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Resumo

Neste trabalho, são apresentados métodos ecotoxicológicos padronizados para a avaliação de biomarcadores em espécies de anuros neotropicais. Especificamente, este artigo detalha várias metodologias em diferentes escalas de avaliação ecotoxicológica, como os níveis genético, celular-histológico, bioquímico, morfológico e individual.

Resumo

As novas questões em ecotoxicologia destacam a importância da aplicação de uma bateria de biomarcadores, pois isso resulta em previsões ecotoxicológicas que melhoram não apenas a interpretação dos efeitos dos estressores ambientais sobre os organismos, mas também a determinação de seu possível impacto. Sabe-se que o uso de biomarcadores ecotoxicológicos em diferentes níveis de organização permite a predição das respostas biológicas dos organismos a estressores ambientais, o que é útil na avaliação de riscos ambientais.

No entanto, é necessário considerar a otimização de procedimentos básicos, gerar dados históricos em grupos controle e empregar bioensaios específicos para avaliar as respostas em órgãos e tecidos, a fim de elucidar a natureza e a variação dos efeitos observados. Portanto, o presente trabalho tem como objetivo descrever várias metodologias ecotoxicológicas empregadas em todos os estágios de anuros neotropicais em diferentes níveis ecológicos e validá-las como biomarcadores úteis para serem usados tanto na vida selvagem quanto em condições de laboratório. Neste trabalho, esses biomarcadores foram aplicados em nível individual/organísmico (índice de condição corporal), histológico/fisiológico (histopatologia, análises histométricas e pigmentares), bioquímico (enzimas de estresse oxidativo) e nível genético (dano direto e oxidativo no DNA por ensaio cometa).

Embora essas metodologias tenham pequenas variações ou modificações dependendo da espécie, essas técnicas fornecem biomarcadores eficazes para avaliar o efeito de xenobióticos em anuros, que possuem certas características que os tornam espécies indicadoras úteis de ecossistemas aquáticos e terrestres. Em conclusão, a bateria de biomarcadores empregada no presente estudo mostrou-se adequada para estimar respostas tóxicas em anuros neotropicais e pode ser ainda recomendada como bioindicadores para identificar o impacto de poluentes nos ecossistemas aquáticos da região. Finalmente, recomenda-se alcançar a padronização desses importantes biomarcadores para anuros em regiões específicas, bem como possivelmente incluí-los nas avaliações de risco e na tomada de decisões.

Introdução

A entrada de estressores ambientais em corpos d'água naturais pode afetar a saúde do ecossistema aquático1. A exposição a esses estressores ambientais pode afetar a sobrevivência ou a aptidão dos organismos aquáticos por meio de diferentes mecanismos de toxicidade, incluindo a exposição direta (tanto a curto quanto a longo prazo)2. Portanto, bioensaios laboratoriais padronizados para avaliar desfechos toxicológicos relacionados à aptidão e sobrevivência podem ser uma estimativa não confiável dos muitos efeitos indiretos do estresse no campo. Além disso, alterações nos níveis fisiológicos normais e efeitos sobre os indivíduos, como em termos de captura de presas, podem ser melhores indicadores a longo prazo do impacto na sobrevivência e aptidão reprodutiva dos organismos e, em última análise, na saúde do ecossistema 1,3. Prever mudanças na composição e função do ecossistema, bem como na saúde do organismo, com base em um conjunto conhecido de parâmetros ambientais e concentrações de contaminantes, é importante para melhorar o gerenciamento da poluição1.

Os biomarcadores são definidos como alterações bioquímicas, fisiológicas ou histológicas devido à exposição ou aos efeitos de produtos químicos xenobióticos 4,5. Os biomarcadores têm se mostrado muito úteis como sinais de alerta precoce 4,5. Uma questão importante que os biomarcadores ajudam a responder é se certos estressores estão presentes em concentrações altas o suficiente no ambiente para causar efeitos adversos. Essas informações contribuem para avaliar se vale a pena investigar a natureza e a extensão do dano e dos agentes causadores ou se não devem ser investidos mais recursos nesse caso 6,7,8. Além disso, uma vez que o conceito de avaliar um único biomarcador como bioindicador pode não ser adequado 5,7,8,9,10, há uma tendência crescente de realizar uma avaliação abrangente de múltiplos biomarcadores, a fim de detectar sinais de alerta precoce e, assim, evitar efeitos irreversíveis nos ecossistemas.

