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Resumen

En este trabajo se presentan métodos ecotoxicológicos estandarizados para la evaluación de biomarcadores en especies de anuros neotropicales. Específicamente, este artículo detalla varias metodologías a diferentes escalas de evaluación ecotoxicológica, como los niveles genético, celular-histológico, bioquímico, morfológico e individual.

Resumen

Las nuevas preguntas en ecotoxicología ponen de manifiesto la importancia de aplicar una batería de biomarcadores, ya que esto da como resultado predicciones ecotoxicológicas que mejoran no solo la interpretación de los efectos de los estresores ambientales sobre los organismos, sino también la determinación de su posible impacto. Es bien sabido que el uso de biomarcadores ecotoxicológicos en diferentes niveles de organización permite la predicción de las respuestas biológicas de los organismos a los factores de estrés ambiental, lo cual es útil en la evaluación de riesgos ambientales.

Sin embargo, es necesario considerar la optimización de los procedimientos básicos, generar datos históricos en grupos de control y emplear bioensayos específicos para evaluar las respuestas en órganos y tejidos con el fin de dilucidar la naturaleza y variación de los efectos observados. Por lo tanto, el presente trabajo tiene como objetivo describir varias metodologías ecotoxicológicas empleadas en todas las etapas de los anuros neotropicales a diferentes niveles ecológicos y validarlas como biomarcadores útiles para ser utilizados tanto en vida silvestre como en condiciones de laboratorio. En este trabajo, estos biomarcadores se aplicaron a nivel individual/organísmico (índice de condición corporal), histológico/fisiológico (histopatología, análisis histométrico y pigmentario), a nivel bioquímico (enzimas de estrés oxidativo) y a nivel genético (daño directo y oxidativo en el ADN mediante ensayo cometa).

Aunque estas metodologías tienen pequeñas variaciones o modificaciones dependiendo de la especie, estas técnicas proporcionan biomarcadores efectivos para evaluar el efecto de los xenobióticos sobre los anuros, los cuales poseen ciertas características que los convierten en especies indicadoras útiles de ecosistemas acuáticos y terrestres. En conclusión, la batería de biomarcadores empleados en el presente estudio ha demostrado ser adecuada para estimar las respuestas tóxicas en anuros neotropicales y puede recomendarse como bioindicador para identificar el impacto de los contaminantes en los ecosistemas acuáticos de la región. Por último, se recomienda lograr la estandarización de estos importantes biomarcadores para los anuros en regiones específicas, así como posiblemente incluirlos en las evaluaciones de riesgos y la toma de decisiones.

Introducción

La entrada de factores de estrés ambiental en los cuerpos de agua naturales puede afectar la salud del ecosistema acuático1. La exposición a estos factores de estrés ambiental puede afectar la supervivencia o la aptitud de los organismos acuáticos a través de diferentes mecanismos de toxicidad, incluida la exposición directa (tanto a corto como a largo plazo)2. Por lo tanto, los bioensayos de laboratorio estandarizados para evaluar los criterios de valoración toxicológicos relacionados con la aptitud física y la supervivencia pueden ser una estimación poco fiable de los muchos efectos indirectos del estrés en el campo. Además, las alteraciones en los niveles fisiológicos normales y los efectos sobre los individuos, como en términos de captura de presas, pueden ser mejores indicadores a largo plazo del impacto en la supervivencia y la aptitud reproductiva de los organismos y, en última instancia, en la salud del ecosistema 1,3. La predicción de los cambios en la composición y función de los ecosistemas, así como en la salud de los organismos, sobre la base de un conjunto conocido de parámetros ambientales y concentraciones de contaminantes, es importante para mejorar la gestión de la contaminación1.

Los biomarcadores se definen como cambios bioquímicos, fisiológicos o histológicos debidos a la exposición o a los efectos de productos químicos xenobióticos 4,5. Los biomarcadores han demostrado ser muy útiles como señales de alerta temprana 4,5. Una pregunta importante que los biomarcadores ayudan a responder es si ciertos factores estresantes están presentes en concentraciones lo suficientemente altas en el medio ambiente como para causar efectos adversos. Esta información contribuye a evaluar si vale la pena investigar la naturaleza y el alcance del daño y los agentes causales o si no se deben invertir más recursos en ese caso 6,7,8. Por otra parte, dado que el concepto de evaluar un solo biomarcador como bioindicador puede no ser adecuado 5,7,8,9,10, existe una tendencia creciente hacia la realización de una evaluación integral de múltiples biomarcadores con el fin de detectar señales de alerta temprana y, así, prevenir efectos irreversibles en los ecosistemas.

