.
   3. Kalibrasyon eğrisini bilinen bir protein standardı olarak sığır serum albümini (BSA) ile hazırlayın (Tablo 1).
   4. 3 mL'lik bir spektrofotometre küveti için artan konsantrasyonlarda albümin standartlarını hazırlayın. Standart eğrinin bir örneği için Tablo 2'ye bakın.
   5. 590 nm'de bir spektrofotometre kullanarak absorbansı ölçün (bu, reaktif ve protein kompleksinin oluştuğu dalga boyudur).
      NOT: Bradford reaksiyonunun, maksimum 3 mL hacimli ve 1 cm'lik bir optik yola sahip bir cam küvet kullanılarak spektrofotometrede okumak için numune ile gerçekleştirilmesi, proteinin belirlenmesine yardımcı olur.
   6. Aşağıdaki reaktanları şu sırayla bir küvete yerleştirin: 2.000 μL Bradford reaktifi + X μL numune (X = 20 μL yetişkin bir anurandan ilgilenilen organın homojenat numunesi veya 40 μL homojenat numunesi bir kurbağa yavrusundan alınan).
   7. Son olarak, spektrofotometredeki absorbansı 590 nm'de ölçün.
      NOT: 4 °C'de çalışmak gerekli değildir.
3. Katalaz
   NOT: Bu metodoloji, anuranlar için küçük değişiklikler içeren Aebi^35'e dayanmaktadır.
   1. 1.900 μL PBS + 40 μL hidrojen peroksit (H₂0₂) + 20 μL numuneyi (kurbağa yavrularında saf ve yetişkin dokusu için 1/25 oranında seyreltilmiş) 1 cm yol uzunluğuna sahip 3 mL'lik bir kuvars küvette inkübe edin.
      DİKKAT: İnkübasyon sırasında reaktiflerin ve numunenin eklenmesi için yukarıda verilen sırayı izleyin. Anuranlar fizyolojik olarak ektotermik olduğu için reaktanlar oda sıcaklığında (25 °C) inkübe edilebilir.
   2. Bir UV spektrofotometresinde 2 dakika boyunca 240 nm'de katalaz kinetiğini okuyun.
   3. Aşağıdaki denklem (5)³⁵ ile enzim aktivitesini hesaplayın:
      k (mmol∙^min-1∙^mg-1 Prt) = (Δ absorbans/1.000)/protein konsantrasyonu (5)
      NOT: Saflaştırılmış enzim preparatları ile yapılan çalışmalarda, k'0 spesifik aktivitesi, k'nin molar sönme katsayısına bölünmesiyle elde edilir, (e = 43,6); k' = (k/e).
4. Glutatyon S-transferaz (GST)
   NOT: Bu metodoloji, anuranlar için küçük değişiklikler içeren Habig ve ^ark.36'ya dayanmaktadır.
   1. 300 μL GST + 10 μL 1-choro-2, 4-dinitrobenzeno (CDNB) (0.1 M) + 10 μL numuneyi (kurbağa yavrularında saf ve yetişkin dokusu için 1/25 oranında seyreltilmiş) küvette inkübe edin.
      DİKKAT: İnkübasyon sırasında reaktiflerin ve yukarıda verilen numunenin eklenme sırasına uyun. Anuranlar fizyolojik olarak ektotermik olduğu için reaktifler oda sıcaklığında (25 °C) inkübe edilebilir.
