Isolement et culture de macrophages dérivés de la moelle osseuse de souris

Résumé

Le présent protocole décrit l’isolement et la culture de macrophages dérivés de la moelle osseuse de souris.

Résumé

Les macrophages ont d’importantes fonctions effectrices dans l’homéostasie et l’inflammation. Ces cellules sont présentes dans tous les tissus du corps et ont l’importante capacité de modifier leur profil en fonction des stimuli présents dans le microenvironnement. Les cytokines peuvent profondément affecter la physiologie des macrophages, en particulier l’IFN-γ et l’interleukine 4, générant respectivement les types M1 et M2. En raison de la polyvalence de ces cellules, la production d’une population de macrophages dérivés de la moelle osseuse peut être une étape fondamentale dans de nombreux modèles expérimentaux de biologie cellulaire. L’objectif de ce protocole est d’aider les chercheurs à isoler et à cultiver des macrophages dérivés de progéniteurs de la moelle osseuse. Les progéniteurs de la moelle osseuse de souris C57BL/6 exemptes d’agents pathogènes sont transformés en macrophages lors de l’exposition au facteur de stimulation des colonies de macrophages (M-CSF) qui, dans ce protocole, est obtenu à partir du surnageant de la lignée de fibroblastes murins L-929. Après l’incubation, les macrophages matures sont disponibles pour une utilisation du 7^au 10^e jour. Un seul animal peut être la source d’environ 2 x 10⁷ macrophages. Par conséquent, il s’agit d’un protocole idéal pour obtenir de grandes quantités de macrophages primaires en utilisant des méthodes de base de culture cellulaire.

Introduction

Les monocytes et les macrophages sont des phagocytes mononucléaires qui peuvent être dérivés de progéniteurs dans la moelle osseuse. Des études récentes ont rapporté que les macrophages proviennent également de progéniteurs érythro-myéloïdes dérivés du sac vitellin¹. Quelle que soit leur dérivation, ces leucocytes ont des fonctions effectrices importantes dans l’homéostasie et l’inflammation ^2,3. Les monocytes sont des cellules du sang périphérique qui peuvent se différencier en macrophages dans les tissus ^2,4, tandis que les macrophages sont des cellules hétérogènes qui présentent des phénotypes et des fonctions régulés par l’exposition locale de facteurs de croissance et de cytokines⁵. Étant donné que les macrophages présentent une telle diversité fonctionnelle, ils ont été étudiés dans de nombreux modèles de maladies. Ainsi, la culture in vitro des macrophages est devenue un outil important pour comprendre leur physiologie et leur rôle dans différentes maladies. La moelle osseuse est une source importante de cellules progénitrices, y compris les progéniteurs de macrophages, qui peuvent être isolés et multipliés, augmentant ainsi de façon exponentielle le nombre de macrophages obtenus. De plus, les macrophages dérivés de la moelle osseuse sont particulièrement importants pour éviter les effets générés par le microenvironnement tissulaire, car les macrophages changent de phénotype en réponse à différents stimuli dans les tissus ^6,7. Les progéniteurs de la moelle osseuse se transforment en macrophages lorsqu’ils sont exposés au facteur de stimulation des colonies de macrophages (M-CSF)⁸. Les macrophages dérivés de la moelle osseuse ne peuvent pas être distingués des macrophages dérivés des monocytes par des marqueurs biochimiques dans les tissus. Ces cellules représentent une population très homogène de cellules primaires, qui, à bien d’autres égards, sont comparables aux macrophages péritonéaux ^6,9.

En raison de leur ensemble hétérogène de fonctions cellulaires, les macrophages ont longtemps été étudiés en profondeur par les chercheurs. Ces cellules peuvent être utilisées dans différents modèles expérimentaux, y compris les maladies infectieuses et inflammatoires, car elles sont présentes dans ces processus^10,11. Ils peuvent également être utiles pour étudier la polarisation des macrophages en réponse à divers stimuli microenvironnementaux^12,13. Ainsi, un protocole simple et fiable est fourni ici dans le but d’obtenir un grand nombre de macrophages primaires à partir de la moelle osseuse de souris.

Protocole

Ce protocole a été réalisé conformément au Conseil national de contrôle de l’expérimentation animale (Concea) et avec l’approbation de la Commission d’éthique et d’utilisation des animaux (CEUA). Les souris C57BL/6 ont été achetées à Biotério Central de l’Université fédérale de Minas Gerais (UFMG), à Belo Horizonte, au Brésil. L’équipement de protection individuelle (EPI) tel que les blouses de laboratoire, les gants et les lunettes de protection doit être utilisé à toutes les étapes décrites dans le présent protocole.