Es muy importante tener en cuenta que todos los efectos tóxicos comienzan con la interacción de un estresor con las biomoléculas. En este sentido, los efectos pueden afectar en cascada a través de los niveles de organización bioquímico, subcelular, celular, tisular, órgano, individuo, población, comunidad, ecosistema, paisaje y biosfera. Las células son el sitio principal de interacción entre los factores estresantes ambientales y los sistemas biológicos. Así, la comprensión de los efectos moleculares y genéticos permite a los investigadores asociar niveles bajos y altos de organización ecológica y les ayuda a predecir el efecto de los contaminantes ambientales, por ejemplo, en la salud humana, que aún no han sido probados5. Además, debido a la alta especificidad de las células, no solo son útiles para evaluar los contaminantes ambientales, sino también la salud humana 5,11. Por lo tanto, la comprensión de los efectos de los factores estresantes a nivel bioquímico puede proporcionar información sobre las causas de los efectos observados y permitir que se conecten con los del siguiente nivel superior5. Además, al comprender los mecanismos bioquímicos de los factores estresantes, se pueden predecir los efectos de nuevos factores estresantes que aún no se han evaluado toxicológicamente con respecto a otros contaminantes bien conocidos en función de sus similitudes en función. En presencia de diversos factores de estrés ambiental, los biomarcadores genéticos y bioquímicos pueden proporcionar información valiosa sobre los efectos específicos observados. Además de esto, las evaluaciones histoquímicas relacionadas con los cambios bioquímicos pueden proporcionar información sobre la toxicodinámica5. En resumen, es necesario un análisis exhaustivo de los biomarcadores celulares, bioquímicos e histológicos10,12, y este tipo de análisis, a su vez, debe incluirse en los programas de biomonitoreo de especies locales 5,13,14.

No obstante, el estudio de los biomarcadores en condiciones de laboratorio puede presentar algunas dificultades, entre ellas las dificultades en la detección de efectos subletales e impactos crónicos tras la exposición a contaminantes y en la validación y normalización de los métodos empleados, así como las complejas respuestas dependientes del tiempo o de la dosis, los vínculos poco claros o indeterminados con la idoneidad y la falta de modelos mecanicistas integrados1. 4. Para resolver estos problemas, la solución no es aumentar el número de biomarcadores medidos, sino diseñar cuidadosamente estudios e hipótesis comprobables que contribuyan a explicar las bases mecanicistas de los efectos químicos en organismos enteros4.

Las nuevas preguntas en ecotoxicología ponen de manifiesto la importancia de aplicar una batería de biomarcadores para generar predicciones ecotoxicológicas que mejoren la interpretación de los efectos de los estresores ambientales sobre los organismos, así como la toma de decisiones sobre su posible impacto. Por otra parte, la importancia de combinar ambos conceptos (biomarcadores y bioindicadores) en las evaluaciones de riesgos ambientales y el biomonitoreo es que esto permitirá a los investigadores determinar si los organismos en un entorno específico de interés son fisiológicamente normales o estresados. El enfoque adoptado en este estudio se asemeja al del análisis bioquímico que se lleva a cabo en humanos. En este sentido, se puede analizar una batería de biomarcadores para ver si un organismo está sano tanto en el campo como en el laboratorio6. Por último, los biomarcadores contribuirán a las evaluaciones de riesgos ecológicos de dos maneras: (1) evaluando la exposición de especies raras y/o longevas, y (2) probando hipótesis sobre los mecanismos de los impactos químicos en diferentes niveles de la organización biológica4.

En la última década, se han utilizado biomarcadores en anuros para el biomonitoreo de la exposición a contaminantes citotóxicos y genotóxicos. Entre estas, las técnicas que se han utilizado con mayor frecuencia son el ensayo de micronúcleos (MN) y el ensayo de cometa o la inducción de roturas de ADN monocatenario mediante ensayo de electroforesis en gel unicelular (SCGE). Además, estas técnicas se han utilizado con éxito para estimar el daño en el ADN inducido por diversos factores de estrés ambiental en varios anuros neotropicales 14,15,16,17,18,19. Otros biomarcadores pueden utilizarse para examinar los cambios en el estado oxidativo en organismos expuestos a contaminantes ambientales 16,17,18,19. El estrés oxidativo es una respuesta a la exposición a diferentes xenobióticos, lo que provoca varios efectos perjudiciales, entre ellos sobre la capacidad antioxidante de los individuos expuestos 5,6,7,19,20.

En los estudios ecotoxicológicos, las especies bioindicadoras se utilizan porque son organismos que identifican las interacciones a largo plazo y los efectos adversos de los estresores ambientales a niveles organizacionales superiores (por ejemplo, a nivel de organismos, poblaciones, comunidades y ecosistemas)10,20,21. Al integrar los dos conceptos, biomarcadores y bioindicadores, las especies pueden ser examinadas para definir ampliamente las estructuras o procesos bioquímicos, fisiológicos o ecológicos que están correlacionados o vinculados con los efectos biológicos medidos en uno o más niveles de organización biológica. Finalmente, el gran desafío de utilizar ambos conceptos para mejorar las estimaciones de la toxicidad de un estresor se relaciona con el análisis de biomarcadores y bioindicadores que tienen alta utilidad en la evaluación de riesgos ecológicos20. En este sentido, existe consenso sobre la relevancia de emplear biomarcadores y bioindicadores como señales de alerta temprana, ya que ofrecen información relevante sobre la respuesta de un organismo de prueba a estresores ambientales 12,20,21.

