Isolation and Culture of Bone Marrow-Derived Macrophages from Mice

요약

본 프로토콜은 마우스에서 골수 유래 대식세포의 분리 및 배양을 설명합니다.

초록

대식세포는 항상성과 염증에 중요한 영향을 미치는 기능을 합니다. 이 세포는 신체의 모든 조직에 존재하며 미세 환경에 존재하는 자극에 따라 프로필을 변경하는 중요한 능력을 가지고 있습니다. 사이토카인은 대식세포 생리학, 특히 IFN-γ 및 인터루킨 4에 깊은 영향을 미칠 수 있으며, 각각 M1 및 M2 유형을 생성합니다. 이러한 세포의 다양성으로 인해 골수 유래 대식세포 집단의 생산은 세포 생물학의 많은 실험 모델에서 기본 단계가 될 수 있습니다. 이 프로토콜의 목적은 골수 전구세포에서 유래한 대식세포의 분리 및 배양 연구자들을 돕는 것입니다. 병원체가 없는 C57BL/6 마우스의 골수 전구세포는 이 프로토콜에서 쥐 섬유아세포 계통 L-929의 상층액에서 얻어지는 대식세포 집락 자극 인자(M-CSF)에 노출되면 대식세포로 변형됩니다. 배양 후 성숙한 대식 세포는 7^일부터 10^{일까지 사용할} 수 있습니다. 단일 동물은 약 2 x 10⁷ 대식세포의 공급원이 될 수 있습니다. 따라서 기본 세포 배양 방법을 사용하여 다량의 일차 대식세포를 얻기 위한 이상적인 프로토콜입니다.

서문

단핵구(monocyte)와 대식세포(macrophage)는 골수의 전구세포(progenitor)에서 유래할 수 있는 단핵 식세포(mononuclear phagocyte)입니다. 최근 연구에 따르면 대식세포는 난황낭 유래 적혈구-골수성 전구세포(earmanitor of yalk sac-derived erythro-myeloid progenitors)에서 유래한다고 보고되었습니다¹. 그 유래에 관계없이, 이 백혈구는 항상성과 염증에 중요한 영향을 미치는 기능을 가지고 있습니다 ^2,3. 단핵구(monocyte)는 말초 혈액에서 유래한 세포로 조직 내의 대식세포(^2,4)로 더욱 분화할 수 있는 반면, 대식세포는 성장인자와 사이토카인(cytokine)의 국소적 노출에 의해 조절되는 표현형과 기능을 나타내는 이질적인 세포이다⁵. 대식세포는 이러한 기능적 다양성을 보여주기 때문에 많은 질병 모델에서 연구되었습니다. 따라서 대식세포의 체외 배양은 대식세포의 생리학과 다양한 질병에서의 역할을 이해하는 데 중요한 도구가 되었습니다. 골수는 대식세포 전구세포를 포함한 전구세포의 중요한 공급원으로, 분리 및 증식할 수 있어 얻어지는 대세포의 수를 기하급수적으로 증가시킬 수 있습니다. 또한, 골수 유래 대식세포는 조직의 다양한 자극에 반응하여 표현형을 변화시키기 때문에 조직 미세환경에 의해 생성되는 영향을 피하기 위해 특히 중요합니다 ^6,7. 골수 전구 세포는 대식세포 집락 자극 인자(M-CSF^)에 노출되면 대식세포로 변형됩니다8. 골수 유래 대식세포는 조직 내 생화학적 마커에 의해 단핵구 유래 대식세포와 구별할 수 없습니다. 이들 세포는 1차 세포의 매우 균질한 집단을 나타내며, 다른 많은 측면에서 복막 대식세포(peritoneal macrophage) ^6,9와 유사하다.

이질적인 세포 기능 때문에 대식세포는 오랫동안 연구자들에 의해 철저히 연구되어 왔습니다. 이들 세포는 감염성 및 염증성 질환을 포함한 다양한 실험 모델에서 사용될 수 있으며, 이러한 과정에서 특징을 갖춰 보인다 ^10,11. 그들은 또한 다양한 미시 환경 자극에 대한 반응으로 대식 세포 분극을 조사하는 데 유용 할 수 있습니다^12,13. 따라서, 마우스 골수로부터 많은 수의 일차 대식세포를 얻기 위한 목적으로 간단하고 신뢰할 수 있는 프로토콜이 여기에 제공된다.

