从小鼠中分离和培养骨髓来源的巨噬细胞

摘要

本方案描述了从小鼠中分离和培养骨髓来源的巨噬细胞。

摘要

巨噬细胞在体内平衡和炎症中具有重要的效应功能。这些细胞存在于身体的每个组织中，并且具有根据微环境中存在的刺激改变其轮廓的重要能力。细胞因子能深刻影响巨噬细胞生理学，尤其是IFN-γ和白细胞介素4，分别产生M1型和M2型。由于这些细胞的多功能性，骨髓来源的巨噬细胞群的产生可能是许多细胞生物学实验模型的基本步骤。该协议的目的是帮助研究人员分离和培养源自骨髓祖细胞的巨噬细胞。来自无病原体C57BL / 6小鼠的骨髓祖细胞在暴露于巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）时被转化为巨噬细胞，在该方案中，巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）是从小鼠成纤维细胞谱系L-929的上清液中获得的。孵育后，成熟的巨噬细胞可在第7^天 至第10^天使用 。一只动物可以是大约 2 x 10⁷ 个巨噬细胞的来源。因此，它是使用细胞培养的基本方法获得大量原代巨噬细胞的理想方案。

引言

单核细胞和巨噬细胞是单核吞噬细胞，可以来源于骨髓中的祖细胞。最近的研究报告称，巨噬细胞也起源于卵黄囊衍生的红髓祖细胞¹。无论它们的衍生性如何，这些白细胞在体内平衡和炎症中具有重要的效应功能 ^2,3。单核细胞是来自外周血的细胞，可以在组织中进一步分化为巨噬细胞 ^2,4，^而巨噬细胞是异质细胞，表现出受生长因子和细胞因子局部暴露调节的表型和功能⁵。由于巨噬细胞表现出这种功能多样性，因此它们已在许多疾病模型中进行了研究。因此，巨噬细胞的体外培养已成为了解其生理学及其在不同疾病中的作用的重要工具。骨髓是祖细胞（包括巨噬细胞祖细胞）的重要来源，巨噬细胞祖细胞可以被分离和繁殖，使获得的巨噬细胞数量呈指数级增加。此外，骨髓来源的巨噬细胞对于避免组织微环境产生的影响尤为重要，因为巨噬细胞会响应组织中的不同刺激而改变其表型 ^6,7。骨髓祖细胞在暴露于巨噬细胞集落刺激因子 （M-CSF） 后转化为巨噬细胞⁸。骨髓来源的巨噬细胞不能通过组织中的生化标志物与单核细胞来源的巨噬细胞区分开来。这些细胞代表了高度均匀的原代细胞群，在许多其他方面可与腹膜巨噬细胞相媲美 ^6,9。

由于巨噬细胞的细胞功能具有不同性，研究人员长期以来一直对巨噬细胞进行深入研究。这些细胞可用于不同的实验模型，包括感染性和炎症性疾病，因为它们在这些过程中具有特性^10,11。它们还可用于研究巨噬细胞对各种微环境刺激的极化反应^12,13。因此，这里提供了一种简单可靠的方案，用于从小鼠骨髓中获得大量的初级巨噬细胞。

研究方案

该协议是根据国家动物实验控制委员会（Concea）并经动物伦理与使用委员会（CEUA）批准执行的。C57BL / 6小鼠购自巴西贝洛奥里藏特米纳斯吉拉斯联邦大学（UFMG）的Biotério Central。在本协议中描述的所有步骤都应使用个人防护设备 （PPE），例如实验室外套、手套和护目镜。