É muito importante notar que todos os efeitos tóxicos começam com a interação de um estressor com biomoléculas. Nesse sentido, os efeitos podem se espalhar pelos níveis de organização bioquímica, subcelular, celular, tecidual, de órgão, individual, populacional, comunitária, de ecossistema, de paisagem e biosférica. As células são o principal local de interação entre os estressores ambientais e os sistemas biológicos. Assim, a compreensão dos efeitos moleculares e genéticos permite que os pesquisadores associem baixos e altos níveis de organização ecológica e os ajuda a prever o efeito de poluentes ambientais, por exemplo, na saúde humana, que ainda não foram testados5. Além disso, devido à alta especificidade das células, elas não são úteis apenas para avaliar poluentes ambientais, mas também a saúde humana 5,11. Portanto, entender os efeitos dos estressores no nível bioquímico pode fornecer informações sobre as causas dos efeitos observados e permitir que eles sejam conectados com aqueles no próximo nível superior5. Além disso, ao compreender os mecanismos bioquímicos dos estressores, os efeitos de novos estressores que ainda não foram avaliados toxicologicamente podem ser previstos em relação a outros contaminantes bem conhecidos com base em suas semelhanças de função. Na presença de vários estressores ambientais, os biomarcadores genéticos e bioquímicos podem fornecer informações valiosas sobre os efeitos específicos observados. Além disso, avaliações histoquímicas relacionadas a alterações bioquímicas podem fornecer informações sobre toxicodinâmica5. Em suma, é necessária uma análise abrangente de biomarcadores celulares, bioquímicos e histológicos10,12, e esse tipo de análise, por sua vez, deve ser incluído em programas de biomonitoramento de espécies locais 5,13,14.

O estudo de biomarcadores em condições de laboratório pode, no entanto, apresentar algumas dificuldades, incluindo dificuldades na detecção de efeitos subletais e impactos crônicos após exposição a poluentes e na validação e padronização dos métodos empregados, bem como as respostas complexas dependentes do tempo ou da dose, as ligações pouco claras ou indeterminadas com a aptidão e a falta de modelos mecanicistas integrados1, 4. Para resolver esses problemas, a solução não é aumentar o número de biomarcadores medidos, mas projetar cuidadosamente estudos e hipóteses testáveis que contribuam para explicar as bases mecanicistas dos efeitos químicos em organismos inteiros4.

As novas questões em ecotoxicologia destacam a importância da aplicação de uma bateria de biomarcadores para gerar previsões ecotoxicológicas que melhorem a interpretação dos efeitos dos estressores ambientais sobre os organismos, bem como a tomada de decisão sobre seu possível impacto. Além disso, a importância de combinar os conceitos - biomarcadores e bioindicadores - nas avaliações de risco ambiental e no biomonitoramento é que isso permitirá aos pesquisadores determinar se os organismos em um ambiente específico de interesse são fisiologicamente normais ou estressados. A abordagem adotada neste estudo se assemelha à da análise bioquímica realizada em humanos. Nesse sentido, uma bateria de biomarcadores pode ser analisada para verificar se um organismo é saudável tanto no campo quanto no laboratório6. Finalmente, os biomarcadores contribuirão para as avaliações de risco ecológico de duas maneiras: (1) avaliando a exposição de espécies raras e/ou de vida longa e (2) testando hipóteses sobre os mecanismos de impactos químicos em diferentes níveis de organização biológica4.

Na última década, biomarcadores têm sido utilizados em anuros para biomonitoramento da exposição a contaminantes citotóxicos e genotóxicos. Dentre estas, as técnicas que têm sido utilizadas com mais frequência são o ensaio de micronúcleo (MN) e o ensaio cometa ou a indução de quebras de DNA de fita simples por ensaio de eletroforese em gel de célula única (SCGE). Além disso, essas técnicas têm sido usadas com sucesso para estimar o dano ao DNA induzido por vários estressores ambientais em vários anuros neotropicais 14,15,16,17,18,19. Outros biomarcadores podem ser usados para examinar mudanças no estado oxidativo em organismos expostos a poluentes ambientais 16,17,18,19. O estresse oxidativo é uma resposta à exposição a diferentes xenobióticos, levando a vários efeitos prejudiciais, inclusive na capacidade antioxidante dos indivíduos expostos 5,6,7,19,20.

Em estudos ecotoxicológicos, as espécies bioindicadoras são utilizadas por serem organismos que identificam as interações de longo prazo e os efeitos adversos de estressores ambientais em níveis organizacionais mais altos (por exemplo, níveis de organismo, população, comunidade e ecossistema)10,20,21. Ao integrar os dois conceitos - biomarcadores e bioindicadores - as espécies podem ser rastreadas para definir amplamente estruturas ou processos bioquímicos, fisiológicos ou ecológicos que estão correlacionados ou ligados a efeitos biológicos medidos em um ou mais níveis de organização biológica. Por fim, o grande desafio de utilizar ambos os conceitos para melhorar as estimativas da toxicidade de um estressor está relacionado à análise de biomarcadores e bioindicadores que têm alta utilidade na avaliação de riscos ecológicos20. Nesse sentido, há consenso sobre a relevância do emprego de biomarcadores e bioindicadores como sinais de alerta precoce, pois oferecem informações relevantes sobre a resposta de um organismo teste a estressores ambientais 12,20,21.