1. Préparation du surnageant de la lignée des fibroblastes L-929 comme source de M-CSF

1. Décongelez les cellules de la lignée des fibroblastes L-929 (American Type Culture Collection Certified Cell Line-ATCC CCL1) et commencez immédiatement le processus de culture pour préserver la viabilité.
2. Dans une enceinte de biosécurité à flux laminaire, à l’aide d’une pipette de 1 000 μL, transférez les cellules de la lignée des fibroblastes L-929 du flacon dans un tube à centrifuger stérile de 50 mL.
3. À l’aide d’une pipette sérologique, ajoutez 50 ml de solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS), exempte de calcium et de magnésium.
4. Centrifugeuse à 300 x g, 4 °C pendant 10 min. Jetez le surnageant.
5. Remettre la pastille en suspension dans 20 mL de milieu F12 modifié par Dulbecco, complété par 10 % de sérum de veau fœtal (FBS) et 1 mL de pénicilline/streptomycine (P/S) (DMEM/F12-10) à l’aide d’une pipette sérologique.
6. Transférez les cellules remises en suspension dans une fiole de culture cellulaire T75.
7. Incuber dans un incubateur à 37 °C, 5 % de CO₂ jusqu’à la confluence complète.
   REMARQUE : Lorsque vous manipulez le flacon, veillez à ne pas mouiller le couvercle avec une solution, car cela peut être une source de contamination. Pour obtenir une quantité pratique de surnageant, il est nécessaire de répliquer les cellules après qu’elles aient recouvert toute la surface du ballon de culture cellulaire. Les cellules L-929 sont inhibées par contact. Une solution chaude de trypsine/acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), DMEM/F12-10 et du PBS stérile à 37 °C pour commencer l’expansion de la culture cellulaire, comme décrit dans les étapes suivantes.
8. Une fois la confluence maximale atteinte, jeter le surnageant de la fiole de culture cellulaire, à l’intérieur de l’enceinte de biosécurité à flux laminaire.
9. Laver le ballon de culture cellulaire avec 20 mL de PBS stérile à l’aide d’une pipette sérologique et jeter la solution.
10. Ajouter 10 mL de trypsine/EDTA (solution à 0,05 %) dans la fiole de culture cellulaire contenant les cellules collées.
11. Transférez le ballon de culture cellulaire du flux laminaire dans un incubateur à 37 °C, à 5 % de CO₂ et incubez pendant 3 min.
12. Agitez le ballon de culture cellulaire pour dissocier les cellules de la surface du ballon de culture et utilisez un microscope pour vous assurer que toutes les cellules ont été dissociées.
13. Inactiver la trypsine/EDTA (solution à 0,05 %) avec 10 mL de milieu DMEM/F12-10.
14. Transvaser la solution à l’aide d’une pipette sérologique dans un tube à centrifuger stérile de 50 mL.
15. Centrifugeuse à 300 x g à 4 °C pendant 10 min. Jetez le surnageant.
16. Remettre la pastille en suspension dans 10 mL de milieu DMEM/F12-10.
17. Ajouter 1 mL de suspension cellulaire dans une fiole de culture cellulaire T175 (culture 1:10).
18. Répétez la procédure pour obtenir dix flacons de culture cellulaire T175.
19. Ajouter 50 mL de DMEM/F12-10 dans chaque fiole de culture cellulaire.
20. Incuber dans un incubateur à 37 °C, 5 % de CO₂ jusqu’à la confluence complète.
    REMARQUE : Ces étapes garantissent 500 mL de surnageant cellulaire L-929. Le jour 5, après que les cellules ont recouvert la surface du ballon de culture cellulaire T175, le surnageant sera enrichi en M-CSF et devra être prélevé¹⁴.
21. Retirer le flacon de culture cellulaire de l’incubateur le 5e jour après l’inhibition de contact.
22. Transférez le milieu dans un tube à centrifuger stérile de 50 ml.
23. Centrifugeuse à 3 200 x g, à 4 °C pendant 10 min.
24. Prélever le surnageant enrichi en M-CSF et transférer la solution dans un tube à centrifuger stérile de 50 mL. Conserver au congélateur à -20 °C.
    REMARQUE : La centrifugation est extrêmement importante pour éliminer les cellules et les débris des surnageants.
25. Le surnageant L-929 est une source pratique et peu coûteuse de facteur de stimulation des colonies de macrophages (M-CSF) et contient généralement 5 à 10 ng/mL de M-CSF⁸. Ces surnageants contiennent également des traces d’autres cytokines et facteurs de croissance, mais ils n’exercent pas d’influence profonde sur la physiologie des macrophages¹⁵. Cependant, le M-CSF purifié peut être acheté et utilisé comme alternative aux surnageants L-929 à des concentrations de 1 à 2 ng/mL⁸.