Los anfibios son uno de los grupos de organismos más amenazados y en rápido declive en todo el mundo. Una de las principales razones de esta disminución son los contaminantes que ingresan a su hábitat, como pesticidas, metales y contaminantes emergentes 22,23,24,25. Los anuros tienen varias características que los hacen útiles como especies bioindicadoras, como su piel permeable, su estrecha relación con el agua y su sensibilidad a la contaminación ambiental 2,23,24. Estas características hacen que los anfibios sean bioindicadores efectivos de la salud ambiental 7,8,22,23,24,26.

Sin embargo, es necesario no solo considerar la optimización de los procedimientos básicos y la generación de datos históricos en los grupos de control, sino también emplear bioensayos específicos para evaluar las respuestas en órganos y tejidos para dilucidar la naturaleza y variación de los efectos observados en los bioindicadores. En este sentido, el presente trabajo tiene como objetivo describir varias metodologías ecotoxicológicas para ser empleadas en todas las etapas de los anuros neotropicales a diferentes niveles ecológicos y validarlas como biomarcadores útiles para ser empleados tanto en fauna silvestre como en condiciones de laboratorio. En este trabajo se presenta una batería de biomarcadores que pueden integrarse y que han sido probados para el biomonitoreo de laboratorio y fauna silvestre en anuros expuestos a estresores ambientales.

Protocolo

Las siguientes técnicas incluyen el sacrificio previo del animal, que se llevó a cabo de acuerdo con las normas éticas internacionales 46,47,48, y la posterior disección y ablación de los órganos. Los animales fueron capturados bajo la autorización del Ministerio de Ambiente, Agricultura y Producción de la Provincia de San Luis (Resolución 49-PMA2019). Los métodos de sacrificio y eutanasia de los animales fueron debidamente aprobados por los protocolos del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (CICUA, protocolo Q-322/19) de la Universidad Nacional de San Luis. Los procedimientos con organismos anuros se llevaron a cabo de acuerdo con los lineamientos detallados en Garber et al.46, CONICET47 e INTA48. Además, todos los protocolos presentados aquí son para especies de anuros neotropicales en sus etapas de vida larvaria y adulta; ya han sido ampliamente aceptados por los investigadores locales y se llevan a cabo bajo un estricto protocolo y con la autorización del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (CICUA) de cada universidad involucrada. Una lista de los materiales y soluciones utilizados se presenta en la Tabla de Materiales y la Tabla 1.