1. 成纤维细胞L-929谱系上清液作为M-CSF来源的制备

1. 解冻 L-929 成纤维细胞谱系细胞（美国型培养保藏认证细胞系-ATCC CCL1）并立即开始培养过程以保持活力。
2. 在层流生物安全柜中，使用 1,000 μL 移液管，将 L-929 成纤维细胞谱系细胞从小瓶转移到 50 mL 无菌离心管中。
3. 使用血清移液管加入 50 mL 不含钙和镁的无菌磷酸盐缓冲盐水 （PBS）。
4. 以300× g，4°C离心10分钟。丢弃上清液。
5. 使用血清学移液管将沉淀重悬于 20 mL 补充有 10% 胎牛血清 （FBS） 和 1 mL 青霉素/链霉素 （P/S） （DMEM/F12-10） 的 Dulbecco′s 改良的 Eagle 培养基 F12 中。
6. 将重悬的细胞转移到 T75 细胞培养瓶中。
7. 在37°C，5%CO₂ 培养箱中孵育直至完全汇合。
   注意: 操作烧瓶时，请小心避免用溶液弄湿盖子，因为这可能是污染源。为了获得方便量的上清液，有必要在细胞覆盖细胞培养瓶的整个表面后复制细胞。L-929细胞通过接触被抑制。将热胰蛋白酶/乙二胺四乙酸（EDTA）溶液，DMEM / F12-10和无菌PBS至37°C，开始细胞培养扩增，如以下步骤所述。
8. 一旦达到完全汇合，就从细胞培养瓶中丢弃上清液，在层流生物安全柜内。
9. 使用血清移液管用 20 mL 无菌 PBS 洗涤细胞培养瓶，并弃去溶液。
10. 将 10 mL 胰蛋白酶/EDTA（0.05% 溶液）加入含有粘附细胞的细胞培养瓶中。
11. 将细胞培养瓶从层流转移到 37°C、5% CO₂ 培养箱中，孵育 3 分钟。
12. 摇晃细胞培养瓶，使细胞从培养瓶表面解离，并使用显微镜确保所有细胞都已解离。
13. 用 10 mL DMEM/F12-10 培养基灭活胰蛋白酶/EDTA（0.05% 溶液）。
14. 使用血清移液管将溶液转移到 50 mL 无菌离心管中。
15. 在4°C下以300× g 离心10分钟。丢弃上清液。
16. 将沉淀重悬于 10 mL DMEM/F12-10 培养基中。
17. 将 1 mL 细胞悬液加入 T175 细胞培养瓶（1:10 培养物）中。
18. 重复该过程以获得 10 个 T175 细胞培养瓶。
19. 向每个细胞培养瓶中加入 50 mL DMEM/F12-10。
20. 在37°C，5%CO₂ 培养箱中孵育直至完全汇合。
    注:这些步骤保证 500 mL L-929 细胞上清液。在第 5 天，在细胞覆盖 T175 细胞培养瓶表面后，将富集上清液以进行 M-CSF，并且必须收集¹⁴。
21. 在接触抑制后第 5 天从培养箱中取出细胞培养瓶。
22. 将培养基转移到 50 mL 无菌离心管中。
23. 在4°C下以3,200× g离心10分钟。
24. 收集富含 M-CSF 的上清液，并将溶液转移到 50 mL 无菌离心管中。储存在-20°C的冰箱中。
    注意:离心对于从上清液中去除细胞和碎片极为重要。
25. L-929 上清液是一种方便且廉价的巨噬细胞集落刺激因子 （M-CSF） 来源，通常含有 5 至 10 ng/mL 的 M-CSF⁸。这些上清液还含有微量的其他细胞因子和生长因子，但它们不会对巨噬细胞生理学产生深远影响¹⁵。然而，纯化的 M-CSF 可以购买并用作浓度为 1 至 2 ng/mL 的 L-929 上清液的替代品⁸。

2. 切除股骨和胫骨

1. 根据国家动物实验委员会 （Concea） 第 18 号规范性决议和动物伦理与使用委员会 （CEUA） 的批准，在二氧化碳窒息后通过颈椎脱位对 8 周龄的 C57BL-6 野生型雄性小鼠实施安乐死。
2. 用70%乙醇溶液浸泡小鼠，并使用无菌剪刀沿腹部切开1厘米的切口。
3. 去除皮肤，直到后腿的肌肉完全暴露出来。
4. 在臀部高度移除后腿，注意不要折断股骨和胫骨。
5. 将后腿放入装有70%乙醇溶液的锥形离心管中。
   注意:始终使用无病原体的小鼠。确保收集两条腿以获得更多的细胞数量。步骤2在非无菌环境（台式）中进行。因此，重要的是要小心地切除股骨和胫骨，使它们保持完整，以避免细菌污染。该过程的其余部分在层流生物安全柜中进行。腿暴露于70%乙醇溶液的时间应限制在10分钟以内。如果时间较长，骨髓祖细胞可能会受到影响。

3.从胫骨和股骨的管腔中获取骨髓祖细胞

1. 从70%乙醇溶液中取出腿，并将它们转移到无菌PBS中。
2. 使用镊子和消毒湿巾去除所有肌肉和筋膜。在此步骤之后，骨头应该是干净的。
3. 使用无菌手术刀刀片切开两端的骨骺，露出骨髓。
4. 用 10 mL 无菌 PBS 填充 20 mL 注射器，补充有 2% 青霉素/链霉素溶液，并连接 26 G 针头。
5. 用一只手使用解剖钳握住骨头，另一只手将针头插入骨腔。注意不要用镊子压碎骨头。
6. 用PBS洗掉骨头内部，并将骨髓收集在无菌锥形离心管中。完成此步骤后，骨腔应呈白色。
7. 将收集的细胞在4°C下以300× g 离心10分钟。
8. 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 1 mL DMEM/F12-10 中。
9. 匀浆并加入另外 9 mL DMEM/F12-10 培养基，使细胞总数达到 10 mL。