2. Élimination du fémur et du tibia

1. Procéder à l’euthanasie de souris mâles de type sauvage C57BL-6 âgées de 8 semaines par luxation cervicale après asphyxie au dioxyde de carbone, conformément à la résolution normative numéro 18 du Conseil national de l’expérimentation animale (Concea) et avec l’approbation du Comité d’éthique et d’utilisation des animaux (CEUA).
2. Trempez la souris avec une solution d’éthanol à 70 % et utilisez des ciseaux stériles pour faire une incision de 1 cm le long de l’abdomen.
3. Retirez la peau jusqu’à ce que le muscle des pattes arrière soit complètement exposé.
4. Retirez les pattes arrière à hauteur des hanches en faisant attention de ne pas casser le fémur et le tibia.
5. Mettez les pattes arrière dans un tube à centrifuger conique avec une solution d’éthanol à 70%.
   REMARQUE : Utilisez toujours des souris exemptes d’agents pathogènes. Assurez-vous de collecter les deux pattes pour obtenir un plus grand nombre de cellules. L’étape 2 est réalisée dans un environnement non stérile (paillasse). Par conséquent, il est important de retirer soigneusement le fémur et le tibia afin qu’ils restent intacts pour éviter la contamination bactérienne. Les étapes restantes de cette procédure sont effectuées dans une enceinte de biosécurité à flux laminaire. Le temps d’exposition des jambes à une solution d’éthanol à 70% doit être limité à 10 min. Si le temps est plus long, les progéniteurs de la moelle osseuse peuvent être affectés.

3. Obtenir des progéniteurs de la moelle osseuse à partir de la lumière du tibia et du fémur

1. Retirez les cuisses de la solution d’éthanol à 70 % et transférez-les dans du PBS stérile.
2. Utiliser des pinces et des lingettes désinfectantes pour enlever tous les muscles et les fascias. L’os doit être propre après cette étape.
3. Utilisez une lame de scalpel chirurgical stérile pour couper l’épiphyse osseuse aux deux extrémités afin d’exposer la moelle osseuse.
4. Remplissez une seringue de 20 ml avec 10 ml de PBS stérile complété par une solution de pénicilline/streptomycine à 2 % et connectez-vous une aiguille de 26 G.
5. Tenez l’os à l’aide d’une pince à dissection anatomique d’une main et utilisez l’autre pour insérer l’aiguille dans la cavité osseuse. Attention à ne pas écraser l’os avec la pince.
6. Lavez l’intérieur de l’os avec le PBS et prélevez la moelle osseuse dans un tube à centrifuger conique stérile. Après cette étape, la cavité osseuse devrait apparaître blanche.
7. Centrifuger les cellules collectées pendant 10 min à 300 x g à 4 °C.
8. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 1 mL de DMEM/F12-10.
9. Homogénéiser et ajouter 9 mL supplémentaires de milieu DMEM/F12-10 pour porter les cellules à un total de 10 mL.

4. Culture de macrophages

1. Ajouter 1 ml de progéniteurs cellulaires dans chacune des boîtes de Pétri rondes en plastique de 100 mm x 20 mm (total de 10 boîtes), en répartissant les cellules sur les plaques à l’aide d’une pipette pour obtenir une distribution uniforme. N’utilisez pas de plats traités pour la culture tissulaire.
2. Ajouter 9 ml de DMEM/F12-10 complété par 20 % du surnageant cellulaire L-929 dans chaque boîte.
3. Incuber dans un incubateur à 37 °C, 5% de CO₂ .
4. Le 3^e jour, ajoutez 10 ml de milieu DMEM/F12-10 complété par 20 % du surnageant des cellules L-929 dans chaque boîte. De cette façon, les boîtes de culture disposent désormais d’un total de 20 ml de milieu de culture, suffisant pour la croissance des cellules jusqu’à la fin de leur maturation.
   REMARQUES : Les boîtes traitées par culture tissulaire ne doivent pas être utilisées car les macrophages, en tant que cellules adhérentes naturelles marquées par de fortes interactions avec les surfaces, ne se dissocieront pas facilement de la boîte par la suite. Habituellement, les progéniteurs cellulaires d’une souris (deux fémurs) peuvent être ensemencés dans 10 boîtes de culture. Les progéniteurs cellulaires se transforment en macrophages, qui peuvent être utilisés du jour 7 au 10e jour d’incubation. La confirmation de la maturation est identifiée par des modifications de la morphologie des macrophages. Les macrophages matures sont adhérents et présentent une morphologie hétérogène, expliquée par l’émission de pseudopodes dans différentes directions. Des exemples de ces cellules matures sont présentés dans les résultats représentatifs.