1. Nivel individual: Condición corporal e índices hepáticos y gonadales

  1. Índice de condición corporal: Índice de masa escalonado
    NOTA: Este índice se puede utilizar tanto con adultos como con juveniles y larvas. Esta metodología se basa en Peig y Green27, con modificaciones menores para los anuros según Brodeur et al.28,30 y MacCracken y Stebbings29.
    1. Registre la masa corporal de cada espécimen utilizando una escala analítica de precisión.
    2. Coloque cada espécimen en una hoja milimétrica y tome una fotografía a una distancia de ~ 15 cm.
      NOTA: Es importante tomar fotografías siempre desde la misma distancia.
    3. Análisis fotográfico:
      NOTA: Las fotografías pueden ser analizadas con el programa ImageJ, que está disponible gratuitamente en línea (https://imagej.nih.gov/ij/index.html), o con cualquier otro programa de análisis de imágenes que permita realizar mediciones a partir de una escala incluida en la fotografía.
      1. Mida la longitud del hocico-cloaca (SVL) de cada espécimen utilizando la herramienta de medición del programa ImageJ y primero consulte una medida conocida en la hoja milimétrica.
        NOTA: En renacuajos, la medición de la longitud del cuerpo debe realizarse hasta el tubo cloacal, sin tener en cuenta la aleta caudal.
    4. Índice de masa escalonado (S)
      1. Con los datos obtenidos de la masa corporal y el SVL de cada anuro, construya una línea de regresión de la función de potencia no lineal de la masa corporal (eje y) contra el SVL (eje x).
      2. Calcular la longitud media con los datos de SVL de todos los individuos medidos de la población estudiada.
      3. Finalmente, calcule el índice de masa escalado (S) según Peig y Green27 y Brodeur et al.28 utilizando la ecuación (1):
        S = Mi(L0/Li)b (1)
        donde Mi y Li son la masa corporal y el SVL del individuo i, respectivamente; b es el exponente de escala estimado por una regresión de función de potencia no lineal28; L0 es la longitud media de la población estudiada; y S es la masa corporal predicha para el individuo i cuando su SVL se estandariza al valor L0 .
        NOTA: Es importante tener en cuenta que b es una constante específica de la especie que también podría ser específica del sexo en las especies sexualmente dimórficas.
  2. Índice hepatosomático: Índice hepático escalonado
    NOTA: En cuanto al índice de condición corporal, este índice se puede utilizar con individuos en todas las etapas de desarrollo. La metodología se basa en Brodeur et al.28.
    1. Registre la SVL de cada muestra de acuerdo con los pasos 1.1.2 y 1.1.3.
    2. Aplicar la eutanasia a las personas de acuerdo con las normas éticas para los anfibios anguros 46,47,48.
    3. Retire todo el hígado y registre su masa en una escala analítica de precisión al miligramo más cercano.
    4. Con los datos obtenidos de la masa hepática y la SVL de cada anuro, construya una línea de regresión no lineal de la función de potencia de la masa hepática (eje y) frente a la SVL (eje x).
    5. Calcular la longitud media con los datos de SVL de todos los individuos medidos de la población estudiada.
    6. Calcular el índice hepático escalonado (TEL) según Brodeur et al.28 utilizando la ecuación (2):
      SLI = Lmi (L0/Li)b (2)
      donde Lmi y Li son la masa hepática y SVL del individuo i, respectivamente; b es el exponente de escala estimado por una regresión de función de potencia no lineal28; L0 es la longitud media de la población estudiada; y el TEL es la masa hepática predicha para el individuo i cuando su SVL está estandarizado a L0.
  3. Índice gonadal: Índice gonadal escalonado
    NOTA: Esta metodología se basa en Brodeur et al.30 y es útil solo con individuos adultos. Es importante tener en cuenta que los índices masculinos y femeninos deben analizarse por separado, ya que varían en distintas escalas.
    1. Registre la SVL de cada muestra de acuerdo con los pasos 1.1.2 y 1.1.3.
    2. Aplicar la eutanasia a las personas de acuerdo con las normas éticas para los anfibios anguros 46,47,48.
    3. Retire las gónadas derecha e izquierda y registre la masa en una escala analítica de precisión al miligramo más cercano.
    4. Con los datos obtenidos de la masa de las gónadas y el SVL de cada anuro, construya una línea de regresión de la función de potencia no lineal de la masa de la gónada (eje y) contra SVL (eje x), similar a los pasos 1.1.4.1 y 1.2.3.
    5. Calcular la longitud media con los datos de SVL de todos los individuos medidos de la población estudiada.
    6. Estimar el índice gonadal escalonado (IGG) según Brodeur et al.30 para cada animal utilizando la ecuación (3):
      SGI = Gmi(L0/Li)b (3)
      donde Gmi y Li son la masa gonada y SVL del individuo i, respectivamente, b es el exponente de escala estimado por una regresión no lineal de la función de potencia de Brodeur et al.30, L0 es la longitud media para la población estudiada, y SGI es la masa gonada predicha para un individuo i cuando su SVL está estandarizado a L0.

2. Nivel morfológico-histológico

NOTA: Para este análisis, es necesario utilizar cortes histológicos. El primer paso es recolectar el tejido.

  1. Fijación y deshidratación
    1. Utilice una solución fijadora para preservar las estructuras. Para los tejidos de anuros, preferiblemente utilizar la solución de metacarn o Bouin, recomendada sobre el resto de las soluciones de fijación (Tabla 1).
      NOTA: Todas las sustancias deben mezclarse en el momento de su uso.
    2. Colocar renacuajos o un fragmento de tejido de 50-100 mg en un tubo cónico con 1-2 mL de solución fijadora a 4 °C durante 3 h. Lavar el pañuelo con el mismo volumen de alcohol etílico al 70% durante 30 min.
    3. Coloque el pañuelo en una solución fresca de alcohol etílico al 70%.
      NOTA: Es posible detener el procedimiento en este punto durante algunos días antes de continuar con la deshidratación.
    4. Deshidrate el tejido en una serie de soluciones alcohólicas: alcohol etílico al 80% (10 min), alcohol al 90% (10 min), alcohol etílico al 100% (10 min) y alcohol etílico al 100% (10 min).
    5. Realizar diafanización (aclarado) 2 x 10 min en xileno.
    6. Derrite la parafina en un vaso de precipitados. Remoja el pañuelo durante 10 min. Retire el tejido y colóquelo en un molde histológico con parafina derretida. Espera a que se solidifique a temperatura ambiente.
    7. Coloque secciones de 3 μm hechas en un micrótomo giratorio en un portaobjetos de vidrio.
  2. Análisis histométrico
    1. Teñir las secciones de tejido con hematoxilina-eosina31.
    2. Utilice de 10 a 20 fotomicrografías para la medición con un objetivo de 100x en un microscopio óptico. Analice de 5 a 10 células hepáticas en cada fotomicrografía.
      NOTA: Aquí, el hígado se utilizó como modelo para describir la técnica. Es posible utilizar otros tejidos; Asegúrese de que el objetivo del microscopio óptico que se va a utilizar es el adecuado para el tipo de tejido. Es necesario poder ver e identificar las células que se van a medir.
  3. Histopatología
    1. Después de teñir las secciones de tejido en hematoxilina-eosina32, examine de 5 a 10 secciones histológicas con objetivos de 10x, 20x, 40x y 100x.
    2. Busque cambios en los tejidos y estime el índice de grados de cambios en los tejidos (DTC) descrito por Bernet et al.32 utilizando la ecuación (4):
      DTC = Σalt. (A × W)    (4)
      donde Σalt es la suma de la alteración; a representa la etapa de daño (0, ausente; 1, bajo; 2, moderado; 3, alto); y w representa el grado de reversibilidad del daño (1, reversible; 2, parcialmente reversible; 3, irreversible).
      NOTA: Aquí, el hígado se utilizó como modelo para describir la técnica. Es posible utilizar otros tejidos; Asegúrese de que el objetivo del microscopio óptico que se va a utilizar es el adecuado para el tipo de tejido.
  4. Sistema pigmentario
    1. Después de teñir los portaobjetos con hematoxilina-eosina, examine 10-20 fotomicrografías con un objetivo de 20x.
    2. Cuantificar el área ocupada por melanina midiendo las diferencias en la intensidad de la tinción mediante el software Image Pro-Plus según Santos et al.33.
    3. Abra el software Image Pro Plus 6.0®.
    4. Seleccione Menú y barra de herramientas: Biológico.
    5. Seleccione la Calibración espacial de la ampliación utilizada para tomar las fotomicrografías.
    6. Abra una imagen histológica.
    7. Seleccione Recuento de herramientas | Objetos de medida.
    8. Haga clic en el botón Seleccionar colores .
    9. Seleccione la herramienta cuentagotas y marque el color que se medirá en la imagen.
    10. Cierre la ventana y haga clic en Recuento.
    11. Seleccione Ver | Estadísticas para ver los resultados.

