Isolamento e cultura de macrófagos derivados da medula óssea de camundongos

Resumo

O presente protocolo descreve o isolamento e a cultura de macrófagos derivados da medula óssea de camundongos.

Resumo

Os macrófagos têm importantes funções efetoras na homeostase e inflamação. Essas células estão presentes em todos os tecidos do corpo e têm a importante capacidade de alterar seu perfil de acordo com os estímulos presentes no microambiente. As citocinas podem afetar profundamente a fisiologia dos macrófagos, especialmente o IFN-γ e a interleucina 4, gerando os tipos M1 e M2, respectivamente. Devido à versatilidade dessas células, a produção de uma população de macrófagos derivados da medula óssea pode ser uma etapa básica em muitos modelos experimentais de biologia celular. O objetivo deste protocolo é auxiliar os pesquisadores no isolamento e cultivo de macrófagos derivados de progenitores da medula óssea. Progenitores de medula óssea de camundongos C57BL/6 livres de patógenos são transformados em macrófagos após exposição ao fator estimulador de colônias de macrófagos (M-CSF) que, neste protocolo, é obtido do sobrenadante da linhagem de fibroblastos murinos L-929. Após a incubação, os macrófagos maduros estão disponíveis para uso do^7º ao^10º dia. Um único animal pode ser a fonte de aproximadamente 2 x 10⁷ macrófagos. Portanto, é um protocolo ideal para a obtenção de grandes quantidades de macrófagos primários usando métodos básicos de cultura celular.

Introdução

Monócitos e macrófagos são fagócitos mononucleares que podem ser derivados de progenitores na medula óssea. Estudos recentes relataram que os macrófagos também se originam de progenitores eritromielóides derivados do saco vitelino¹. Independentemente de sua derivação, esses leucócitos têm importantes funções efetoras na homeostase e inflamação ^2,3. Os monócitos são células do sangue periférico que podem se diferenciar ainda mais em macrófagos no tecido ^2,4, enquanto os macrófagos são células heterogêneas que exibem fenótipos e funções reguladas pela exposição local de fatores de crescimento e citocinas⁵. Como os macrófagos apresentam essa diversidade funcional, eles têm sido estudados em muitos modelos de doenças. Assim, o cultivo in vitro de macrófagos tornou-se uma importante ferramenta para a compreensão de sua fisiologia e seu papel em diferentes doenças. A medula óssea é uma importante fonte de células progenitoras, incluindo progenitores de macrófagos, que podem ser isoladas e multiplicadas, aumentando exponencialmente o número de macrófagos obtidos. Além disso, os macrófagos derivados da medula óssea são especialmente importantes para evitar os efeitos gerados pelo microambiente tecidual, uma vez que os macrófagos mudam seu fenótipo em resposta a diferentes estímulos nos tecidos ^6,7. Os progenitores da medula óssea se transformam em macrófagos após a exposição ao fator estimulador de colônias de macrófagos (M-CSF)⁸. Os macrófagos derivados da medula óssea não podem ser distinguidos dos macrófagos derivados de monócitos por marcadores bioquímicos no tecido. Essas células representam uma população altamente homogênea de células primárias, que em muitos outros aspectos são comparáveis aos macrófagos peritoneais ^6,9.

Devido ao seu conjunto heterogêneo de funções celulares, os macrófagos há muito são exaustivamente estudados pelos pesquisadores. Essas células podem ser utilizadas em diferentes modelos experimentais, incluindo doenças infecciosas e inflamatórias, pois estão presentes nesses processos^10,11. Eles também podem ser úteis para investigar a polarização de macrófagos em resposta a vários estímulos microambientais^12,13. Assim, um protocolo simples e confiável é fornecido aqui com o objetivo de obter um grande número de macrófagos primários da medula óssea de camundongos.

Protocolo

Este protocolo foi realizado de acordo com o Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal (Concea) e com a aprovação do Comitê de Ética e Uso de Animais (CEUA). Camundongos C57BL/6 foram adquiridos da Biotério Central da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG), Belo Horizonte, Brasil. Equipamentos de proteção individual (EPI), como jalecos, luvas e proteção para os olhos, devem ser usados em todas as etapas descritas neste protocolo.