Os anfíbios são um dos grupos de organismos mais ameaçados e em rápido declínio em todo o mundo. Uma das principais razões para esse declínio são os poluentes que entram em seu habitat, como pesticidas, metais e poluentes emergentes 22,23,24,25. Os anuros possuem várias características que os tornam úteis como espécies bioindicadoras, como sua pele permeável, estreita relação com a água e sensibilidade à poluição ambiental 2,23,24. Essas características tornam os anfíbios bioindicadores eficazes da saúde ambiental 7,8,22,23,24,26.

No entanto, é necessário não apenas considerar a otimização de procedimentos básicos e a geração de dados históricos em grupos controle, mas também empregar bioensaios específicos para avaliar respostas em órgãos e tecidos para elucidar a natureza e a variação dos efeitos observados nos bioindicadores. Nesse sentido, o presente trabalho tem como objetivo descrever diversas metodologias ecotoxicológicas a serem empregadas em todos os estágios de anuros neotropicais em diferentes níveis ecológicos e validá-las como biomarcadores úteis a serem empregados tanto em condições de vida selvagem quanto de laboratório. Este trabalho apresenta uma bateria de biomarcadores que podem ser integrados e que foram comprovados para biomonitoramento laboratorial e de fauna silvestre em anuros expostos a estressores ambientais.

Protocolo

As técnicas a seguir incluem o sacrifício prévio do animal, que foi realizado de acordo com os padrões éticos internacionais 46,47,48, e a subsequente dissecção e ablação dos órgãos. Os animais foram capturados sob autorização do Ministério do Meio Ambiente, Agricultura e Produção da Província de San Luis (Resolução 49-PMA2019). Os métodos de sacrifício e eutanásia dos animais foram devidamente aprovados pelos protocolos do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (CICUA, protocolo Q-322/19) da Universidade Nacional de San Luis. Os procedimentos com anuros foram realizados de acordo com as diretrizes detalhadas em Garber et al.46, CONICET47 e INTA48. Além disso, todos os protocolos aqui apresentados são para espécies de anuros neotropicais em seus estágios de vida larval e adulta; já foram amplamente aceites pelos investigadores locais e são realizados ao abrigo de um protocolo rigoroso e com autorização do Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (CICUA) de cada universidade envolvida. Uma lista dos materiais e soluções utilizados é apresentada na Tabela de Materiais e na Tabela 1.