3. Nivel bioquímico: especies reactivas de oxígeno (ROS) y enzimas colinérgicas

  1. Homogeneización de muestras
    NOTA: Una vez finalizado el experimento, conservar las muestras (tejidos o renacuajos) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) si no se van a procesar en ese momento mediante congelación a -20 °C (durante 2 meses) o -80 °C (durante 6 meses). Alternativamente, se pueden homogeneizar en el momento de acuerdo con las recomendaciones que se proponen a continuación.
    1. Renacuajos
      1. Pesar 1 g de un renacuajo o grupo de renacuajos en una balanza analítica de precisión.
      2. Colocar 1 g de renacuajos en un tubo cónico de 15 mL que contenga 1 mL de PBS y sumergirlo en un baño de hielo (4 °C).
      3. Homogeneizar con un homogeneizador con punta de teflón adaptado a un tubo cónico, y trabajar en condiciones de frío (4 °C).
        PRECAUCIÓN: Evite utilizar un gran número de revoluciones, ya que esto puede destruir las proteínas y elevar la temperatura.
      4. Transfiera el mismo volumen del homogeneizado líquido de cada muestra a dos tubos de microcentrífuga de 2 mL marcados y trabaje en condiciones frías (4 °C).
      5. Centrifugar las muestras con el homogeneizado líquido durante 10 min a 4 °C y 9.520 × g.
      6. Finalmente, extraiga el sobrenadante, colóquelo en tubos de microcentrífuga, etiquételo en alícuotas de 0,5 mL a 1 mL y conserve en un congelador a -80 °C (durante 6 meses) o -20 °C (durante 2 meses) hasta el ensayo enzimático.
    2. Adultos
      1. Extraiga el tejido de interés (por ejemplo, hígado, músculo, riñón) y pese 1 g en una balanza analítica de precisión.
      2. Coloque el tejido en un tubo cónico de 50 mL que contenga 1 mL de PBS y sumérjalo en un baño de hielo (4 °C).
      3. Homogeneizar con un homogeneizador con punta de teflón adaptado a un tubo cónico, y trabajar en frío (4 °C).
        PRECAUCIÓN: Evite usar rpm altas, ya que esto puede destruir las proteínas y elevar la temperatura.
      4. Transfiera el mismo volumen del homogeneizado líquido de cada muestra a dos tubos de microcentrífuga marcados de 2 mL y trabaje en frío (4 °C).
      5. Centrifugar los tubos con el homogeneizado líquido durante 10 min a 4 °C y 9.520 × g.
      6. Finalmente, extraiga el sobrenadante, colóquelo en tubos de microcentrífuga, etiquete en alícuotas de 0,5 mL a 1 mL y conserve en un congelador a -80 °C (durante 6 meses) o -20 °C (durante 2 meses) hasta el ensayo enzimático.
  2. Determinación de proteínas
    NOTA: El valor de la proteína se obtiene para estimar la actividad enzimática en relación con la cantidad total de proteína, evitando la subestimación o sobreestimación de los valores de la actividad enzimática. Esta metodología se basa en Bradford34 con pequeñas modificaciones para los anuros:
    1. Prepare el reactivo Bradford (consulte la Tabla 1).
    2. Añadir 100 mL de H3PO4 al 85% (p/v) a Coomassie G-250 + etanol, y llevar hasta un volumen de 1 L con agua destilada.
    3. Preparar la curva de calibración con albúmina sérica bovina (BSA) como patrón proteico conocido (Tabla 1).
    4. Prepare los patrones de albúmina en concentraciones crecientes para una cubeta de espectrofotómetro de 3 mL. Para ver un ejemplo de la curva estándar, véase la Tabla 2.
    5. Mida la absorbancia usando un espectrofotómetro a 590 nm (esta es la longitud de onda en la que se forma el complejo del reactivo y la proteína).
      NOTA: La realización de la reacción de Bradford con la muestra para su lectura en el espectrofotómetro utilizando una cubeta de vidrio con un volumen máximo de 3 mL y un recorrido óptico de 1 cm ayuda a la determinación de proteínas.
    6. Coloque los siguientes reactivos en una cubeta en este orden: 2.000 μL del reactivo Bradford + X μL de la muestra (X = 20 μL de la muestra homogeneizada del órgano de interés de un anuro adulto, o 40 μL de la muestra homogeneizada de un renacuajo).
    7. Finalmente, mida la absorbancia en el espectrofotómetro a 590 nm.
      NOTA: No es necesario trabajar a 4 °C.
  3. Catalasa