1. Preparação do sobrenadante da linhagem L-929 de fibroblastos como fonte de M-CSF

1. Descongele as células da linhagem de fibroblastos L-929 (American Type Culture Collection Certified Cell Line-ATCC CCL1) e inicie o processo de cultura imediatamente para preservar a viabilidade.
2. Em um gabinete de biossegurança de fluxo laminar, usando uma pipeta de 1.000 μL, transfira as células da linhagem de fibroblastos L-929 do frasco para um tubo de centrífuga estéril de 50 mL.
3. Use uma pipeta sorológica para adicionar 50 mL de solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS), livre de cálcio e magnésio.
4. Centrifugar a 300 x g, 4 °C durante 10 min. Descarte o sobrenadante.
5. Ressuspenda o pellet em 20 mL de meio de Eagle modificado de Dulbecco-F12 suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1 mL de penicilina/estreptomicina (P/S) (DMEM/F12-10) usando uma pipeta sorológica.
6. Transferir as células ressuspensas para um balão de cultura de células T75.
7. Incubar em uma incubadora a 37 °C, 5% de CO₂ até a confluência completa.
   NOTA: Ao manipular o frasco, tenha cuidado para evitar molhar a tampa com solução, pois isso pode ser uma fonte de contaminação. Para obter uma quantidade conveniente de sobrenadante, é necessário replicar as células depois que elas cobrem toda a superfície do frasco de cultura de células. As células L-929 são inibidas pelo contato. Solução quente de tripsina/ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), DMEM/F12-10 e PBS estéril a 37 °C para iniciar a expansão da cultura celular, conforme descrito nas etapas a seguir.
8. Uma vez atingida a confluência total, rejeitar o sobrenadante do balão de cultura de células, dentro da cabina de biossegurança do fluxo laminar.
9. Lavar o balão de cultura de células com 20 ml de PBS estéril com uma pipeta serológica e rejeitar a solução.
10. Adicione 10 mL de tripsina / EDTA (solução a 0,05%) ao frasco de cultura de células contendo as células aderidas.
11. Transfira o frasco de cultura celular do fluxo laminar para uma incubadora de CO₂ a 37 ° C e 5% e incube por 3 min.
12. Agitar o balão de cultura de células para dissociar as células da superfície do balão de cultura e utilizar um microscópio para garantir que todas as células foram dissociadas.
13. Inative a tripsina / EDTA (solução a 0,05%) com 10 mL de meio DMEM / F12-10.
14. Transferir a solução utilizando uma pipeta serológica para um tubo de centrifugação estéril de 50 ml.
15. Centrifugar a 300 x g a 4 °C durante 10 min. Descarte o sobrenadante.
16. Ressuspenda o pellet em 10 mL de meio DMEM/F12-10.
17. Adicionar 1 ml da suspensão celular a um balão de cultura de células T175 (cultura 1:10).
18. Repetir o procedimento para obter dez balões de cultura de células T175.
19. Adicionar 50 ml de DMEM/F12-10 a cada balão de cultura de células.
20. Incubar em uma incubadora a 37 °C, 5% de CO₂ até a confluência completa.
    NOTA: Essas etapas garantem 500 mL de sobrenadante de célula L-929. No dia 5, após as células terem coberto a superfície do frasco de cultura de células T175, o sobrenadante será enriquecido para M-CSF e deverá ser coletado¹⁴.
21. Remova o frasco de cultura de células da incubadora no dia 5 após a inibição de contato.
22. Transfira o meio para um tubo de centrífuga estéril de 50 mL.
23. Centrifugar a 3.200 x g, a 4 °C durante 10 min.
24. Recolha o sobrenadante enriquecido com M-CSF e transfira a solução para um tubo de centrifugação estéril de 50 ml. Conservar no congelador a -20 °C.
    NOTA: A centrifugação é extremamente importante para remover células e detritos dos sobrenadantes.
25. O sobrenadante L-929 é uma fonte conveniente e barata de fator estimulador de colônias de macrófagos (M-CSF) e normalmente contém 5 a 10 ng/mL de M-CSF⁸. Esses sobrenadantes também contêm vestígios de outras citocinas e fatores de crescimento, mas não exercem uma influência profunda na fisiologia dos macrófagos¹⁵. No entanto, o M-CSF purificado pode ser adquirido e usado como alternativa aos sobrenadantes L-929 em concentrações de 1 a 2 ng/mL⁸.