프로토콜

이 프로토콜은 국가 동물 실험 통제 위원회(Concea)와 동물 윤리 및 사용 위원회(CEUA)의 승인에 따라 수행되었습니다. C57BL/6 마우스는 브라질 벨루오리존치에 있는 미나스 제라이스 연방대학교(UFMG)의 Biotério Central에서 구입하였다. 실험실 가운, 장갑 및 눈 보호구와 같은 개인 보호 장비(PPE)는 이 프로토콜에 설명된 모든 단계에서 사용해야 합니다.

1. M-CSF의 공급원으로서의 섬유아세포 L-929 계통 상층액의 제조

1. L-929 섬유아세포 계통 세포(American Type Culture Collection Certified Cell Line-ATCC CCL1)를 해동하고 생존력을 보존하기 위해 즉시 배양 과정을 시작합니다.
2. 층류 생물 안전 작업대에서 1,000 μL 피펫을 사용하여 바이알의 L-929 섬유아세포 계통 세포를 50 mL 멸균 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
3. 혈청학적 피펫을 사용하여 칼슘과 마그네슘이 없는 멸균 인산염 완충 식염수(PBS) 50mL를 추가합니다.
4. 300 x g, 4 °C에서 10분 동안 원심분리기 상층액을 버립니다.
5. 혈청학적 피펫을 사용하여 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 페니실린/스트렙토마이신(P/S)(DMEM/F12-10)이 보충된 Dulbecco의 변형된 Eagle′s medium-F12 20mL에 펠릿을 재현탁시킵니다.
6. 재현탁 세포를 T75 세포 배양 플라스크로 옮깁니다.
7. 37 °C, 5%_CO2 인큐베이터에서 완전히 합류할 때까지 배양합니다.
   알림: 플라스크를 조작하는 동안 오염원이 될 수 있으므로 용액으로 덮개를 적시지 않도록 주의하십시오. 편리한 양의 상층액을 얻으려면 세포 배양 플라스크의 전체 표면을 덮은 후 세포를 복제해야 합니다. L-929 세포는 접촉에 의해 억제됩니다. 다음 단계에 설명된 대로 트립신/에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 용액, DMEM/F12-10 및 멸균 PBS를 37°C로 가열하여 세포 배양 팽창을 시작합니다.
8. 완전히 합류하는 지점에 도달하면 세포 배양 플라스크에서 상층액을 층류 생물안전 캐비닛 내부에 버리십시오.
9. 혈청학적 피펫을 사용하여 20mL의 멸균 PBS로 세포 배양 플라스크를 세척하고 용액을 버립니다.
10. 부착된 세포가 들어 있는 세포 배양 플라스크에 10mL의 트립신/EDTA(0.05% 용액)를 추가합니다.
11. 세포 배양 플라스크를 층류에서 37°C, 5%_CO2 인큐베이터로 옮기고 3분 동안 배양합니다.
12. 세포 배양 플라스크를 흔들어 배양 플라스크 표면에서 세포를 해리하고 현미경을 사용하여 모든 세포가 해리되었는지 확인합니다.
13. 10mL의 DMEM/F12-10 배지와 함께 trypsin/EDTA(0.05% 용액)를 비활성화합니다.
14. 혈청학적 피펫을 사용하여 용액을 50mL 멸균 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
15. 4 °C에서 300 x g 으로 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 버립니다.
16. 펠릿을 DMEM/F12-10 배지 10mL에 재현탁시킵니다.
17. 세포 현탁액 1mL를 T175 세포 배양 플라스크(1:10 배양)에 추가합니다.
18. 이 절차를 반복하여 T175 세포 배양 플라스크 10개를 얻습니다.
19. 각 세포 배양 플라스크에 50mL의 DMEM/F12-10을 추가합니다.
20. 37 °C, 5%_CO2 인큐베이터에서 완전히 합류할 때까지 배양합니다.
    참고: 이 단계는 500mL의 L-929 세포 상층액을 보장합니다. 5일째, 세포가 T175 세포 배양 플라스크 표면을 덮은 후, 상층액은 M-CSF를 위해 농축될 것이며 반드시 수집되어야 한다¹⁴.
21. 접촉 억제 후 5일째에 인큐베이터에서 세포 배양 플라스크를 제거합니다.
22. 배지를 50mL 멸균 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
23. 3,200 x g에서 4°C에서 10분 동안 원심분리기
24. M-CSF가 농축된 상층액을 수집하고 용액을 50mL 멸균 원심분리 튜브로 옮깁니다. -20 °C의 냉동실에 보관하십시오.
    참고: 원심분리는 상층액에서 세포와 파편을 제거하는 데 매우 중요합니다.
25. L-929 상층액은 편리하고 저렴한 대식세포 집락 자극 인자(M-CSF) 공급원이며 일반적으로 5-10ng/mL의 M-CSF 8을 함유하고^있습니다. 이들 상등액은 또한 미량의 다른 사이토카인(cytokine)과 성장 인자(growth factor)를 함유하고 있지만, 대식세포 생리학에 지대한 영향을 미치지는 않는다¹⁵. 그러나, 정제된 M-CSF는 1 - 2 ng/mL⁸의 농도에서 L-929 상층액의 대체품으로 구입하여 사용할 수 있다.

