عزل وثقافة البلاعم المشتقة من نخاع العظام من الفئران

Summary

يصف هذا البروتوكول عزل وثقافة البلاعم المشتقة من نخاع العظم من الفئران.

Abstract

للبلاعم الكبيرة وظائف مستجيبة مهمة في الاتزان الداخلي والالتهاب. هذه الخلايا موجودة في كل نسيج في الجسم ولديها القدرة الهامة على تغيير ملفها الشخصي وفقا للمنبهات الموجودة في البيئة المكروية. يمكن أن تؤثر السيتوكينات بشكل عميق على فسيولوجيا البلاعم ، وخاصة IFN-γ و interleukin 4 ، مما يولد أنواع M1 و M2 على التوالي. بسبب تعدد استخدامات هذه الخلايا ، يمكن أن يكون إنتاج مجموعة من الضامة المشتقة من نخاع العظم خطوة أساسية في العديد من النماذج التجريبية لبيولوجيا الخلية. الهدف من هذا البروتوكول هو مساعدة الباحثين في عزل وثقافة البلاعم المشتقة من أسلاف نخاع العظام. يتم تحويل أسلاف نخاع العظم من الفئران C57BL / 6 الخالية من مسببات الأمراض إلى بلاعم عند التعرض لعامل تحفيز مستعمرة البلاعم (M-CSF) الذي يتم الحصول عليه في هذا البروتوكول من طاف سلالة الخلايا الليفية للفأرة L-929. بعد الحضانة ، تتوفر البلاعم الناضجة للاستخدام^{من اليوم 7 إلى اليوم} 10. يمكن أن يكون واحد مصدرا لما يقرب من 2 × 10⁷ البلاعم. لذلك ، فهو بروتوكول مثالي للحصول على كميات كبيرة من البلاعم الأولية باستخدام الطرق الأساسية لزراعة الخلايا.

Introduction

الخلايا الوحيدة والبلاعم هي خلايا بلعمية أحادية النواة يمكن اشتقاقها من السلف الموجود في نخاع العظم. أفادت الدراسات الحديثة أن البلاعم تنشأ أيضا من أسلاف الكريات الحمر النخاعية^{المشتقة من} كيس الصفار 1. بغض النظر عن اشتقاقها ، فإن كريات الدم البيضاء هذه لها وظائف مستجيبة مهمة في التوازن والالتهاب ^2,3. الخلايا الوحيدة هي خلايا من الدم المحيطي يمكن أن تتمايز بشكل أكبر إلى بلاعم في الأنسجة ^2,4 ، في حين أن البلاعم هي خلايا غير متجانسة تظهر أنماطا ظاهرية ووظائف ينظمها التعرض المحلي لعوامل النمو والسيتوكينات⁵. نظرا لأن البلاعم تظهر مثل هذا التنوع الوظيفي ، فقد تمت دراستها في العديد من نماذج الأمراض. وهكذا ، أصبحت ثقافة البلاعم في المختبر أداة مهمة لفهم فسيولوجيتها ودورها في الأمراض المختلفة. يعد نخاع العظم مصدرا مهما للخلايا السلفية ، بما في ذلك أسلاف البلاعم ، والتي يمكن عزلها ومضاعفتها ، مما يزيد بشكل كبير من عدد البلاعم التي تم الحصول عليها. بالإضافة إلى ذلك ، تعتبر البلاعم المشتقة من نخاع العظم مهمة بشكل خاص لتجنب التأثيرات الناتجة عن البيئة المكروية للأنسجة ، لأن البلاعم تغير نمطها الظاهري استجابة للمنبهات المختلفة في الأنسجة ^6,7. تتحول أسلاف نخاع العظم إلى بلاعم عند التعرض لعامل تحفيز مستعمرة البلاعم (M-CSF)⁸. لا يمكن تمييز البلاعم المشتقة من نخاع العظم عن الضامة المشتقة من الخلايا الوحيدة بواسطة علامات كيميائية حيوية في الأنسجة. تمثل هذه الخلايا مجموعة متجانسة للغاية من الخلايا الأولية ، والتي يمكن مقارنتها في كثير من النواحي الأخرى بالبلاعم البريتونية ^6,9.