5. Récolte des macrophages

1. Jetez les surnageants de tous les plats de culture.
2. Laver chaque plat de culture avec 10 ml de PBS stérile chaud (37 °C) sans Mg²⁺ et Ca²⁺ .
3. Jetez la solution de chaque plat.
4. Préchauffer la solution de dissociation cellulaire non enzymatique à 37 °C et ajouter 3 mL dans chaque plat. Incuber 10 min dans un incubateur à 37 °C, 5% de CO₂ . Utilisez un microscope inversé pour visualiser si les macrophages se dissocient des boîtes de culture.
   REMARQUE : L’utilisation de plaques en plastique non traitées pour la culture tissulaire doit permettre une dissociation facile des cellules et éviter d’avoir à gratter les cellules de la plaque.
5. Lavez la vaisselle à l’aide d’une pipette sérologique avec la solution de dissociation cellulaire non enzymatique encore et encore, en effectuant des mouvements circulaires pour confirmer que tous les macrophages sont dissociés de la boîte.
6. Recueillir la solution de toutes les boîtes de culture dans un tube à centrifuger conique de 50 ml.
7. Ajouter 10 mL de PBS stérile préchauffé dans les boîtes de culture vides et procéder comme à l’étape 5.4. Cette procédure est une répétition de l’étape 5.4 et vise à garantir que tous les macrophages sont collectés.
8. Centrifugeuse à 300 x g, 4 °C pendant 10 min.
9. Jeter le surnageant et remettre la pastille en suspension avec 1 mL de DMEM/F12-10. Homogénéiser lentement et soigneusement de haut en bas à l’aide de la pipette pour éviter d’endommager les cellules.
10. Préparez une aliquote de 10 μL de solution de macrophage diluée avec 10 μL de Trypan Blue pour compter les cellules à l’aide de l’hémocytomètre.
    REMARQUE : Au jour 7, chaque plat produira environ 2 x 10⁶ macrophages. Cela signifie qu’une souris peut produire environ 2 x 10⁷ macrophages primaires lorsqu’elle est récoltée dans dix plaques. Étant donné que le M-CSF ne conduit que la maturation des macrophages, la procédure garantit une population de cellules qui n’est essentiellement constituée que de macrophages et exempte d’autres leucocytes contaminants¹⁶.

Résultats

Les macrophages sont de grandes cellules adhérentes avec des caractéristiques physiologiques particulières. Ils présentent une diversité de présentations morphologiques en culture en raison de leur capacité à adhérer au verre et au plastique, et leur morphologie étalée typique est liée à l’émission d’extensions cytoplasmiques (Figure 1). Une fois que les progéniteurs de la moelle osseuse sont exposés au M-CSF à partir du surnageant de cellule L-929 et commencent la trans...