    NOTA: Esta metodología se basa en Aebi35 con modificaciones menores para los anuros.
    1. Incubar 1.900 μL de PBS + 40 μL de peróxido de hidrógeno (H202) + 20 μL de la muestra (pura en renacuajos y diluida 1/25 para tejido adulto) en una cubeta de cuarzo de 3 mL con una longitud de paso de 1 cm.
      PRECAUCIÓN: Siga el orden indicado anteriormente para la adición de los reactivos y la muestra durante la incubación. Los reactivos se pueden incubar a temperatura ambiente (25 °C) ya que los anuros son fisiológicamente ectotermos.
    2. Lea la cinética de la catalasa a 240 nm durante 2 minutos en un espectrofotómetro UV.
    3. Calcule la actividad enzimática con la siguiente ecuación (5)35:
      k (mmol∙min-1∙mg-1 Prt) = (Δ absorbancia/1.000)/concentración de proteína (5)
      NOTA: En estudios con preparaciones enzimáticas purificadas, la actividad específica k'0 se obtiene dividiendo k por el coeficiente de extinción molar, (e = 43,6); k' = (k/e).
  4. Glutatión S-transferasa (GST)
    NOTA: Esta metodología se basa en Habig et al.36 con modificaciones menores para los anuros.
    1. Incubar 300 μL de GST + 10 μL de 1-choro-2, 4-dinitrobenceno (CDNB) (0,1 M) + 10 μL de la muestra (pura en renacuajos y diluida 1/25 para tejido adulto) en la cubeta.
      ATENCIÓN: Respete el orden de adición de los reactivos y de la muestra indicado anteriormente durante la incubación. Los reactivos se pueden incubar a temperatura ambiente (25 °C) ya que los anuros son fisiológicamente ectotermos.
    2. Prepare el GST (Tabla 1).
    3. Lea la cinética del GST a 340 nm durante 2 minutos en el espectrofotómetro.
    4. Calcule la actividad enzimática con la siguiente ecuación (6):
      Tasa de actividad de GST (mmol/por minuto/mg de proteína) = ([Δ absorbancia/1.000]/9,6 ×10 4)/concentración de proteína (6)
      Donde 9,6 mM−1 cm−1 = coeficiente de extinción molar.
  5. Peroxidación lipídica (TBARS)
    NOTA: Esta metodología se basa en Buege y Aust37 con pequeñas modificaciones para los anuros.
    1. Construya una curva de calibración con MDA como estándar y 0.7% TBA (Tabla 3).
    2. Prepare la solución estándar de MDA (10 mM) (Tabla 1). Lleve a cabo la hidrólisis de THP a MDA colocando la solución en un baño de agua a 50 °C durante 1 h.
    3. Prepare una solución al 0,7% (p/v) de TBA (Tabla 1) utilizando un agitador de placa calefactora magnética.
    4. A continuación, centrifugar la muestra homogeneizada durante 30 min a 9.520 × g y 4 °C.
    5. Extraiga 500 μL del sobrenadante, agregue 100 μL de NaOH 6 M y colóquelo en un baño termal a 60 °C durante 30 min.
    6. Después del baño termal, añadir 250 μL de HClO4 al 35%, y colocar en un baño de hielo (4 °C) durante 30 min.
    7. Pasado ese tiempo, centrifugar a 9.520 × g durante 12 min, y extraer 300 μL del sobrenadante.
    8. Añadir 300 μL de TBA al 0,7% al sobrenadante (muestra) y colocar en un baño termal (97,5 °C) durante 30 min.
    9. Lea la absorbancia del complejo formado por la muestra y el TBA a 532 nm, y determine la concentración de MDA en las muestras sustituyendo los valores de absorbancia en la ecuación de la curva (Figura 1).
  6. Acetilcolinesterasa (AChE)
    NOTA: Esta metodología se basa en la propuesta por Ellman et al.38 con pequeñas modificaciones para los anuros.
    1. En el momento de la medición, configure los reactivos DTNB y yoduro de acetiltiocolina (ATCh).
    2. Prepare la reacción DTNB (Tabla 1).
    3. Prepare la reacción AChE (Tabla 1).
    4. En una celda de vidrio con un recorrido óptico de 1 cm, prepare la reacción de AChE colocando estos reactivos en el siguiente orden: 150 μL de tampón PBS (pH = 8) + 150 μL de DTNB + 50 μL de ATCh + 10 μL de la muestra (pura en renacuajos y diluida 1/10 en anuros adultos).
    5. Lea la cinética de AChE a 412 nm durante 2 minutos a temperatura ambiente.
    6. Obtenga el valor de la actividad AChE utilizando la siguiente ecuación (7):
      Tasa de actividad de AChE (proteína mmol∙min-1∙mg-1 ) = ([Δ absorbancia/1.000]/1,36)/concentración de proteína (7)