1. Nível individual: Condição corporal e índices hepáticos e gonadais

  1. Índice de condição corporal: Índice de massa escalonado
    NOTA: Este índice pode ser usado tanto com adultos quanto com juvenis e larvas. Essa metodologia é baseada em Peig e Green27, com pequenas modificações para anuros de acordo com Brodeur et al.28,30 e MacCracken e Stebbings29.
    1. Registre a massa corporal de cada amostra usando uma balança analítica de precisão.
    2. Coloque cada espécime em uma folha milimétrica e tire uma fotografia a uma distância de ~ 15 cm.
      NOTA: É importante tirar sempre fotografias à mesma distância.
    3. Análise de fotografia:
      NOTA: As fotografias podem ser analisadas com o programa ImageJ, que está disponível gratuitamente online (https://imagej.nih.gov/ij/index.html), ou com qualquer outro programa de análise de imagem que permita fazer medições a partir de uma escala incluída na fotografia.
      1. Meça o comprimento focinho-cloacal (SVL) de cada amostra usando a ferramenta de medição do programa ImageJ e primeiro consulte uma medida conhecida na folha milimétrica.
        NOTA: Nos girinos, a medida do comprimento do corpo deve ser feita até o tubo cloacal, desconsiderando a nadadeira caudal.
    4. Índice de massa escalonado (S)
      1. Com os dados obtidos da massa corporal e do CRS de cada anuro, construa uma linha de regressão da função de potência não linear da massa corporal (eixo y) contra o CVS (eixo x).
      2. Calcule o comprimento médio com os dados do CRV de todos os indivíduos medidos da população estudada.
      3. Por fim, calcule o índice de massa escalonado (S) de acordo com Peig eGreen27 e Brodeur et al.28 usando a equação (1):
        S = Mi(L0/Li)b (1)
        onde Mi e Li são massa corporal e SVL do indivíduo i, respectivamente; b é o expoente de escala estimado por uma regressão de função de potência não linear28; L0 é o comprimento médio para a população estudada; e S é a massa corporal prevista para o indivíduo i quando seu SVL é padronizado para o valor L0 .
        NOTA: É importante notar que b é uma constante específica da espécie que também pode ser específica do sexo em espécies sexualmente dimórficas.
  2. Índice hepatossomático: Índice hepático escalonado
    NOTA: Quanto ao índice de condição corporal, este índice pode ser usado com indivíduos em todos os estágios de desenvolvimento. A metodologia é baseada em Brodeur et al.28.
    1. Registar o SVL de cada amostra de acordo com os passos 1.1.2 e 1.1.3.
    2. Eutanasiar indivíduos de acordo com os padrões éticos para anfíbios anuros 46,47,48.
    3. Remova todo o fígado e registre sua massa em uma balança analítica de precisão com precisão de miligrama.
    4. Com os dados obtidos da massa hepática e do CRS de cada anuro, construa uma linha de regressão da função de potência não linear da massa hepática (eixo y) contra o CVS (eixo x).
    5. Calcule o comprimento médio com os dados do CRV de todos os indivíduos medidos da população estudada.
    6. Calcule o índice hepático escalonado (DEL) de acordo com Brodeur et al.28 usando a equação (2):
      SLI = Lmi (L0/Li)b (2)
      onde Lmi e Li são a massa hepática e SVL do indivíduo i, respectivamente; b é o expoente de escala estimado por uma regressão de função de potência não linear28; L0 é o comprimento médio para a população estudada; e o DEL é a massa hepática prevista para o indivíduo i quando seu SVL é padronizado para o L0.
  3. Índice gonadal: Índice gonadal em escala
    NOTA: Essa metodologia é baseada em Brodeur et al.30 e é útil apenas em indivíduos adultos. É importante ressaltar que os índices masculino e feminino devem ser analisados separadamente, pois variam em escalas distintas.
    1. Registar o SVL de cada amostra de acordo com os passos 1.1.2 e 1.1.3.
    2. Eutanasiar indivíduos de acordo com os padrões éticos para anfíbios anuros 46,47,48.
    3. Remova as gônadas direita e esquerda e registre a massa em uma balança analítica de precisão com precisão
    4. Com os dados obtidos da massa da gônada e do SVL de cada anuro, construa uma linha de regressão da função de potência não linear da massa da gônada (eixo y) contra o SVL (eixo x), semelhante ao passo 1.1.4.1 e passo 1.2.3.
    5. Calcule o comprimento médio com os dados do CRV de todos os indivíduos medidos da população estudada.
    6. Estimar o índice gonadal escalonado (SGI) de acordo com Brodeur et al.30 para cada animal usando a equação (3):
      SGI = Gmi(L0/Li)b (3)
      onde Gmi e Li são a massa gonadal e SVL do indivíduo i, respectivamente, b é o expoente de escala estimado por uma regressão não linear da função de potência por Brodeur et al.30, L0 é o comprimento médio para a população estudada e SGI é a massa gonadal prevista para um indivíduo i quando seu SVL é padronizado para L0.

2. Nível morfológico-histológico

NOTA: Para esta análise, é necessário o uso de cortes histológicos. O primeiro passo é coletar o tecido.

  1. Fixação e desidratação
    1. Use uma solução fixadora para preservar as estruturas. Para tecidos anuros, use preferencialmente metacarna ou solução de Bouin, recomendada sobre o restante das soluções de fixação (Tabela 1).
      NOTA: Todas as substâncias devem ser misturadas no momento do uso.
    2. Coloque girinos ou um fragmento de tecido de 50-100 mg em um tubo cônico com 1-2 mL de solução fixadora a 4 ° C por 3 h. Lave o lenço no mesmo volume de álcool etílico 70% por 30 min.
    3. Coloque o tecido em uma solução fresca de álcool etílico a 70%.
      NOTA: É possível interromper o procedimento neste momento por alguns dias antes de continuar com a desidratação.
    4. Desidrate o tecido em uma série de soluções alcoólicas: álcool etílico 80% (10 min), álcool 90% (10 min), álcool etílico 100% (10 min) e álcool etílico 100% (10 min).
    5. Realize a diafanização (limpeza) 2 x 10 min em xileno.
    6. Derreta a parafina em um copo. Mergulhe o lenço de papel por 10 min. Remova o tecido e coloque em um molde histológico com parafina derretida. Espere solidificar à temperatura ambiente.
    7. Coloque seções de 3 μm feitas em um micrótomo rotativo em uma lâmina de vidro.
  2. Análise histométrica
    1. Manchar as seções de tecido em hematoxilina-eosina31.
    2. Use 10-20 fotomicrografias para medição com uma objetiva de 100x em um microscópio óptico. Analise 5-10 células hepáticas em cada fotomicrografia.
      NOTA: Aqui, o fígado foi usado como modelo para descrever a técnica. É possível usar outros tecidos; Certifique-se de que a objetiva do microscópio óptico a ser usado seja adequada ao tipo de tecido. É necessário ser capaz de ver e identificar as células a serem medidas.
  3. Histopatologia
    1. Depois de corar os cortes de tecido em hematoxilina-eosina32, examine 5-10 cortes histológicos sob as objetivas de 10x, 20x, 40x e 100x.
    2. Procure alterações teciduais e estime o índice de grau de alterações teciduais (DTC) conforme descrito por Bernet et al.32 usando a equação (4):
      DTC = Σalt. (um × w)    Eletrônicos (4)
      onde Σalt é a soma da alteração; a representa o estágio de dano (0, ausente; 1, baixo; 2, moderado; 3, alto); e w representa o grau de reversibilidade do dano (1, reversível; 2, parcialmente reversível; 3, irreversível).
      NOTA: Aqui, o fígado foi usado como modelo para descrever a técnica. É possível usar outros tecidos; Certifique-se de que a objetiva do microscópio óptico a ser usado seja adequada ao tipo de tecido.
  4. Sistema pigmentar
    1. Depois de corar as lâminas em hematoxilina-eosina, examine 10-20 fotomicrografias com uma objetiva de 20x.
    2. Quantificar a área ocupada pela melanina medindo as diferenças na intensidade da coloração usando o software Image Pro-Plus de acordo com Santos et al.33.
    3. Abra o software Image Pro Plus 6.0®.
    4. Selecione Menu e barra de ferramentas: Biológico.
    5. Selecione a Calibração espacial da ampliação usada para tirar as fotomicrografias.
    6. Abra uma imagem histológica.
    7. Selecione Contagem de ferramentas | Meça objetos.
    8. Clique no botão Selecionar cores .
    9. Selecione a ferramenta conta-gotas e marque a coloração a ser medida na imagem.
    10. Feche a janela e clique em Contagem.
    11. Selecione Exibir | Estatísticas para ver os resultados.