2. 대퇴골과 경골의 제거

1. 이산화탄소 질식 후 자궁경부 탈구에 의한 8주 된 C57BL-6 야생형 수컷 마우스 안락사를 국가동물실험위원회(Concea)의 규범 결의안 번호 18과 동물윤리 및 사용 위원회(CEUA)의 승인에 따라 진행합니다.
2. 70% 에탄올 용액에 쥐를 담그고 멸균 가위를 사용하여 복부를 따라 1cm를 절개합니다.
3. 뒷다리 근육이 완전히 드러날 때까지 피부를 제거합니다.
4. 뒷다리를 엉덩이 높이에서 제거하고 대퇴골과 경골이 부러지지 않도록 주의합니다.
5. 뒷다리를 70% 에탄올 용액이 있는 원뿔형 원심분리기 튜브에 넣습니다.
   알림: 항상 병원체가 없는 마우스를 사용하십시오. 더 많은 수의 세포를 얻으려면 두 다리를 모아야 합니다. 2단계는 비멸균 환경(벤치탑)에서 수행됩니다. 따라서 박테리아 오염을 피하기 위해 대퇴골과 경골을 조심스럽게 제거하여 손상되지 않도록 하는 것이 중요합니다. 이 절차의 나머지 단계는 층류 생물 안전 캐비닛에서 수행됩니다. 다리를 70% 에탄올 용액에 노출시키는 시간은 10분으로 제한해야 합니다. 시간이 길어지면 골수 전구 세포가 영향을 받을 수 있습니다.

3. 경골과 대퇴골의 내강에서 골수 전구 세포를 얻습니다.

1. 70% 에탄올 용액에서 다리를 제거하고 멸균 PBS로 옮깁니다.
2. 집게와 소독 물티슈를 사용하여 모든 근육과 근막을 제거합니다. 이 단계가 끝나면 뼈가 깨끗해야 합니다.
3. 멸균 수술용 메스 칼날을 사용하여 양쪽 끝의 골단을 절단하여 골수를 노출시킵니다.
4. 20mL 주사기에 2% 페니실린/스트렙토마이신 용액이 보충된 10mL의 멸균 PBS를 채우고 26G 바늘을 연결합니다.
5. 한 손으로 해부학적 해부 겸자를 사용하여 뼈를 잡고 다른 손으로 바늘을 골강에 삽입합니다. 집게로 뼈를 부수지 않도록 주의하세요.
6. PBS로 뼈 내부를 씻어내고 멸균 원추형 원심분리기에 골수를 채취합니다. 이 단계가 끝나면 골강이 하얗게 보여야 합니다.
7. 수집된 세포를 4°C에서 300 x g 에서 10분 동안 원심분리합니다.
8. 상층액을 버리고 세포 펠릿을 DMEM/F12-10 1mL에 재현탁시킵니다.
9. 균질화하고 9mL의 DMEM/F12-10 배지를 추가하여 세포를 총 10mL까지 만듭니다.

4. 대식세포 배양

1. 100mm x 20mm 원형 플라스틱 페트리 접시(총 10개의 접시) 각각에 1mL의 세포 전구체를 추가하고 피펫으로 플레이트에 세포를 펴서 균일한 분포를 얻습니다. 조직 배양 처리된 접시를 사용하지 마십시오.
2. 각 접시에 L-929 세포 상층액 20%가 보충된 DMEM/F12-10 9mL를 추가합니다.
3. 37 °C, 5%_CO2 인큐베이터에서 배양합니다.
4. 3^일째 되는 날에는 L-929 세포의 상층액 20%가 보충된 DMEM/F12-10 배지 10mL를 각 접시에 추가합니다. 이러한 방식으로, 배양 접시는 이제 총 20mL의 배양 배지를 가지며, 이는 세포가 성숙이 끝날 때까지 세포의 성장에 충분합니다.
   참고 사항 : 조직 배양 처리된 접시는 표면과의 강한 상호 작용으로 표시되는 자연 부착 세포인 대식세포가 나중에 접시에서 쉽게 분리되지 않기 때문에 사용해서는 안 됩니다. 일반적으로 한 마리의 쥐(두 개의 대퇴골)의 세포 전구는 10개의 배양 접시에 파종될 수 있습니다. 세포 전구 세포는 대식 세포로 변형되어 배양 7일에서 10일까지 사용할 수 있습니다. 성숙 확인은 대식세포의 형태에 대한 변화로 식별됩니다. 성숙한 대식세포는 부착되어 있으며 이질적인 형태를 보이며, 이는 다른 방향으로 pseudopodia가 방출되는 것으로 설명됩니다. 이러한 성숙한 세포의 예가 대표 결과에 나타나 있습니다.