بسبب مجموعة الوظائف الخلوية غير المتجانسة ، تمت دراسة البلاعم بدقة من قبل الباحثين. يمكن استخدام هذه الخلايا في نماذج تجريبية مختلفة ، بما في ذلك الأمراض المعدية والالتهابية ، لأنها تظهر في هذه العمليات ^10,11. يمكن أن تكون مفيدة أيضا للتحقيق في استقطاب البلاعم استجابة لمختلف المحفزات البيئية الدقيقة^12,13. وبالتالي ، يتم توفير بروتوكول بسيط وموثوق هنا لغرض الحصول على أعداد كبيرة من الضامة الأولية من نخاع عظم الفأر.

Protocol

تم تنفيذ هذا البروتوكول وفقا للمجلس الوطني لمراقبة التجارب على (Concea) وبموافقة لجنة أخلاقيات واستخدام (CEUA). تم شراء الفئران C57BL / 6 من Biotério Central من جامعة ميناس جيرايس الفيدرالية (UFMG) ، بيلو هوريزونتي ، البرازيل. يجب استخدام معدات الحماية الشخصية (PPE) مثل معاطف المختبر والقفازات وحماية العين في جميع الخطوات الموضحة في هذا البروتوكول.

1. إعداد الخلايا الليفية L-929 السلالة طافية كمصدر ل M-CSF

1. تذويب خلايا سلالة الخلايا الليفية L-929 (خط الخلايا المعتمد من مجموعة الثقافة الأمريكية - ATCC CCL1) وابدأ عملية الاستزراع على الفور للحفاظ على الجدوى.
2. في خزانة السلامة الحيوية ذات التدفق الصفحي ، باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر ، قم بنقل خلايا سلالة الخلايا الليفية L-929 من القارورة إلى أنبوب طرد مركزي معقم سعة 50 مل.
3. استخدم ماصة مصلية لإضافة 50 مل من محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS) ، خال من الكالسيوم والمغنيسيوم.
4. أجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق. تخلص من المادة الطافية.
5. أعد تعليق الحبيبات في 20 مل من متوسط النسر المعدل F12 من Dulbecco المكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ (FBS) و 1 مل من البنسلين / الستربتومايسين (P / S) (DMEM / F12-10) باستخدام ماصة مصلية.
6. انقل الخلايا المعاد تعليقها إلى دورق زراعة الخلايا T75.
7. احتضان في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO₂ حتى التقاء كامل.
   ملاحظة: أثناء معالجة القارورة ، احرص على تجنب ترطيب الغطاء بالمحلول ، حيث يمكن أن يكون ذلك مصدرا للتلوث. للحصول على كمية مناسبة من المادة الطافية ، من الضروري تكرار الخلايا بعد أن تغطي السطح الكامل لقارورة زراعة الخلايا. يتم تثبيط خلايا L-929 عن طريق الاتصال. محلول دافئ من التربسين / حمض الإيثيلين ديامينيترايتيك (EDTA) ، DMEM / F12-10 ، و PBS معقم إلى 37 درجة مئوية لبدء توسيع زراعة الخلايا ، كما هو موضح في الخطوات التالية.
8. بمجرد الوصول إلى الالتقاء الكامل ، تخلص من المادة الطافية من دورق زراعة الخلايا ، داخل خزانة السلامة الحيوية للتدفق الصفحي.
9. اغسل قارورة زراعة الخلايا ب 20 مل من برنامج تلفزيوني معقم باستخدام ماصة مصلية وتجاهل المحلول.
10. أضف 10 مل من التربسين / EDTA (محلول 0.05٪) إلى دورق زراعة الخلايا الذي يحتوي على الخلايا الملتصقة.
11. نقل قارورة زراعة الخلايا من التدفق الصفحي إلى حاضنة CO₂ 37 درجة مئوية ، 5٪ واحتضانها لمدة 3 دقائق.