4. Nivel genético y celular: ensayo de micronúcleos y cometas

  1. Ensayo de micronúcleos (MN)
    NOTA: La metodología está de acuerdo con la propuesta por Fenech39 con ligeras modificaciones para los anuros neotropicales.
    1. Anestesiar los especímenes por inmersión en agua helada (4 °C) y obtener muestras de sangre por corte detrás del opérculo en renacuajos o por punción cardíaca en adultos.
    2. Unte dos gotas de sangre periférica de las muestras en portaobjetos previamente limpiados.
    3. A continuación, seque al aire los portaobjetos, fíjelos con metanol frío al 100% (v/v) (4 °C) durante 20 minutos y luego tiña con solución de Giemsa al 5% durante 12 minutos.
    4. Pida a un investigador que codifique y codifique a ciegas las diapositivas con un aumento de 1.000x.
    5. Determine la frecuencia de MN mediante el análisis de 1.000 eritrocitos maduros de cada espécimen y exprese como el número total de MN por cada 1.000 células.
    6. Utilice los siguientes criterios para la correcta identificación de las ON:
      1. Busque MN que tengan diámetros menores que 1/3 del del núcleo principal.
      2. Asegúrese de que la coloración del MN no sea refractable, sino que tenga una intensidad de tinción igual o más clara que la del núcleo principal.
      3. Busque un límite MN que se distinga del límite del núcleo principal sin ninguna conexión con el núcleo o que se superponga con el núcleo principal.
      4. Asegúrese de que el número de MN en las células no supere más de cuatro MN asociados con el núcleo.
  2. Ensayo de cometa o electroforesis en gel de célula única (SCGE)
    1. Anestesiar las muestras por inmersión en agua helada y obtener muestras de sangre seccionando detrás del opérculo en renacuajos o por punción cardíaca en adultos.
    2. Diluir la sangre con 1 mL de PBS, centrifugar (381 × g, 9 min) y resuspender en un volumen final de 50 mL de PBS.
    3. Mezcle 30 μL de la muestra de sangre en 70 μL de agarosa de bajo punto de fusión (LMPA) a una concentración del 0,5% de agarosa para formar la capa 2. A continuación, se colocan 50 μL de capa 2 sobre un portaobjetos previamente recubierto con capa 1 que contiene 100 μL de agarosa con un 0,5% de punto de fusión normal.
    4. Cubra el portaobjetos con un cubreobjetos y colóquelo en el frío (4 °C) durante 10 minutos para solidificar la capa 2.
    5. Después de la solidificación, retire el cubreobjetos y forme la tercera capa colocando 100 μL de LMPA al 0,5%.
    6. Cuando la tercera capa se solidifique, retire el cubreobjetos y sumerja cada portaobjetos en un frasco Coplin de 100 ml que contenga solución de lisis (Tabla 1) que se haya preparado el mismo día y se haya mantenido a 4 °C. Coloque los frascos Coplin en un baño frío durante 1 hora en la oscuridad (4 °C) para que se produzca la lisis.
      NOTA: El experimento se puede pausar y reiniciar más tarde. Se ha informado que el período de lisis dura de 1 h a 1 mes.
    7. Al final de la lisis, retire los portaobjetos y sumérjalos en la solución tampón de electroforesis (Tabla 1) en el tanque de electroforesis. Realice este paso en la oscuridad durante 15 minutos a 4 °C para permitir que el ADN se desenrolle. Después de desenrollar el ADN nuclear, realice la electroforesis en el mismo tampón a una temperatura de 4 °C durante 10 min a 25 V y 250 mA.
    8. Al final de la electroforesis, neutralizar las muestras contenidas en los portaobjetos 3 x 5 min añadiendo 2 mL de solución de Tris-HCl (Tabla 1).
    9. En el último paso de la técnica de ensayo del cometa, deshidrate las muestras colocándolas en frascos Coplin de 100 ml que contengan alcohol (95%) a 4 °C.
    10. Finalmente, tiña las muestras colocando 10 μL de 4′,6-diamino-2-fenilindol (DAPI) en el centro del portaobjetos, y coloca un cubreobjetos que esparca el tinte por todas las muestras. Examine los portaobjetos bajo un fotomicroscopio de fluorescencia con un filtro WB.
      ATENCIÓN: Todo el proceso debe llevarse a cabo en la oscuridad para evitar la fotodegradación del ADN.
    11. Cuantificar el daño en el ADN evaluando la longitud de la migración del ADN desde el nucleoide. En este caso, determinelo visualmente en 100 celdas seleccionadas al azar sin superposición. Clasifique el daño del ADN en cuatro clases: 0-I (sin daño), II (daño mínimo), III (daño medio) y IV (daño máximo). Exprese los datos como el número medio de células dañadas (suma de las clases II-IV) y la puntuación media del cometa para cada grupo de tratamiento. A partir de estos datos, se calculará el índice de daño genético (IDG) de cada organismo de ensayo utilizando la siguiente ecuación (8):
      GDI = (1[I] + 2[II] + 3[III] + 4[IV])/N[I-IV]) (8)
      donde I-IV representa el tipo de daño nucleoidal, y NI-NIV representa el número total de nucleoides puntuados según Pitarque et al.40.