4.巨噬细胞培养

1. 向每个 100 mm x 20 mm 圆形塑料培养皿（总共 10 个培养皿）中加入 1 mL 细胞祖细胞，用移液管将细胞分布在板上以获得均匀分布。不要使用经过组织培养处理的培养皿。
2. 向每个培养皿中加入 9 mL 补充有 20% L-929 细胞上清液的 DMEM/F12-10。
3. 在37°C，5%CO₂ 培养箱中孵育。
4. ^在第 3 天，向每个培养皿中加入 10 mL 补充有 20% L-929 细胞上清液的 DMEM/F12-10 培养基。这样，培养皿现在总共有 20 mL 的培养基，足以满足细胞的生长直到其成熟结束。
   注意:不得使用组织培养处理过的培养皿，因为巨噬细胞作为天然贴壁细胞，其特点是与表面的强烈相互作用，以后不容易从培养皿中解离。通常，可以将一只小鼠（两个股骨）的细胞祖细胞接种在10个培养皿中。细胞祖细胞将转化为巨噬细胞，巨噬细胞可在孵育第 7 至 10 天使用。成熟确认是通过巨噬细胞形态的变化来识别的。成熟的巨噬细胞是粘附的，并表现出异质的形态，这可以通过向不同方向发射伪足来解释。这些成熟细胞的示例显示在代表性结果中。

5. 收获巨噬细胞

1. 从所有培养皿中丢弃上清液。
2. 用10mL温热（37°C）无菌Mg²⁺ 和^Ca2+ 游离PBS洗涤每个培养皿。
3. 丢弃每个培养皿中的溶液。
4. 将非酶促细胞解离溶液预热至37°C，并向每个培养皿中加入3mL。在37°C，5%CO₂ 培养箱中孵育10分钟。使用倒置显微镜观察巨噬细胞是否从培养皿中解离。
   注意:使用未经组织培养处理的塑料板应允许细胞轻松解离，并避免需要将细胞从板上刮下。
5. 使用带有非酶细胞解离溶液的血清移液管一遍又一遍地清洗培养皿，进行圆周运动以确认所有巨噬细胞都已从培养皿中解离。
6. 将所有培养皿的溶液一起收集到锥形 50 mL 离心管中。
7. 将 10 mL 无菌预热的 PBS 添加到空培养皿中，并按照步骤 5.4 进行。该过程是步骤 5.4 的重复，旨在保证收集所有巨噬细胞。
8. 以300× g，4°C离心10分钟。
9. 弃去上清液，用 1 mL DMEM/F12-10 重悬沉淀。使用移液器缓慢而小心地上下均质化，以避免损坏细胞。
10. 制备用 10 μL 台盼蓝稀释的 10 μL 巨噬细胞溶液的等分试样，以使用血细胞计数器对细胞进行计数。
    注意:在第 7 天，每个培养皿将产生大约 2 x 10⁶ 个巨噬细胞。这意味着当在10个平板中收获时，一只小鼠可以产生大约2 x 10⁷ 个原代巨噬细胞。由于 M-CSF 仅驱动巨噬细胞的成熟，因此该程序保证了基本上只是巨噬细胞的细胞群，并且没有其他污染的白细胞¹⁶。

结果

巨噬细胞是具有特殊生理特性的大而贴壁的细胞。由于能够粘附在玻璃和塑料上，它们在培养物中表现出多种形态学表现，并且它们典型的扩散形态与细胞质延伸的发射有关（图1）。一旦骨髓祖细胞暴露于 L-929 细胞上清液的 M-CSF 并开始转化为成熟的巨噬细胞，它们就会粘附在培养皿板上。

图2 显示了骨髓祖细胞向成熟巨噬细胞转...