12. هز دورق زراعة الخلايا لفصل الخلايا عن سطح دورق المزرعة واستخدم مجهرا للتأكد من أن جميع الخلايا قد تم فصلها.
13. قم بتعطيل التربسين / EDTA (محلول 0.05٪) مع 10 مل من وسط DMEM / F12-10.
14. انقل المحلول باستخدام ماصة مصلية إلى أنبوب طرد مركزي معقم سعة 50 مل.
15. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق. تخلص من المادة الطافية.
16. أعد تعليق الحبيبات في 10 مل من وسط DMEM / F12-10.
17. أضف 1 مل من معلق الخلية إلى دورق زراعة الخلايا T175 (1:10 مزرعة).
18. كرر الإجراء للحصول على عشر قوارير زراعة الخلايا T175.
19. أضف 50 مل من DMEM / F12-10 إلى كل قارورة زراعة خلية.
20. احتضان في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO₂ حتى التقاء كامل.
    ملاحظة: تضمن هذه الخطوات 500 مل من طافي الخلية L-929. في اليوم 5 ، بعد أن تغطي الخلايا سطح قارورة زراعة الخلايا T175 ، سيتم إثراء المادة الطافية ل M-CSF ويجب جمعها¹⁴.
21. قم بإزالة قارورة ثقافة الخلية من الحاضنة في اليوم 5 بعد تثبيط الاتصال.
22. نقل الوسط إلى أنبوب طرد مركزي معقم سعة 50 مل.
23. أجهزة الطرد المركزي عند 3200 × جم ، عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
24. اجمع المادة الطافية المخصبة ب M-CSF وانقل المحلول إلى أنبوب طرد مركزي معقم سعة 50 مل. يحفظ في الثلاجة على حرارة -20 درجة مئوية.
    ملاحظة: الطرد المركزي مهم للغاية لإزالة الخلايا والحطام من المواد الطافية.
25. L-929 الطافي هو مصدر مناسب وغير مكلف لعامل تحفيز مستعمرة البلاعم (M-CSF) ويحتوي عادة على 5 إلى 10 نانوغرام / مل من M-CSF⁸. تحتوي هذه المواد الطافية أيضا على كميات ضئيلة من السيتوكينات وعوامل النمو الأخرى ، لكنها لا تمارس تأثيرا عميقا على فسيولوجيا البلاعم¹⁵. ومع ذلك ، يمكن شراء M-CSF المنقى واستخدامه كبديل لطاف L-929 بتركيزات من 1 إلى 2 نانوغرام / مل⁸.

2. إزالة عظم الفخذ والساق

1. المضي قدما في القتل الرحيم لذكور الفئران من النوع البري C57BL-6 البالغ من العمر 8 أسابيع عن طريق خلع عنق الرحم بعد اختناق ثاني أكسيد الكربون ، وفقا للقرار المعياري رقم 18 للمجلس الوطني للتجارب على (Concea) وبموافقة لجنة أخلاقيات واستخدام (CEUA).
2. نقع الماوس مع محلول الإيثانول 70 ٪ واستخدام مقص معقم لعمل شق 1 سم على طول البطن.
3. قم بإزالة الجلد حتى تتعرض عضلة الساقين الخلفيتين بالكامل.
4. إزالة الساقين الخلفيتين على ارتفاع الورك ، مع الحرص على عدم كسر عظم الفخذ والساق.
5. ضع الأرجل الخلفية في أنبوب طرد مركزي مخروطي الشكل بمحلول إيثانول 70٪.
   ملاحظة: استخدم دائما الفئران الخالية من مسببات الأمراض. تأكد من جمع كلا الساقين لتحقيق عدد أكبر من الخلايا. يتم تنفيذ الخطوة 2 في بيئة غير معقمة (منضدة). وبالتالي ، من المهم إزالة عظم الفخذ والساق بعناية حتى تظل سليمة لتجنب التلوث البكتيري. يتم تنفيذ الخطوات المتبقية من هذا الإجراء في خزانة السلامة الحيوية ذات التدفق الصفحي. يجب أن يقتصر وقت تعرض الساقين لمحلول الإيثانول بنسبة 70٪ على 10 دقائق. إذا كان الوقت أطول ، يمكن أن تتأثر أسلاف نخاع العظم.