3. Nível bioquímico: Espécies reativas de oxigênio (ROS) e enzimas colinérgicas

  1. Homogeneização de amostras
    NOTA: Terminado o experimento, preserve as amostras (tecidos ou girinos) em solução salina tamponada com fosfato (PBS) se não forem processadas naquele momento por congelamento a -20 ° C (por 2 meses) ou -80 ° C (por 6 meses). Alternativamente, eles podem ser homogeneizados no momento de acordo com as recomendações propostas abaixo.
    1. Girinos
      1. Pesar 1 g de girino ou pool de girinos em uma balança analítica de precisão.
      2. Colocar 1 g de girinos num tubo cónico de 15 ml contendo 1 ml de PBS e mergulhá-lo num banho de gelo (4 °C).
      3. Homogeneizar com um homogeneizador com ponta de teflon adaptado a um tubo cónico e trabalhar em condições frias (4 °C).
        CUIDADO: Evite usar um grande número de rotações, pois isso pode destruir proteínas e aumentar a temperatura.
      4. Transfira o mesmo volume do homogeneizado líquido de cada amostra para dois tubos de microcentrífuga de 2 mL rotulados e trabalhe em condições frias (4 ° C).
      5. Centrifugar as amostras com o homogeneizado líquido durante 10 min a 4 °C e 9,520 × g.
      6. Finalmente, extraia o sobrenadante, coloque-o em tubos de microcentrífuga, rotule-o em alíquotas de 0,5 mL a 1 mL e conserve em freezer a -80 ° C (por 6 meses) ou -20 ° C (por 2 meses) até o ensaio enzimático.
    2. Adultos
      1. Remova o tecido de interesse (por exemplo, fígado, músculo, rim) e pese 1 g em uma balança analítica de precisão.
      2. Coloque o tecido em um tubo cônico de 50 mL contendo 1 mL de PBS e mergulhe-o em um banho de gelo (4 ° C).
      3. Homogeneizar com um homogeneizador com ponta de teflon adaptado a um tubo cónico e trabalhar a frio (4 °C).
        CUIDADO: Evite usar uma rotação alta, pois isso pode destruir proteínas e aumentar a temperatura.
      4. Transfira o mesmo volume do homogeneizado líquido de cada amostra para dois tubos de microcentrífuga de 2 mL rotulados e trabalhe a frio (4 °C).
      5. Centrifugar os tubos com o homogeneizado líquido durante 10 min a 4 °C e 9,520 × g.
      6. Por fim, extraia o sobrenadante, coloque-o em tubos de microcentrífuga, rotule em alíquotas de 0,5 mL a 1 mL e conserve em freezer a -80 ° C (por 6 meses) ou -20 ° C (por 2 meses) até o ensaio enzimático.
  2. Determinação de proteínas
    NOTA: O valor da proteína é obtido para estimar a atividade enzimática em relação à quantidade total de proteína, evitando a subestimação ou superestimação dos valores da atividade enzimática. Esta metodologia é baseada em Bradford34 com pequenas modificações para anuros:
    1. Prepare o reagente de Bradford (ver Tabela 1).
    2. Adicionar 100 mL de H3PO4 a 85% (p/v) ao Coomassie G-250 + etanol, e levar a um volume de 1 L com água destilada.
    3. Preparar a curva de calibração com albumina de soro bovino (BSA) como padrão proteico conhecido (Tabela 1).
    4. Preparar padrões de albumina em concentrações crescentes para uma cubeta de espectrofotómetro de 3 ml. Para obter um exemplo da curva padrão, consulte a Tabela 2.
    5. Medir a absorvância com um espectrofotómetro a 590 nm (comprimento de onda em que se forma o complexo do reagente e da proteína).
      NOTA: Realizar a reação de Bradford com a amostra para leitura no espectrofotômetro usando uma cubeta de vidro com volume máximo de 3 mL e um caminho óptico de 1 cm auxilia na determinação da proteína.
    6. Coloque os seguintes reagentes em uma cubeta nesta ordem: 2.000 μL do reagente de Bradford + X μL da amostra (X = 20 μL da amostra homogeneizada do órgão de interesse de um anuro adulto ou 40 μL da amostra homogeneizada de um girino).
    7. Finalmente, medir a absorvância no espectrofotómetro a 590 nm.
      NOTA: Não é necessário trabalhar a 4 °C.
  3. Catalase