2. Remoção do fêmur e tíbia

1. Proceder à eutanásia de camundongo macho C57BL-6 de 8 semanas de idade, por luxação cervical após asfixia por dióxido de carbono, de acordo com a resolução normativa número 18 do Conselho Nacional de Experimentação Animal (Concea) e com aprovação do Comitê de Ética e Uso de Animais (CEUA).
2. Mergulhe o mouse com solução de etanol a 70% e use uma tesoura estéril para fazer uma incisão de 1 cm ao longo do abdômen.
3. Remova a pele até que o músculo das patas traseiras esteja totalmente exposto.
4. Remova as patas traseiras na altura do quadril, tomando cuidado para não quebrar o fêmur e a tíbia.
5. Coloque as patas traseiras em um tubo de centrífuga cônico com solução de etanol a 70%.
   NOTA: Sempre use camundongos livres de patógenos. Certifique-se de coletar as duas pernas para obter um número maior de células. A etapa 2 é realizada em um ambiente não estéril (bancada). Por isso, é importante remover o fêmur e a tíbia com cuidado para que permaneçam intactos para evitar contaminação bacteriana. As demais etapas deste procedimento são realizadas em um gabinete de biossegurança de fluxo laminar. O tempo de exposição das pernas à solução de etanol a 70% deve ser limitado a 10 min. Se o tempo for maior, os progenitores da medula óssea podem ser afetados.

3. Obtenha progenitores da medula óssea a partir do lúmen da tíbia e do fêmur

1. Remova as pernas da solução de etanol a 70% e transfira-as para PBS estéril.
2. Usando fórceps e lenços desinfetantes para remover todos os músculos e fáscias. O osso deve estar limpo após esta etapa.
3. Use uma lâmina de bisturi cirúrgico estéril para cortar a epífise óssea em ambas as extremidades para expor a medula óssea.
4. Encha uma seringa de 20 mL com 10 mL de PBS estéril suplementado com solução de penicilina/estreptomicina a 2% e conecte uma agulha de 26 G.
5. Segure o osso usando uma pinça de dissecção anatômica com uma mão e use a outra para inserir a agulha na cavidade óssea. Tenha cuidado para não esmagar o osso com a pinça.
6. Lave o interior do osso com o PBS e colete a medula óssea em um tubo de centrífuga cônico estéril. Após esta etapa, a cavidade óssea deve parecer branca.
7. Centrifugue as células coletadas por 10 min a 300 x g a 4 °C.
8. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 1 ml de DMEM/F12-10.
9. Homogeneizar e adicionar mais 9 mL de meio DMEM/F12-10 para elevar as células a um total de 10 mL.

4. Cultura de macrófagos

1. Adicionar 1 mL de progenitores celulares a cada uma das placas de Petri plásticas redondas de 100 mm x 20 mm (total de 10 placas), espalhando as células pelas placas com uma pipeta para obter uma distribuição uniforme. Não use placas tratadas com cultura de tecidos.
2. Adicione 9 mL de DMEM / F12-10 suplementado com 20% do sobrenadante celular L-929 a cada placa.
3. Incubar em uma incubadora a 37 °C, 5% de CO₂ .
4. No^3º dia, adicionar 10 mL de meio DMEM/F12-10 suplementado com 20% do sobrenadante de células L-929 a cada placa. Desta forma, as placas de cultura passam a ter um total de 20 mL de meio de cultura, suficiente para o crescimento das células até o final de sua maturação.
   NOTAS: As placas tratadas com cultura de tecidos não devem ser usadas porque os macrófagos, como células aderentes naturais marcadas por fortes interações com as superfícies, não se dissociam facilmente da placa posteriormente. Normalmente, os progenitores celulares de um camundongo (dois fêmures) podem ser semeados em 10 placas de cultura. Os progenitores celulares se transformarão em macrófagos, que podem ser usados do 7º ao 10º dia de incubação. A confirmação da maturação é identificada por alterações na morfologia dos macrófagos. Macrófagos maduros são aderentes e apresentam morfologia heterogênea, explicada pela emissão de pseudópodes em diferentes direções. Exemplos dessas células maduras são mostrados nos resultados representativos.