   2. GST'yi hazırlayın (Tablo 1).
   3. Spektrofotometrede 2 dakika boyunca 340 nm'de GST kinetiğini okuyun.
   4. Enzim aktivitesini aşağıdaki denklem (6) ile hesaplayın:
      GST'nin aktivite hızı (mmol/dakikada/mg protein) = ([Δ absorbans/1.000]/9.6 × 10⁴)/protein konsantrasyonu (6)
      9.6 mM⁻¹ cm⁻¹ = molar sönme katsayısı burada.
5. Lipid peroksidasyonu (TBARS)
   NOT: Bu metodoloji, anuranlar için küçük değişikliklerle Buege ve Aust^37'ye dayanmaktadır.
   1. Standart olarak MDA ve %0,7 TBA ile bir kalibrasyon eğrisi oluşturun (Tablo 3).
   2. Standart MDA çözeltisini (10 mM) hazırlayın (Tablo 1). Çözeltiyi 1 saat boyunca 50 ° C'lik bir su banyosuna yerleştirerek MDA'ya THP hidrolizi gerçekleştirin.
   3. Manyetik bir sıcak plaka karıştırıcı kullanarak% 0.7 (a / h) TBA çözeltisi (Tablo 1) hazırlayın.
   4. Daha sonra, numune homojenatlarını 9.520 × g ve 4 °C'de 30 dakika santrifüjleyin.
   5. 500 μL süpernatanı çıkarın, 100 μL 6 M NaOH ekleyin ve 30 dakika boyunca 60 ° C'de bir termal banyoya koyun.
   6. Termal banyodan sonra 250 μL %35 HClO₄ ekleyin ve ardından 30 dakika boyunca bir buz banyosuna (4 °C) koyun.
   7. Bu süreden sonra, 12 dakika boyunca 9.520 × g'da santrifüjleyin ve süpernatanı 300 μL çıkarın.
   8. Süpernatanıma (numune) 300 μL% 0.7 TBA ekleyin ve 30 dakika boyunca bir termal banyoya (97.5 ° C) yerleştirin.
   9. Numune ve TBA tarafından oluşturulan kompleksin 532 nm'de absorbansını okuyun ve eğri denklemindeki absorbans değerlerini değiştirerek numunelerdeki MDA konsantrasyonunu belirleyin (Şekil 1).
6. Asetilkolinesteraz (AChE)
   NOT: Bu metodoloji, Ellman ve ^ark.38 tarafından anuranlar için küçük değişikliklerle önerilen metodolojiye dayanmaktadır.
   1. Ölçüm anında, DTNB ve asetiltiyokolin iyodür (ATCh) reaktiflerini ayarlayın.
   2. DTNB reaksiyonunu hazırlayın (Tablo 1).
   3. AChE reaksiyonunu hazırlayın (Tablo 1).
   4. 1 cm'lik bir optik yola sahip bir cam hücrede, bu reaktifleri aşağıdaki sırayla yerleştirerek AChE reaksiyonunu hazırlayın: 150 μL PBS tamponu (pH = 8) + 150 μL DTNB + 50 μL ATCh + 10 μL numune (kurbağa yavrularında saf ve yetişkin anuranlarda 1/10 oranında seyreltilmiş).
   5. Oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 412 nm'de AChE kinetiğini okuyun.
   6. Aşağıdaki denklemi (7) kullanarak AChE aktivitesinin değerini elde edin:
      AChE'nin aktivite oranı (mmol-min-1∙^mg-1 proteini) = ([Δ absorbansı / 1.000] / 1.36) / protein konsantrasyonu (7)