5. Biomarcadores correlacionados

NOTA: En los últimos tiempos, los biomarcadores pueden integrarse a todos los niveles utilizando el índice de respuesta a biomarcadores (IBR) propuesto por Beliaeff y Burgeot49 y adaptado para anuros neotropicales. El IBR proporciona un valor numérico que integra todas las respuestas de los biomarcadores; valores más altos de IBR indican niveles de estrés más altos49. En términos de la estimación del IBR para una estación dada o el tratamiento de una encuesta determinada, las etapas sucesivas del procesamiento de datos para determinar la puntuación final son las siguientes:

  1. Calcule la estimación media (X) cuando se disponga de resultados individuales; De lo contrario, utilice el valor de la muestra agrupada en cada estación de muestreo.
  2. Para cada biomarcador, calcular la media general (m) y la desviación estándar (s) de X para todas las estaciones y/o encuestas, dependiendo de las comparaciones que se vayan a realizar.
  3. Estandarizar X para obtener Y. Calcule un valor llamado Y: Y = (X- m)/s.
  4. Calcule el valor Z de la siguiente manera: Z = Y o Z = −Y, en el caso de un efecto biológico que corresponda, respectivamente, a la inhibición o activación en respuesta a un factor estresante.
  5. Por último, calcule la puntuación (S), con S = Z + |Min|, donde S ≥ 0 y |Min| es el valor absoluto mínimo determinado.
  6. Trazar un diagrama de araña o estrella después de calcular el valor de S para cada biomarcador (Si) y realizar la suma para obtener el IBR.
    NOTA: consulte el documento original49 para obtener detalles de los cálculos.

Resultados

Todas las técnicas de biomarcadores presentadas aquí son métodos simples, rápidos, convenientes, sensibles, de bajo costo y precisos. Para cada biomarcador, es importante tener en cuenta lo siguiente.

Nivel individual
Índice de masa escalonado
La toma de fotografías a escala milimétrica es de gran importancia ya que este valor se utilizará para calibrar el software, y esto se traduce en una mejor objetividad con ...

Discusión

Los biomarcadores a nivel individual son muy sencillos de determinar y de muy bajo coste, ya que el examen de estos biomarcadores requiere solo unos pocos equipos que suelen estar disponibles en cualquier laboratorio de investigación. Además, estos biomarcadores proporcionan información general sobre la salud y el estado físico de los animales. El número de animales empleados en cada protocolo es crítico para obtener resultados fiables. Debido a la variabilidad de los datos, es nec...

Divulgaciones

Los autores declaran no tener intereses contrapuestos.

Agradecimientos

Los autores agradecen al Instituto de Química de San Luis "Dr. Roberto Olsina"- Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Tecnológicas (INQUISAL-CONICET), Universidad Nacional de San Luis (Proyecto PROICO 2-1914), Laboratório de Patologia Experimental (LAPEx) - Instituto de Biociências (INBIO) - Universidade Federal de Mato Grosso do Sul (UFMS), Cátedra de Citología - Universidad Nacional de La Plata (UNLP) y Agencia Nacional de Promoción Científica (FONCYT; PICT-2018-02570 y PICT-2018-01067) para apoyo financiero. También queremos agradecer a la hablante nativa Lidia Unger y al GAECI-UNSL (Centro de Asistencia para la Redacción Científica) de la Universidad Nacional de San Luis por la revisión del manuscrito.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Analytical scale
Electrophoresis power supply Enduro E0203-250V 
Eosin Merck
Fluorescence photomicroscope Olympus BX50Equipped with an appropriate filter combination
Hematoxylin of HarrisMerck
High resolution photo camera  >16 megapixels
Homogenizer
Horizontal electrophoresis chamber Sigma
MicrocentrifugeDenver Instrument
MicroscopeLeicaDM4000 BEquipped with image capture system Leica DFC 280
MicrotomeLeica2265
ParaplastSigmaP3558
Personal Computer Eqquiped with Mac OS X, Lynux or Windows
Refrigerated centrifuge
UV–Vis spectrophotometerRayleigh723GWith UV-lamp

Referencias

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