5. Colheita de macrófagos

1. Descarte os sobrenadantes de todos os pratos de cultura.
2. Lave cada placa de cultura com 10 ml de PBS quente (37 °C) estéril sem Mg²⁺ e Ca²⁺ .
3. Descarte a solução de cada prato.
4. Pré-aqueça a solução de dissociação celular não enzimática a 37 °C e adicione 3 ml a cada placa. Incubar por 10 min em uma incubadora a 37 °C, 5% de CO₂ . Use um microscópio invertido para visualizar se os macrófagos estão se dissociando das placas de cultura.
   NOTA: O uso de placas plásticas não tratadas com cultura de tecidos deve permitir a fácil dissociação das células e evitar a necessidade de raspar as células da placa.
5. Lave a loiça com uma pipeta serológica com a solução de dissociação celular não enzimática repetidamente, realizando movimentos circulares para confirmar que todos os macrófagos estão dissociados da placa.
6. Recolher a solução de todas as placas de cultura para um tubo de centrifugação cónico de 50 ml.
7. Adicione 10 ml de PBS pré-aquecido estéril às placas de cultura vazias e proceda como no passo 5.4. Este procedimento é uma repetição do passo 5.4 e pretende garantir que todos os macrófagos sejam coletados.
8. Centrifugar a 300 x g, 4 °C durante 10 min.
9. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento com 1 ml de DMEM/F12-10. Homogeneizar lenta e cuidadosamente para cima e para baixo usando a pipeta para evitar danificar as células.
10. Preparar uma alíquota de 10 μL de solução de macrófagos diluída com 10 μL de azul de tripano para contar as células utilizando o hemocitómetro.
    NOTA: No dia 7, cada prato produzirá aproximadamente 2 x 10⁶ macrófagos. Isso significa que um camundongo pode produzir aproximadamente 2 x 10⁷ macrófagos primários quando colhido em dez placas. Como o M-CSF apenas impulsiona a maturação dos macrófagos, o procedimento garante uma população de células que é essencialmente apenas macrófagos e livre de outros leucócitos contaminantes¹⁶.

Resultados

Os macrófagos são células grandes e aderentes com características fisiológicas especiais. Eles mostram uma diversidade de apresentações morfológicas em cultura devido à capacidade de aderir ao vidro e ao plástico, e sua morfologia típica de espalhamento está relacionada à emissão de extensões citoplasmáticas (Figura 1). Uma vez que os progenitores da medula óssea são expostos ao M-CSF do sobrenadante da célula L-929 e iniciam a transformação em macrófagos maduros, eles ...

Discussão

A produção de uma população de macrófagos derivados da medula óssea é uma etapa básica em muitos modelos experimentais de biologia celular, especialmente quando é importante alcançar uma população homogênea de células primárias. Como mencionado, os progenitores celulares só podem se transformar em macrófagos na presença de M-CSF. Os sobrenadantes de células L-929 podem ser usados como a principal fonte de M-CSF. Além do custo, não há problema em usar o próprio M-CSF recombinante