讨论

在许多细胞生物学实验模型中，产生骨髓来源的巨噬细胞群体是基本步骤，尤其是当实现原代细胞的均一群体很重要时。如前所述，细胞祖细胞只有在M-CSF存在下才能转化为巨噬细胞。L-929细胞上清液可作为M-CSF的主要来源。除了成本之外，使用重组 M-CSF 本身没有问题 ^8,17。有证据表明，重组 M-CSF 巨噬细胞在培养物中表现出更好的均匀性;然而，使用 r-M-C...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
20-cc syringe	DESCARPACK	SI100S4G	Sterile syringe
26-G needles	BD	497AQDKT7	Sterile needles
50-ml conical centrifuge tube	SARSTEDT	62547254	Plastic conical tubes suitable for centrifugation
70% ethanol solution	EMFAL	490	Ethanol solution for esterilization
Anatomical dissection forceps	3B SCIENTIFIC	W1670	Maintain in sterile beaker containing 70% ethanol solution
C57Bl/6 wild type mouse	Purchased from Biotério Central at Federal University of Minas Gerais	Not applicable	Mice must be specific-pathogen-free, age between 6 and 10 weeks. Mice need be accommodated at least one week earlier for recovering from the stress of transportation
Cell culture flask T175	GREINER	C7481-50EA	T-175 flask, canted neck, surface area 75 cm2, with filter cap, DNase free, RNase free
Cell culture flask T75	GREINER	C7231-120EA	T-75 flask, canted neck, surface area 75 cm2, with filter cap, DNase free, RNase free
Disinfecting or baby Wipes?	CLOROX	Not applicable	It helps cleaning the bone
Distilled Water	GIBCO	15230	Sterile distilled water
DMEM/F12-10	Not applicable	Not applicable	Add 10 mL of Fetal Bovine Serum (FBS) and 1 mL of Penicillin/ Streptomycin (P/S) to DMEM/F12 (q.s.p. 100 mL)
DMEM/F12-10 + supernatant of L-929 cells	Not applicable	Not applicable	Add 20% of supernatant of L929 cells culture on DMEM/F-12-10
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium - F12 (DMEM/F12)	GIBCO	12500096	DMEM: F-12 Medium contains 2.5 mM L-glutamine, 15 mM HEPES, 0.5 mM sodium pyruvate, and 1200 mg/L sodium bicarbonate.Resuspend powder to 1 liter of distilled water and add 3,7 g of sodium bicarbonate. Adjust pH to 7,2 and filter with 0,22 µM. Storage at 2 - 8 °C freezer
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, United States (FBS)	GIBCO	10082147	Enrichment for DMEM-F12
Hemocytometer	SIGMA-ALDRICH	Z359629	Used to count macrophages at microscopy
L-929 cells	SIGMA-ALDRICH	ATCC # CCL-1	L-929 is a lineage of mouse fibroblast cells used as a source of macrophage colony stimulating factor (M-CSF)
Nikon TI eclipse	NIKON	Not applicable	Nikon TI Eclipse is a fluorescence and phase contrast microscope
Non-enzymatic cell dissociation solution	CELLSTRIPER (CORNING)	25-056-CI	Non-enzimatic cell dissociation solution remove macrophages from the plate without damaging them
Non-treated round culture dishes 100 × 20–mm	CORNING	CLS430591	Do not use tissue culture treated petri dishes or any tissue culture treated plate
P3199 Penicillin G Potassium Salt	USBIOLOGICAL	113-98-4	Antibiotics
Penicillin and streptomycin (P/S) solution			Use 0,26 grams of penicillin and 0,40 grams of streptomycin. Mix with 40 mL of sterile PBS. Inside a horizontal laminar flow cabinet, use a 0,22 µM filter and store aliquots of 1.0 mL in 1.5 ml microfuge tubes in the freezer (-20°C)
Phosphate Buffered Saline free from Calcium and Magnesium (PBS)	MEDIATECH	21-040-CM	Sterile
S7975 Streptomycin Sulfate, 650-850U/mg	USBIOLOGICAL	3810-74-0	Antibiotics
Serological pipettes of 10mL or 25 mL	SARSTEDT	861254001	Serological pipettes is used volumes higher than 1 mL
Sodium Bicarbonate	SIGMA-ALDRICH	144-55-8	pH correction for DMEM-F12
Software Nis Elements Viewer	NIKON	Not applicable	NIS-Elements Viewer is a free standalone program to view image files and datasets
Sterile PBS and 2% of P/S solution	LABORCRIN	590338	Add 1 mL of P/S in 40 mL of sterile PBS
Straight iris scissors	KATENA	Not applicable	Maintain in sterile beaker containing 70% ethanol solution
Supernatant of L-929 cells	Not applicable	Not applicable	L-929 is a lineage of mouse fibroblast cells used as a source of macrophage colony stimulating factor (M-CSF). L-929 supernatant was obtain from the protocol
Surgical Scalpel Blade No.24 Stainless Steel	SWANN-MORTON	311	Used for exposing epiphysis from bones
Trypan Blue Solution, 0.4%	GIBCO	15250061	Trypan Blue Solution, 0.4%, is routinely used as a cell stain to assess cell viability using the dye exclusion test
Trypsin/EDTA solution 0,05%	GIBCO	25300-062	Used to dissociate cells from culture bottle
Water for Injection (WFI) for Cell Culture	GIBCO	A12873	Sterile and endotoxin-free water