4. Genetik ve hücresel düzey: Mikronükleus ve kuyruklu yıldız deneyi

1. Mikronükleus (MN) testi
   NOT: Metodoloji, neotropik anuranlar için küçük değişikliklerle Fenech³⁹ tarafından önerilenle uyumludur.
   1. Örnekleri buzlu suya (4 °C) batırarak uyuşturun ve kurbağa yavrularında operkulumun arkasına kesit alarak veya yetişkinlerde kardiyak ponksiyon ile kan örnekleri alın.
   2. Örneklerden iki damla periferik kanı önceden temizlenmiş slaytlara sürün.
   3. Daha sonra slaytları havayla kurutun, %100 (h/h) soğuk metanol (4 °C) ile 20 dakika sabitleyin ve ardından 12 dakika boyunca %5 Giemsa solüsyonu ile boyayın.
   4. Bir araştırmacının kodunu kullanın ve slaytları 1.000x büyütmede kör kodlayın.
   5. Her örnekten 1.000 olgun eritrositi analiz ederek MNlerin sıklığını belirleyin ve 1.000 hücre başına toplam MN sayısı olarak ifade edin.
   6. MN'lerin doğru tanımlanması için aşağıdaki kriterleri kullanın:
      1. Ana çekirdeğin 1 / 3'ünden daha küçük çaplara sahip MN'leri arayın.
      2. MN'nin renklenmesinin kırılabilir olmadığından, ancak ana çekirdeğinkiyle aynı veya daha hafif bir boyama yoğunluğuna sahip olduğundan emin olun.
      3. Çekirdeğe herhangi bir bağlantısı olmadan veya ana çekirdekle örtüşmeden ana çekirdek sınırından ayırt edilebilen bir MN sınırı arayın.
      4. Hücrelerdeki MN sayısının, çekirdekle ilişkili dört MN'den fazla olmadığından emin olun.
2. Kuyruklu yıldız deneyi veya tek hücreli jel elektroforezi (SCGE)
   1. Örnekleri buzlu suya batırarak uyuşturun ve kurbağa yavrularında operkulumun arkasına keserek veya yetişkinlerde kardiyak ponksiyon ile kan örnekleri alın.
   2. Kanı 1 mL PBS ile seyreltin, santrifüjleyin (381 × g, 9 dakika) ve 50 mL PBS'lik son hacimde yeniden süspanse edin.
   3. Katman 2'yi oluşturmak için 30 μL kan örneğini 70 μL düşük erime noktalı agaroz (LMPA) içinde %0.5 agaroz konsantrasyonunda karıştırın. Daha sonra, daha önce 100 μL %0.5 normal erime noktalı agaroz içeren katman 1 ile kaplanmış bir slayt üzerine 50 μL katman 2 yerleştirin.
   4. Slaytı bir lamel ile örtün ve 2. katmanı katılaşmak için 10 dakika soğukta (4 °C) bekletin.
   5. Katılaşmadan sonra, lamel çıkarın ve 100 μL% 0.5 LMPA sererek üçüncü katmanı oluşturun.
   6. Üçüncü katman katılaştığında, lamel çıkarın ve her bir slaytı aynı gün hazırlanmış ve 4 ° C'de tutulan lizis çözeltisi (Tablo 1) içeren 100 mL'lik bir Coplin kavanozuna daldırın. Lizisin oluşması için Coplin kavanozlarını karanlıkta (4 °C) 1 saat soğuk bir banyoya koyun.
      NOT: Deneme daha sonra duraklatılabilir ve yeniden başlatılabilir. Lizis döneminin 1 saat ila 1 ay arasında sürdüğü bildirilmiştir.
   7. Lizisin sonunda, slaytları çıkarın ve elektroforez tankındaki elektroforez tampon çözeltisine (Tablo 1) daldırın. DNA'nın gevşemesine izin vermek için bu adımı karanlıkta 4 ° C'de 15 dakika boyunca gerçekleştirin. Nükleer DNA çözüldükten sonra, aynı tampon üzerinde 4 °C sıcaklıkta 10 dakika boyunca 25 V ve 250 mA'da elektroforez gerçekleştirin.
   8. Elektroforezin sonunda, slaytlarda bulunan numuneleri 2 mL Tris-HCl çözeltisi ekleyerek 3 x 5 dakika nötralize edin (Tablo 1).
   9. Kuyruklu yıldız tahlil tekniğinin son adımında, numuneleri 4 °C'de alkol içeren 100 mL Coplin kavanozlarına (%95) yerleştirerek numuneleri dehidre edin.
   10. Son olarak, slaydın ortasına 10 μL 4",6-diamino-2-fenilindol (DAPI) yerleştirerek numuneleri boyayın ve boyayı numuneler boyunca yayan bir lamel yerleştirin. Slaytları WB filtreli bir floresan fotomikroskop altında inceleyin.
       DİKKAT: DNA fotodegradasyonunu önlemek için tüm süreç karanlıkta gerçekleştirilmelidir.
   11. Nükleoidden DNA göçünün uzunluğunu değerlendirerek DNA hasarını ölçün. Bu durumda, örtüşme olmadan rastgele seçilen 100 hücrede görsel olarak belirleyin. DNA hasarını dört sınıfa ayırın: 0-I (hasar yok), II (minimum hasar), III (orta hasar) ve IV (maksimum hasar). Verileri, ortalama hasarlı hücre sayısı (sınıf II-IV'ün toplamı) ve her tedavi grubu için ortalama kuyruklu yıldız skoru olarak ifade edin. Bu verilerden, aşağıdaki denklemi (8) kullanarak her bir test organizması için genetik hasar indeksini (GDI) hesaplayın:
       GDI = (1[I] + 2[II] + 3[III] + 4[IV])/N[I-IV]) (8)
       burada I-IV, nükleoid hasarının tipini temsil eder ve NI-NIV, Pitarque ve ^ark.40'a göre puanlanan toplam nükleoid sayısını temsil eder.