    NOTA: Esta metodologia é baseada no Aebi35 com pequenas modificações para anuros.
    1. Incubar 1.900 μL de PBS + 40 μL de peróxido de hidrogênio (H202) + 20 μL da amostra (puro em girinos e diluído 1/25 para tecido adulto) em uma cubeta de quartzo de 3 mL com um comprimento de caminho de 1 cm.
      CUIDADO: Siga a ordem dada acima para a adição dos reagentes e da amostra durante a incubação. Os reagentes podem ser incubados à temperatura ambiente (25 °C), uma vez que os anuros são fisiologicamente ectotérmicos.
    2. Ler a cinética da catalase a 240 nm durante 2 min num espectrofotómetro UV.
    3. Calcular a actividade enzimática com a seguinte equação (5)35:
      k (mmol∙min-1∙mg-1 Prt) = (Δ absorbância/1.000)/concentração de proteína (5)
      NOTA: Nos estudos com preparações enzimáticas purificadas, a actividade específica k'0 é obtida dividindo k pelo coeficiente de extinção molar (e = 43,6); k' = (k/e).
  4. Glutationa S-transferase (GST)
    NOTA: Esta metodologia é baseada em Habig et al.36 com pequenas modificações para anuros.
    1. Incubar 300 μL de GST + 10 μL de 1-choro-2, 4-dinitrobenzeno (CDNB) (0,1 M) + 10 μL da amostra (puro em girinos e diluído 1/25 para tecido adulto) na cubeta.
      CUIDADO: Respeite a ordem de adição dos reagentes e a amostra fornecida acima durante a incubação. Os reagentes podem ser incubados à temperatura ambiente (25 °C), uma vez que os anuros são fisiologicamente ectotérmicos.
    2. Prepare o GST (Tabela 1).
    3. Ler a cinética GST a 340 nm durante 2 min no espectrofotómetro.
    4. Calcular a actividade enzimática com a seguinte equação (6):
      Taxa de atividade de GST (mmol/por minuto/mg de proteína) = ([Δ absorbância/1.000]/9,6 × 104)/concentração de proteína (6)
      Onde 9,6 mM−1 cm−1 = coeficiente de extinção molar.
  5. Peroxidação lipídica (TBARS)
    NOTA: Esta metodologia é baseada em Buege e Aust37 com pequenas modificações para anuros.
    1. Construa uma curva de calibração com MDA como padrão e 0,7% TBA (Tabela 3).
    2. Preparar a solução-padrão de MDA (10 mM) (Quadro 1). Efectuar a hidrólise de THP em MDA, colocando a solução num banho-maria a 50 °C durante 1 h.
    3. Prepare uma solução de 0,7% (p / v) de TBA (Tabela 1) usando um agitador de placa quente magnética.
    4. Em seguida, centrifugue os homogeneizados de amostra durante 30 min a 9.520 × g e 4 °C.
    5. Extrair 500 μL do sobrenadante, adicionar 100 μl de NaOH 6 M e colocar em banho termal a 60 °C durante 30 min.
    6. Após o banho termal, adicionar 250 μL de HClO4 a 35% e, em seguida, colocar em banho de gelo (4 °C) por 30 min.
    7. Após esse tempo, centrifugue a 9.520 × g por 12 min e extraia 300 μL do sobrenadante.
    8. Adicionar 300 μL de 0,7% de TBA ao sobrenadante (amostra) e colocar em banho termal (97,5 °C) durante 30 min.
    9. Ler a absorvância do complexo formado pela amostra e pela TBA a 532 nm e determinar a concentração de MDA nas amostras substituindo os valores de absorbância na equação da curva (figura 1).
  6. Acetilcolinesterase (AChE)
    NOTA: Esta metodologia é baseada na proposta por Ellman et al.38 com pequenas modificações para anuros.
    1. No momento da medição, configure os reagentes DTNB e iodeto de acetiltiocolina (ATCh).
    2. Prepare a reação DTNB (Tabela 1).
    3. Prepare a reação AChE (Tabela 1).
    4. Em uma célula de vidro com um caminho óptico de 1 cm, prepare a reação AChE colocando esses reagentes na seguinte ordem: 150 μL de tampão PBS (pH = 8) + 150 μL de DTNB + 50 μL de ATCh + 10 μL da amostra (puro em girinos e diluído 1/10 em anuros adultos).
    5. Leia a cinética AChE a 412 nm por 2 min à temperatura ambiente.
    6. Obtenha o valor da atividade AChE usando a seguinte equação (7):
      Taxa de atividade da AChE (proteína mmol∙min-1∙mg-1 ) = ([Δ absorbância/1.000]/1,36)/concentração de proteína (7)