3. الحصول على أسلاف نخاع العظم من تجويف الساق وعظم الفخذ

1. قم بإزالة الأرجل من محلول الإيثانول بنسبة 70٪ ونقلها إلى برنامج تلفزيوني معقم.
2. استخدام ملقط ومناديل مطهرة لإزالة جميع العضلات واللفافة. يجب أن تكون العظام نظيفة بعد هذه الخطوة.
3. استخدم شفرة مشرط جراحية معقمة لقطع المشاش العظمي على كلا الطرفين لكشف نخاع العظم.
4. املأ حقنة سعة 20 مل ب 10 مل من برنامج تلفزيوني معقم مكمل بمحلول 2٪ بنسلين / ستربتومايسين وقم بتوصيل إبرة 26 جرام.
5. امسك العظم باستخدام ملقط تشريح تشريحي بيد واحدة ، واستخدم الأخرى لإدخال الإبرة في تجويف العظام. احرص على عدم سحق العظم بالملقط.
6. اغسل الجزء الداخلي من العظم باستخدام برنامج تلفزيوني واجمع نخاع العظم في أنبوب طرد مركزي مخروطي معقم. بعد هذه الخطوة ، يجب أن يظهر تجويف العظام أبيض.
7. أجهزة الطرد المركزي الخلايا المجمعة لمدة 10 دقائق عند 300 × جم عند 4 درجات مئوية.
8. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من DMEM / F12-10.
9. تجانس وإضافة 9 مل أخرى من وسط DMEM / F12-10 ليصل إجمالي الخلايا إلى 10 مل.

4. ثقافة البلاعم

1. أضف 1 مل من أسلاف الخلايا إلى كل من أطباق بتري البلاستيكية المستديرة مقاس 100 مم × 20 مم (إجمالي 10 أطباق) ، وانشر الخلايا عبر الأطباق باستخدام ماصة للحصول على توزيع موحد. لا تستخدم الأطباق المعالجة بزراعة الأنسجة.
2. أضف 9 مل من DMEM / F12-10 مع 20٪ من طافية الخلية L-929 إلى كل طبق.
3. احتضان في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ CO₂ .
4. في^{اليوم الثالث} ، أضف 10 مل من وسط DMEM / F12-10 المكمل ب 20٪ من الخلايا الطافية L-929 إلى كل طبق. وبهذه الطريقة ، تحتوي أطباق الاستزراع الآن على ما مجموعه 20 مل من وسط الثقافة ، وهو ما يكفي لنمو الخلايا حتى نهاية نضجها.
   ملاحظات: يجب عدم استخدام الأطباق المعالجة بزراعة الأنسجة لأن البلاعم ، كخلايا ملتصقة طبيعية تتميز بتفاعلات قوية مع الأسطح ، لن تنفصل بسهولة عن الطبق لاحقا. عادة ، يمكن زرع أسلاف الخلايا من فأر واحد (عظم الفخذ) في 10 أطباق ثقافة. ستتحول أسلاف الخلايا إلى بلاعم ، والتي يمكن استخدامها من يوم الحضانة 7 إلى 10. يتم تحديد تأكيد النضج من خلال التغييرات في مورفولوجيا البلاعم. الضامة الناضجة ملتصقة وتظهر مورفولوجيا غير متجانسة ، موضحة بانبعاث الأقدام الكاذبة في اتجاهات مختلفة. وتوضح النتائج التمثيلية أمثلة على هذه الخلايا الناضجة.