5. İlişkili biyobelirteçler

NOT: Son zamanlarda, Beliaeff ve Burgeot⁴⁹ tarafından önerilen ve neotropikal anuranlar için uyarlanan biyobelirteç yanıt (IBR) indeksi kullanılarak biyobelirteçler her düzeyde entegre edilebilir. IBR, tüm biyobelirteç yanıtlarını entegre eden sayısal bir değer sağlar; daha yüksek IBR değerleri, daha yüksek stres seviyelerini gösterir⁴⁹. Belirli bir istasyon için IBR tahmini veya belirli bir anketin tedavisi açısından, nihai puanı belirlemek için ardışık veri işleme adımları aşağıdaki gibidir:

1. Bireysel sonuçlar mevcut olduğunda ortalama tahmini (X) hesaplayın; Aksi takdirde, her örnekleme istasyonunda havuza alınan örnekten alınan değeri kullanın.
2. Her bir biyobelirteç için, yapılacak karşılaştırmalara bağlı olarak, tüm istasyonlar ve/veya anketler için X'in genel ortalamasını (m) ve standart sapmasını (s) hesaplayın.
3. Y'yi elde etmek için X'i standartlaştırın.Y adlı bir değer hesaplayın: Y = (X- m)/s.
4. Z değerini aşağıdaki gibi hesaplayın: Z = Y veya Z = -Y, sırasıyla, bir stres etkenine yanıt olarak inhibisyon veya aktivasyona karşılık gelen bir biyolojik etki durumunda.
5. Son olarak, S = Z + | ile skoru (S) hesaplayınMin|, burada S ≥ 0 ve |Min| belirlenen minimum mutlak değerdir.
6. Her bir biyobelirteç (Si) için S değerini hesapladıktan ve IBR'yi elde etmek için toplamayı gerçekleştirdikten sonra bir örümcek veya yıldız diyagramı çizin.
   NOT: Hesaplamaların herhangi bir ayrıntısı için orijinal makaleye⁴⁹ bakın.

Sonuçlar

Burada sunulan tüm biyobelirteç teknikleri basit, hızlı, kullanışlı, hassas, düşük maliyetli ve doğru yöntemlerdir. Her biyobelirteç için aşağıdakilere dikkat etmek önemlidir.

Bireysel seviye
Ölçekli kütle indeksi
Milimetre ölçeğinde fotoğraf çekmek, yazılımı kalibre etmek için bu değer kullanılacağı için büyük önem taşır ve bu, SVL değişkenini çekerken kaliper ölçümüne gör...

Tartışmalar

Bireysel düzeydeki biyobelirteçlerin belirlenmesi çok basit ve çok düşük maliyetlidir, çünkü bu biyobelirteçlerin incelenmesi genellikle herhangi bir araştırma laboratuvarında bulunan sadece birkaç ekipman parçasını gerektirir. Ek olarak, bu biyobelirteçler hayvanların sağlığı ve zindeliği hakkında genel bilgi sağlar. Her protokolde kullanılan hayvan sayısı, güvenilir sonuçlar elde etmek için kritik öneme sahiptir. Verilerin değişkenliği nedeniyle, he...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Analytical scale
Electrophoresis power supply	Enduro	E0203-250V
Eosin	Merck
Fluorescence photomicroscope	Olympus	BX50	Equipped with an appropriate filter combination
Hematoxylin of Harris	Merck
High resolution photo camera			>16 megapixels
Homogenizer
Horizontal electrophoresis chamber	Sigma
Microcentrifuge	Denver Instrument
Microscope	Leica	DM4000 B	Equipped with image capture system Leica DFC 280
Microtome	Leica	2265
Paraplast	Sigma	P3558
Personal Computer			Eqquiped with Mac OS X, Lynux or Windows
Refrigerated centrifuge
UV–Vis spectrophotometer	Rayleigh	723G	With UV-lamp