5. 대식세포 채취

1. 모든 배양 접시에서 상층액을 버리십시오.
2. 각 배양 접시를 10mL의 따뜻한(37°C) 멸균 Mg²⁺ 및 Ca²⁺ 유리 PBS로 세척합니다.
3. 각 접시에서 용액을 버리십시오.
4. 비효소 세포 해리 용액을 37°C로 예열하고 각 접시에 3mL를 추가합니다. 37 °C, 5%_CO2 인큐베이터에서 10분 동안 배양합니다. 도립 현미경을 사용하여 대식세포가 배양 접시에서 분리되고 있는지 시각화합니다.
   알림: 비조직 배양 처리된 플라스틱 플레이트를 사용하면 세포를 쉽게 분리할 수 있고 플레이트에서 세포를 긁어낼 필요가 없어야 합니다.
5. 비효소 세포 해리 용액이 든 혈청학적 피펫을 사용하여 접시를 반복해서 세척하고 원을 그리며 모든 대식세포가 접시에서 해리되었는지 확인합니다.
6. 모든 배양 접시의 용액을 원뿔형 50mL 원심분리기 튜브에 함께 수집합니다.
7. 빈 배양 접시에 10mL의 멸균 예열된 PBS를 추가하고 5.4단계와 같이 진행합니다. 이 절차는 5.4단계를 반복하며 모든 대식세포가 수집되도록 보장하기 위한 것입니다.
8. 300 x g, 4 °C에서 10분 동안 원심분리기
9. 상층액을 버리고 1mL의 DMEM/F12-10으로 펠릿을 재현탁시킵니다. 세포가 손상되지 않도록 피펫을 사용하여 천천히 조심스럽게 위아래로 균질화합니다.
10. 10μL의 Trypan Blue로 희석한 10μL의 대식세포 용액 부분 표본을 준비하여 혈구계를 사용하여 세포를 계산합니다.
    참고: 7일째에 각 접시는 약 2 x 10⁶ 개의 대식세포를 생성합니다. 이는 쥐 한 마리를 10개의 플레이트에서 수확할 때 약 2 x 10⁷ 개의 주요 대식세포를 생산할 수 있음을 의미합니다. M-CSF는 대식세포의 성숙만을 촉진하기 때문에, 이 시술은 본질적으로 대식세포일 뿐이며 다른 오염성 백혈구가 없는 세포 집단을 보장한다¹⁶.

결과

대식세포는 특별한 생리학적 특성을 가진 크고 부착성 세포입니다. 그들은 유리와 플라스틱에 부착하는 능력 때문에 문화에서 다양한 형태학적 표현을 보여주며, 그들의 전형적인 확산 형태는 세포질 확장의 방출과 관련이 있습니다(그림 1). 골수 전구세포가 L-929 세포 상층액의 M-CSF에 노출되어 성숙한 대식세포로 변형을 시작하면 페트리 플레이트에 부착됩니다.