5. حصاد البلاعم

1. تخلص من المواد الطافية من جميع أطباق الثقافة.
2. اغسل كل طبق مزرعة ب 10 مل من برنامج Mg²⁺ المعقم الدافئ (37 درجة مئوية) و Ca²⁺ مجانا.
3. تجاهل الحل من كل طبق.
4. قم بتسخين محلول تفكك الخلايا غير الأنزيمية مسبقا إلى 37 درجة مئوية وأضف 3 مل إلى كل طبق. احتضان لمدة 10 دقائق في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO₂ . استخدم مجهرا مقلوبا لتصور ما إذا كانت البلاعم تنفصل عن أطباق الاستزراع.
   ملاحظة: يجب أن يسمح استخدام الألواح البلاستيكية غير المعالجة بزراعة الأنسجة بتفكك الخلايا بسهولة وتجنب الحاجة إلى كشط الخلايا من اللوحة.
5. اغسل الأطباق باستخدام ماصة مصلية بمحلول تفكك الخلايا غير الأنزيمية مرارا وتكرارا ، وقم بحركات دائرية لتأكيد فصل جميع البلاعم عن الطبق.
6. اجمع محلول جميع أطباق الاستزراع معا في أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 50 مل.
7. أضف 10 مل من برنامج تلفزيوني معقم تم تسخينه مسبقا إلى أطباق الاستزراع الفارغة وتابع كما في الخطوة 5.4. هذا الإجراء هو تكرار للخطوة 5.4 ويهدف إلى ضمان جمع جميع البلاعم.
8. أجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
9. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات ب 1 مل من DMEM / F12-10. تجانس ببطء وبعناية صعودا وهبوطا باستخدام ماصة لتجنب إتلاف الخلايا.
10. تحضير حصصة من 10 ميكرولتر من محلول البلاعم المخفف مع 10 ميكرولتر من تريبان بلو لحساب الخلايا باستخدام مقياس الدم.
    ملاحظة: في اليوم السابع ، سينتج كل طبق ما يقرب من 2 × 10⁶ بلاعم. هذا يعني أن فأرا واحدا يمكن أن ينتج ما يقرب من 2 × 10⁷ بلاعم أولية عند حصاده في عشر أطباق. نظرا لأن M-CSF يدفع فقط نضوج الضامة ، فإن الإجراء يضمن مجموعة من الخلايا التي هي في الأساس مجرد بلاعم وخالية من كريات الدم البيضاء الملوثة^{الأخرى 16}.

النتائج

الضامة هي خلايا كبيرة وملتصقة ذات خصائص فسيولوجية خاصة. إنها تظهر مجموعة متنوعة من العروض المورفولوجية في الثقافة بسبب القدرة على الالتصاق بالزجاج والبلاستيك ، ويرتبط مورفولوجيا انتشارها النموذجية بانبعاث امتدادات السيتوبلازم (الشكل 1). بمجرد تعرض أسلاف نخاع العظم ل M-CSF ?...