4. Nível genético e celular: Ensaio de micronúcleo e cometa

  1. Ensaio de micronúcleo (MN)
    NOTA: A metodologia está de acordo com a proposta por Fenech39 com pequenas modificações para anuros neotropicais.
    1. Anestesiar os espécimes por imersão em água gelada (4 °C) e obter amostras de sangue por seccionamento atrás do opérculo em girinos ou por punção cardíaca em adultos.
    2. Esfregue duas gotas de sangue periférico das amostras em lâminas pré-limpas.
    3. Em seguida, seque as lâminas ao ar, fixe com metanol frio a 100% (v/v) (4 °C) por 20 min e, em seguida, cove com solução de Giemsa a 5% por 12 min.
    4. Faça com que um pesquisador codifique e codifique cegamente os slides com ampliação de 1.000x.
    5. Determine a frequência de MNs analisando 1.000 eritrócitos maduros de cada amostra e expresse como o número total de MNs por 1.000 células.
    6. Use os seguintes critérios para a identificação correta de MNs:
      1. Procure MNs com diâmetros menores que 1/3 do núcleo principal.
      2. Certifique-se de que a coloração do MN não seja refratável, mas tenha uma intensidade de coloração igual ou mais clara que a do núcleo principal.
      3. Procure um limite MN que seja distinguível do limite do núcleo principal sem qualquer conexão com o núcleo ou sobreposição com o núcleo principal.
      4. Certifique-se de que o número de MNs nas células não exceda mais de quatro MNs associados ao núcleo.
  2. Ensaio cometa ou eletroforese em gel de célula única (SCGE)
    1. Anestesiar amostras por imersão em água gelada e obter amostras de sangue seccionando atrás do opérculo em girinos ou por punção cardíaca em adultos.
    2. Diluir o sangue com 1 mL de PBS, centrifugar (381 × g, 9 min) e ressuspender em um volume final de 50 mL de PBS.
    3. Misture 30 μL da amostra de sangue em 70 μL de agarose de baixo ponto de fusão (LMPA) a uma concentração de 0,5% de agarose para formar a camada 2. Em seguida, colocar 50 μL da camada 2 numa lâmina previamente revestida com a camada 1 contendo 100 μL de agarose de ponto de fusão normal a 0,5%.
    4. Cubra a lâmina com uma lamínula e coloque no frio (4 °C) por 10 min para solidificar a camada 2.
    5. Após a solidificação, remova a lamínula e forme a terceira camada depositando 100 μL de LMPA a 0,5%.
    6. Quando a terceira camada solidificar, remova a lamínula e mergulhe cada lâmina em um frasco de Coplin de 100 mL contendo solução de lise (Tabela 1) que foi preparada no mesmo dia e mantida a 4 ° C. Coloque os frascos de Coplin em um banho frio por 1 h no escuro (4 ° C) para que ocorra a lise.
      NOTA: O experimento pode ser pausado e reiniciado posteriormente. Foi relatado que o período de lise dura de 1 h a 1 mês.
    7. No final da lise, remova as lâminas e mergulhe na solução tampão de eletroforese (Tabela 1) no tanque de eletroforese. Execute esta etapa no escuro por 15 minutos a 4 ° C para permitir que o DNA se desenrole. Após o desenrolamento do DNA nuclear, realize eletroforese no mesmo tampão a uma temperatura de 4 ° C por 10 min a 25 V e 250 mA.
    8. Ao final da eletroforese, neutralizar as amostras contidas nas lâminas 3 x 5 min adicionando 2 mL de solução de Tris-HCl (Tabela 1).
    9. Na última etapa da técnica de ensaio cometa, desidrate as amostras colocando-as em potes de Coplin de 100 mL contendo álcool (95%) a 4 ° C.
    10. Por fim, core as amostras colocando 10 μL de 4′,6-diamino-2-fenilindol (DAPI) no centro da lâmina e coloque uma lamínula que espalhe o corante por todas as amostras. Examinar as lâminas num fotomicroscópio de fluorescência com um filtro WB.
      CUIDADO: Todo o processo deve ser realizado no escuro para evitar a fotodegradação do DNA.
    11. Quantifique o dano ao DNA avaliando a duração da migração do DNA do nucleóide. Nesse caso, determine-o visualmente em 100 células selecionadas aleatoriamente sem sobreposição. Classifique o dano ao DNA em quatro classes: 0-I (sem dano), II (dano mínimo), III (dano médio) e IV (dano máximo). Expresse os dados como o número médio de células danificadas (soma das classes II-IV) e a pontuação média do cometa para cada grupo de tratamento. A partir destes dados, calcular o índice de danos genéticos (GDI) para cada organismo de ensaio utilizando a seguinte equação (8):
      GDI = (1[I] + 2[II] + 3[III] + 4[IV])/N[I-IV]) (8)
      onde I-IV representa o tipo de dano nucleóide e NI-NIV representa o número total de nucleóides pontuados de acordo com Pitarque et al.40.