Discussion

La production d’une population de macrophages dérivés de la moelle osseuse est une étape fondamentale dans de nombreux modèles expérimentaux de biologie cellulaire, en particulier lorsqu’il est important d’obtenir une population homogène de cellules primaires. Comme nous l’avons mentionné, les progéniteurs cellulaires ne peuvent se transformer en macrophages qu’en présence de M-CSF. Les surnageants cellulaires L-929 peuvent être utilisés comme source principale de M-CSF. Outre le coût, il n’y a au...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
20-cc syringe	DESCARPACK	SI100S4G	Sterile syringe
26-G needles	BD	497AQDKT7	Sterile needles
50-ml conical centrifuge tube	SARSTEDT	62547254	Plastic conical tubes suitable for centrifugation
70% ethanol solution	EMFAL	490	Ethanol solution for esterilization
Anatomical dissection forceps	3B SCIENTIFIC	W1670	Maintain in sterile beaker containing 70% ethanol solution
C57Bl/6 wild type mouse	Purchased from Biotério Central at Federal University of Minas Gerais	Not applicable	Mice must be specific-pathogen-free, age between 6 and 10 weeks. Mice need be accommodated at least one week earlier for recovering from the stress of transportation
Cell culture flask T175	GREINER	C7481-50EA	T-175 flask, canted neck, surface area 75 cm2, with filter cap, DNase free, RNase free
Cell culture flask T75	GREINER	C7231-120EA	T-75 flask, canted neck, surface area 75 cm2, with filter cap, DNase free, RNase free
Disinfecting or baby Wipes?	CLOROX	Not applicable	It helps cleaning the bone
Distilled Water	GIBCO	15230	Sterile distilled water
DMEM/F12-10	Not applicable	Not applicable	Add 10 mL of Fetal Bovine Serum (FBS) and 1 mL of Penicillin/ Streptomycin (P/S) to DMEM/F12 (q.s.p. 100 mL)
DMEM/F12-10 + supernatant of L-929 cells	Not applicable	Not applicable	Add 20% of supernatant of L929 cells culture on DMEM/F-12-10
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium - F12 (DMEM/F12)	GIBCO	12500096	DMEM: F-12 Medium contains 2.5 mM L-glutamine, 15 mM HEPES, 0.5 mM sodium pyruvate, and 1200 mg/L sodium bicarbonate.Resuspend powder to 1 liter of distilled water and add 3,7 g of sodium bicarbonate. Adjust pH to 7,2 and filter with 0,22 µM. Storage at 2 - 8 °C freezer
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, United States (FBS)	GIBCO	10082147	Enrichment for DMEM-F12
Hemocytometer	SIGMA-ALDRICH	Z359629	Used to count macrophages at microscopy
L-929 cells	SIGMA-ALDRICH	ATCC # CCL-1	L-929 is a lineage of mouse fibroblast cells used as a source of macrophage colony stimulating factor (M-CSF)
Nikon TI eclipse	NIKON	Not applicable	Nikon TI Eclipse is a fluorescence and phase contrast microscope
Non-enzymatic cell dissociation solution	CELLSTRIPER (CORNING)	25-056-CI	Non-enzimatic cell dissociation solution remove macrophages from the plate without damaging them
Non-treated round culture dishes 100 × 20–mm	CORNING	CLS430591	Do not use tissue culture treated petri dishes or any tissue culture treated plate
P3199 Penicillin G Potassium Salt	USBIOLOGICAL	113-98-4	Antibiotics
Penicillin and streptomycin (P/S) solution			Use 0,26 grams of penicillin and 0,40 grams of streptomycin. Mix with 40 mL of sterile PBS. Inside a horizontal laminar flow cabinet, use a 0,22 µM filter and store aliquots of 1.0 mL in 1.5 ml microfuge tubes in the freezer (-20°C)
Phosphate Buffered Saline free from Calcium and Magnesium (PBS)	MEDIATECH	21-040-CM	Sterile
S7975 Streptomycin Sulfate, 650-850U/mg	USBIOLOGICAL	3810-74-0	Antibiotics
Serological pipettes of 10mL or 25 mL	SARSTEDT	861254001	Serological pipettes is used volumes higher than 1 mL
Sodium Bicarbonate	SIGMA-ALDRICH	144-55-8	pH correction for DMEM-F12
Software Nis Elements Viewer	NIKON	Not applicable	NIS-Elements Viewer is a free standalone program to view image files and datasets
Sterile PBS and 2% of P/S solution	LABORCRIN	590338	Add 1 mL of P/S in 40 mL of sterile PBS
Straight iris scissors	KATENA	Not applicable	Maintain in sterile beaker containing 70% ethanol solution
Supernatant of L-929 cells	Not applicable	Not applicable	L-929 is a lineage of mouse fibroblast cells used as a source of macrophage colony stimulating factor (M-CSF). L-929 supernatant was obtain from the protocol
Surgical Scalpel Blade No.24 Stainless Steel	SWANN-MORTON	311	Used for exposing epiphysis from bones
Trypan Blue Solution, 0.4%	GIBCO	15250061	Trypan Blue Solution, 0.4%, is routinely used as a cell stain to assess cell viability using the dye exclusion test
Trypsin/EDTA solution 0,05%	GIBCO	25300-062	Used to dissociate cells from culture bottle
Water for Injection (WFI) for Cell Culture	GIBCO	A12873	Sterile and endotoxin-free water