Discussion

يعد إنتاج مجموعة من البلاعم المشتقة من نخاع العظم خطوة أساسية في العديد من النماذج التجريبية لبيولوجيا الخلية ، خاصة عندما يكون من المهم تحقيق مجموعة متجانسة من الخلايا الأولية. كما ذكرنا ، يمكن أن تتحول أسلاف الخلايا إلى بلاعم فقط في وجود M-CSF. يمكن استخدام طافات الخلايا L-929 كمصدر رئيسي ل M-...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
20-cc syringe	DESCARPACK	SI100S4G	Sterile syringe
26-G needles	BD	497AQDKT7	Sterile needles
50-ml conical centrifuge tube	SARSTEDT	62547254	Plastic conical tubes suitable for centrifugation
70% ethanol solution	EMFAL	490	Ethanol solution for esterilization
Anatomical dissection forceps	3B SCIENTIFIC	W1670	Maintain in sterile beaker containing 70% ethanol solution
C57Bl/6 wild type mouse	Purchased from Biotério Central at Federal University of Minas Gerais	Not applicable	Mice must be specific-pathogen-free, age between 6 and 10 weeks. Mice need be accommodated at least one week earlier for recovering from the stress of transportation
Cell culture flask T175	GREINER	C7481-50EA	T-175 flask, canted neck, surface area 75 cm2, with filter cap, DNase free, RNase free
Cell culture flask T75	GREINER	C7231-120EA	T-75 flask, canted neck, surface area 75 cm2, with filter cap, DNase free, RNase free
Disinfecting or baby Wipes?	CLOROX	Not applicable	It helps cleaning the bone
Distilled Water	GIBCO	15230	Sterile distilled water
DMEM/F12-10	Not applicable	Not applicable	Add 10 mL of Fetal Bovine Serum (FBS) and 1 mL of Penicillin/ Streptomycin (P/S) to DMEM/F12 (q.s.p. 100 mL)
DMEM/F12-10 + supernatant of L-929 cells	Not applicable	Not applicable	Add 20% of supernatant of L929 cells culture on DMEM/F-12-10
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium - F12 (DMEM/F12)	GIBCO	12500096	DMEM: F-12 Medium contains 2.5 mM L-glutamine, 15 mM HEPES, 0.5 mM sodium pyruvate, and 1200 mg/L sodium bicarbonate.Resuspend powder to 1 liter of distilled water and add 3,7 g of sodium bicarbonate. Adjust pH to 7,2 and filter with 0,22 µM. Storage at 2 - 8 °C freezer
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, United States (FBS)	GIBCO	10082147	Enrichment for DMEM-F12
Hemocytometer	SIGMA-ALDRICH	Z359629	Used to count macrophages at microscopy
L-929 cells	SIGMA-ALDRICH	ATCC # CCL-1	L-929 is a lineage of mouse fibroblast cells used as a source of macrophage colony stimulating factor (M-CSF)
Nikon TI eclipse	NIKON	Not applicable	Nikon TI Eclipse is a fluorescence and phase contrast microscope
Non-enzymatic cell dissociation solution	CELLSTRIPER (CORNING)	25-056-CI	Non-enzimatic cell dissociation solution remove macrophages from the plate without damaging them
Non-treated round culture dishes 100 × 20–mm	CORNING	CLS430591	Do not use tissue culture treated petri dishes or any tissue culture treated plate
P3199 Penicillin G Potassium Salt	USBIOLOGICAL	113-98-4	Antibiotics
Penicillin and streptomycin (P/S) solution			Use 0,26 grams of penicillin and 0,40 grams of streptomycin. Mix with 40 mL of sterile PBS. Inside a horizontal laminar flow cabinet, use a 0,22 µM filter and store aliquots of 1.0 mL in 1.5 ml microfuge tubes in the freezer (-20°C)
Phosphate Buffered Saline free from Calcium and Magnesium (PBS)	MEDIATECH	21-040-CM	Sterile
S7975 Streptomycin Sulfate, 650-850U/mg	USBIOLOGICAL	3810-74-0	Antibiotics
Serological pipettes of 10mL or 25 mL	SARSTEDT	861254001	Serological pipettes is used volumes higher than 1 mL
Sodium Bicarbonate	SIGMA-ALDRICH	144-55-8	pH correction for DMEM-F12
Software Nis Elements Viewer	NIKON	Not applicable	NIS-Elements Viewer is a free standalone program to view image files and datasets
Sterile PBS and 2% of P/S solution	LABORCRIN	590338	Add 1 mL of P/S in 40 mL of sterile PBS
Straight iris scissors	KATENA	Not applicable	Maintain in sterile beaker containing 70% ethanol solution
Supernatant of L-929 cells	Not applicable	Not applicable	L-929 is a lineage of mouse fibroblast cells used as a source of macrophage colony stimulating factor (M-CSF). L-929 supernatant was obtain from the protocol
Surgical Scalpel Blade No.24 Stainless Steel	SWANN-MORTON	311	Used for exposing epiphysis from bones
Trypan Blue Solution, 0.4%	GIBCO	15250061	Trypan Blue Solution, 0.4%, is routinely used as a cell stain to assess cell viability using the dye exclusion test
Trypsin/EDTA solution 0,05%	GIBCO	25300-062	Used to dissociate cells from culture bottle
Water for Injection (WFI) for Cell Culture	GIBCO	A12873	Sterile and endotoxin-free water