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
20-cc syringe	DESCARPACK	SI100S4G	Sterile syringe
26-G needles	BD	497AQDKT7	Sterile needles
50-ml conical centrifuge tube	SARSTEDT	62547254	Plastic conical tubes suitable for centrifugation
70% ethanol solution	EMFAL	490	Ethanol solution for esterilization
Anatomical dissection forceps	3B SCIENTIFIC	W1670	Maintain in sterile beaker containing 70% ethanol solution
C57Bl/6 wild type mouse	Purchased from Biotério Central at Federal University of Minas Gerais	Not applicable	Mice must be specific-pathogen-free, age between 6 and 10 weeks. Mice need be accommodated at least one week earlier for recovering from the stress of transportation
Cell culture flask T175	GREINER	C7481-50EA	T-175 flask, canted neck, surface area 75 cm2, with filter cap, DNase free, RNase free
Cell culture flask T75	GREINER	C7231-120EA	T-75 flask, canted neck, surface area 75 cm2, with filter cap, DNase free, RNase free
Disinfecting or baby Wipes?	CLOROX	Not applicable	It helps cleaning the bone
Distilled Water	GIBCO	15230	Sterile distilled water
DMEM/F12-10	Not applicable	Not applicable	Add 10 mL of Fetal Bovine Serum (FBS) and 1 mL of Penicillin/ Streptomycin (P/S) to DMEM/F12 (q.s.p. 100 mL)
DMEM/F12-10 + supernatant of L-929 cells	Not applicable	Not applicable	Add 20% of supernatant of L929 cells culture on DMEM/F-12-10
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium - F12 (DMEM/F12)	GIBCO	12500096	DMEM: F-12 Medium contains 2.5 mM L-glutamine, 15 mM HEPES, 0.5 mM sodium pyruvate, and 1200 mg/L sodium bicarbonate.Resuspend powder to 1 liter of distilled water and add 3,7 g of sodium bicarbonate. Adjust pH to 7,2 and filter with 0,22 µM. Storage at 2 - 8 °C freezer
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, United States (FBS)	GIBCO	10082147	Enrichment for DMEM-F12
Hemocytometer	SIGMA-ALDRICH	Z359629	Used to count macrophages at microscopy
L-929 cells	SIGMA-ALDRICH	ATCC # CCL-1	L-929 is a lineage of mouse fibroblast cells used as a source of macrophage colony stimulating factor (M-CSF)
Nikon TI eclipse	NIKON	Not applicable	Nikon TI Eclipse is a fluorescence and phase contrast microscope
Non-enzymatic cell dissociation solution	CELLSTRIPER (CORNING)	25-056-CI	Non-enzimatic cell dissociation solution remove macrophages from the plate without damaging them
Non-treated round culture dishes 100 × 20–mm	CORNING	CLS430591	Do not use tissue culture treated petri dishes or any tissue culture treated plate
P3199 Penicillin G Potassium Salt	USBIOLOGICAL	113-98-4	Antibiotics
Penicillin and streptomycin (P/S) solution			Use 0,26 grams of penicillin and 0,40 grams of streptomycin. Mix with 40 mL of sterile PBS. Inside a horizontal laminar flow cabinet, use a 0,22 µM filter and store aliquots of 1.0 mL in 1.5 ml microfuge tubes in the freezer (-20°C)
Phosphate Buffered Saline free from Calcium and Magnesium (PBS)	MEDIATECH	21-040-CM	Sterile
S7975 Streptomycin Sulfate, 650-850U/mg	USBIOLOGICAL	3810-74-0	Antibiotics
Serological pipettes of 10mL or 25 mL	SARSTEDT	861254001	Serological pipettes is used volumes higher than 1 mL
Sodium Bicarbonate	SIGMA-ALDRICH	144-55-8	pH correction for DMEM-F12
Software Nis Elements Viewer	NIKON	Not applicable	NIS-Elements Viewer is a free standalone program to view image files and datasets
Sterile PBS and 2% of P/S solution	LABORCRIN	590338	Add 1 mL of P/S in 40 mL of sterile PBS
Straight iris scissors	KATENA	Not applicable	Maintain in sterile beaker containing 70% ethanol solution
Supernatant of L-929 cells	Not applicable	Not applicable	L-929 is a lineage of mouse fibroblast cells used as a source of macrophage colony stimulating factor (M-CSF). L-929 supernatant was obtain from the protocol
Surgical Scalpel Blade No.24 Stainless Steel	SWANN-MORTON	311	Used for exposing epiphysis from bones
Trypan Blue Solution, 0.4%	GIBCO	15250061	Trypan Blue Solution, 0.4%, is routinely used as a cell stain to assess cell viability using the dye exclusion test
Trypsin/EDTA solution 0,05%	GIBCO	25300-062	Used to dissociate cells from culture bottle
Water for Injection (WFI) for Cell Culture	GIBCO	A12873	Sterile and endotoxin-free water