5. Biomarcadores correlacionados

NOTA: Nos últimos tempos, os biomarcadores podem ser integrados em todos os níveis usando o índice de resposta a biomarcadores (IBR) proposto por Beliaeff e Burgeot49 e adaptado para anuros neotropicais. O IBR fornece um valor numérico que integra todas as respostas do biomarcador; valores mais altos de IBR indicam níveis mais altosde estresse 49. Em termos da estimativa do IBR para uma determinada estação ou tratamento de um determinado inquérito, as etapas sucessivas de processamento de dados para determinar a pontuação final são as seguintes:

  1. Calcule a estimativa média (X) quando os resultados individuais estiverem disponíveis; caso contrário, use o valor da amostra agrupada em cada estação de amostragem.
  2. Para cada biomarcador, calcule a média geral (m) e o desvio(s) padrão (s) de X para todas as estações e/ou pesquisas, dependendo das comparações a serem feitas.
  3. Padronize X para obter Y. Calcule um valor chamado Y: Y = (X-m)/s.
  4. Calcule o valor Z da seguinte forma: Z = Y ou Z = −Y, no caso de um efeito biológico correspondente, respectivamente, à inibição ou ativação em resposta a um estressor.
  5. Por fim, calcule a pontuação (S), com S = Z + |Min|, onde S ≥ 0 e |Min| é o valor absoluto mínimo determinado.
  6. Traçar um diagrama de aranha ou estrela depois de calcular o valor de S para cada biomarcador (Si) e realizar o resumo para obter o IBR.
    NOTA: consulte o documento original49 para obter detalhes sobre os cálculos.

Resultados

Todas as técnicas de biomarcadores apresentadas aqui são métodos simples, rápidos, convenientes, sensíveis, de baixo custo e precisos. Para cada biomarcador, é importante observar o seguinte.

Nível individual
Índice de massa escalonado
Tirar fotografias na escala milimétrica é de grande importância, pois esse valor será usado para calibrar o software, e isso resulta em melhor objetividade em relação à medi...

Discussão

Os biomarcadores no nível individual são muito simples de determinar e de custo muito baixo, pois o exame desses biomarcadores requer apenas alguns equipamentos que geralmente estão disponíveis em qualquer laboratório de pesquisa. Além disso, esses biomarcadores fornecem informações gerais sobre a saúde e a aptidão dos animais. O número de animais empregados em cada protocolo é fundamental para a obtenção de resultados confiáveis. Devido à variabilidade dos dados, é nece...

Divulgações

Os autores declaram não haver interesses conflitantes.

Agradecimentos

Os autores agradecem ao Instituto de Química de San Luis "Dr. Roberto Olsina" - Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Tecnológicas (INQUISAL-CONICET), Universidad Nacional de San Luis (Projeto PROICO 2-1914), Laboratório de Patologia Experimental (LAPEx) - Instituto de Biociências (INBIO) - Universidade Federal de Mato Grosso do Sul (UFMS), Cátedra de Citología - Universidad Nacional de La Plata (UNLP) e Agencia Nacional de Promoción Científica (FONCYT; PICT-2018-02570 e PICT-2018-01067) para apoio financeiro. Gostaríamos também de agradecer à falante nativa Lidia Unger e ao GAECI-UNSL (centro de assistência à redação científica) da Universidade Nacional de San Luis pela revisão do manuscrito.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Analytical scale
Electrophoresis power supply Enduro E0203-250V 
Eosin Merck
Fluorescence photomicroscope Olympus BX50Equipped with an appropriate filter combination
Hematoxylin of HarrisMerck
High resolution photo camera  >16 megapixels
Homogenizer
Horizontal electrophoresis chamber Sigma
MicrocentrifugeDenver Instrument
MicroscopeLeicaDM4000 BEquipped with image capture system Leica DFC 280
MicrotomeLeica2265
ParaplastSigmaP3558
Personal Computer Eqquiped with Mac OS X, Lynux or Windows
Refrigerated centrifuge
UV–Vis spectrophotometerRayleigh723GWith UV-lamp

Referências

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