토론

골수 유래 대식세포 집단을 생성하는 것은 많은 세포 생물학 실험 모델에서 기본 단계이며, 특히 일차 세포의 균일한 집단을 달성하는 것이 중요한 경우에 그렇습니다. 앞서 언급했듯이 세포 전구 세포는 M-CSF가 있을 때만 대식세포로 변형될 수 있습니다. L-929 세포 상층액은 M-CSF의 주요 공급원으로 사용할 수 있습니다. 비용 이외에는 재조합 M-CSF 자체를 사용하는 데 문제가 없습니다^...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
20-cc syringe	DESCARPACK	SI100S4G	Sterile syringe
26-G needles	BD	497AQDKT7	Sterile needles
50-ml conical centrifuge tube	SARSTEDT	62547254	Plastic conical tubes suitable for centrifugation
70% ethanol solution	EMFAL	490	Ethanol solution for esterilization
Anatomical dissection forceps	3B SCIENTIFIC	W1670	Maintain in sterile beaker containing 70% ethanol solution
C57Bl/6 wild type mouse	Purchased from Biotério Central at Federal University of Minas Gerais	Not applicable	Mice must be specific-pathogen-free, age between 6 and 10 weeks. Mice need be accommodated at least one week earlier for recovering from the stress of transportation
Cell culture flask T175	GREINER	C7481-50EA	T-175 flask, canted neck, surface area 75 cm2, with filter cap, DNase free, RNase free
Cell culture flask T75	GREINER	C7231-120EA	T-75 flask, canted neck, surface area 75 cm2, with filter cap, DNase free, RNase free
Disinfecting or baby Wipes?	CLOROX	Not applicable	It helps cleaning the bone
Distilled Water	GIBCO	15230	Sterile distilled water
DMEM/F12-10	Not applicable	Not applicable	Add 10 mL of Fetal Bovine Serum (FBS) and 1 mL of Penicillin/ Streptomycin (P/S) to DMEM/F12 (q.s.p. 100 mL)
DMEM/F12-10 + supernatant of L-929 cells	Not applicable	Not applicable	Add 20% of supernatant of L929 cells culture on DMEM/F-12-10
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium - F12 (DMEM/F12)	GIBCO	12500096	DMEM: F-12 Medium contains 2.5 mM L-glutamine, 15 mM HEPES, 0.5 mM sodium pyruvate, and 1200 mg/L sodium bicarbonate.Resuspend powder to 1 liter of distilled water and add 3,7 g of sodium bicarbonate. Adjust pH to 7,2 and filter with 0,22 µM. Storage at 2 - 8 °C freezer
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, United States (FBS)	GIBCO	10082147	Enrichment for DMEM-F12
Hemocytometer	SIGMA-ALDRICH	Z359629	Used to count macrophages at microscopy
L-929 cells	SIGMA-ALDRICH	ATCC # CCL-1	L-929 is a lineage of mouse fibroblast cells used as a source of macrophage colony stimulating factor (M-CSF)
Nikon TI eclipse	NIKON	Not applicable	Nikon TI Eclipse is a fluorescence and phase contrast microscope
Non-enzymatic cell dissociation solution	CELLSTRIPER (CORNING)	25-056-CI	Non-enzimatic cell dissociation solution remove macrophages from the plate without damaging them
Non-treated round culture dishes 100 × 20–mm	CORNING	CLS430591	Do not use tissue culture treated petri dishes or any tissue culture treated plate
P3199 Penicillin G Potassium Salt	USBIOLOGICAL	113-98-4	Antibiotics
Penicillin and streptomycin (P/S) solution			Use 0,26 grams of penicillin and 0,40 grams of streptomycin. Mix with 40 mL of sterile PBS. Inside a horizontal laminar flow cabinet, use a 0,22 µM filter and store aliquots of 1.0 mL in 1.5 ml microfuge tubes in the freezer (-20°C)
Phosphate Buffered Saline free from Calcium and Magnesium (PBS)	MEDIATECH	21-040-CM	Sterile
S7975 Streptomycin Sulfate, 650-850U/mg	USBIOLOGICAL	3810-74-0	Antibiotics
Serological pipettes of 10mL or 25 mL	SARSTEDT	861254001	Serological pipettes is used volumes higher than 1 mL
Sodium Bicarbonate	SIGMA-ALDRICH	144-55-8	pH correction for DMEM-F12
Software Nis Elements Viewer	NIKON	Not applicable	NIS-Elements Viewer is a free standalone program to view image files and datasets
Sterile PBS and 2% of P/S solution	LABORCRIN	590338	Add 1 mL of P/S in 40 mL of sterile PBS
Straight iris scissors	KATENA	Not applicable	Maintain in sterile beaker containing 70% ethanol solution
Supernatant of L-929 cells	Not applicable	Not applicable	L-929 is a lineage of mouse fibroblast cells used as a source of macrophage colony stimulating factor (M-CSF). L-929 supernatant was obtain from the protocol
Surgical Scalpel Blade No.24 Stainless Steel	SWANN-MORTON	311	Used for exposing epiphysis from bones
Trypan Blue Solution, 0.4%	GIBCO	15250061	Trypan Blue Solution, 0.4%, is routinely used as a cell stain to assess cell viability using the dye exclusion test
Trypsin/EDTA solution 0,05%	GIBCO	25300-062	Used to dissociate cells from culture bottle
Water for Injection (WFI) for Cell Culture	GIBCO	A12873	Sterile and endotoxin-free water