Выделение и культивирование макрофагов, полученных из костного мозга у мышей

Резюме

В настоящем протоколе описывается выделение и культивирование макрофагов, полученных из костного мозга у мышей.

Аннотация

Макрофаги выполняют важные эффекторные функции в гомеостазе и воспалении. Эти клетки присутствуют в каждой ткани организма и обладают важной способностью изменять свой профиль в соответствии со стимулами, присутствующими в микроокружении. Цитокины могут оказывать глубокое влияние на физиологию макрофагов, особенно ИФН-γ и интерлейкин 4, генерируя типы М1 и М2 соответственно. Из-за универсальности этих клеток производство популяции макрофагов, полученных из костного мозга, может быть основным шагом во многих экспериментальных моделях клеточной биологии. Цель этого протокола — помочь исследователям в выделении и культивировании макрофагов, полученных из предшественников костного мозга. Предшественники костного мозга от мышей C57BL/6, свободных от патогенов, превращаются в макрофаги при воздействии макрофагального колониестимулирующего фактора (M-CSF), который в этом протоколе получают из надосадочной жидкости линии фибробластов мышей L-929. После инкубации зрелые макрофаги доступны для использования с^7-го по^10-й день. Одно животное может быть источником примерно 2 х^{10 7} макрофагов. Таким образом, он является идеальным протоколом для получения больших количеств первичных макрофагов с использованием основных методов культивирования клеток.

Введение

Моноциты и макрофаги являются мононуклеарными фагоцитами, которые могут быть получены от предшественников в костном мозге. Недавние исследования показали, что макрофаги также происходят из эритро-миелоидных предшественников, полученных из желточного мешка¹. Независимо от их происхождения, эти лейкоциты выполняют важные эффекторные функции в гомеостазе и воспалении ^2,3. Моноциты — это клетки периферической крови, которые в дальнейшем могут дифференцироваться в макрофаги в ткани ^2,4, тогда как макрофаги представляют собой гетерогенные клетки, которые демонстрируют фенотипы и функции, регулируемые местным воздействием факторов роста и цитокинов⁵. Поскольку макрофаги демонстрируют такое функциональное разнообразие, они были изучены на многих моделях заболеваний. Таким образом, культура макрофагов in vitro стала важным инструментом для понимания их физиологии и роли в различных заболеваниях. Костный мозг является важным источником клеток-предшественников, в том числе предшественников макрофагов, которые можно выделять и размножать, экспоненциально увеличивая количество получаемых макрофагов. Кроме того, макрофаги, полученные из костного мозга, особенно важны для того, чтобы избежать эффектов, генерируемых тканевым микроокружением, поскольку макрофаги изменяют свой фенотип в ответ на различные раздражители в тканях ^6,7. Предшественники костного мозга превращаются в макрофаги при воздействии макрофагального колониестимулирующего фактора (M-CSF)⁸. Макрофаги, полученные из костного мозга, невозможно отличить от макрофагов, полученных из моноцитов, по биохимическим маркерам в тканях. Эти клетки представляют собой высокооднородную популяцию первичных клеток, которые во многих других отношениях сопоставимы с перитонеальными макрофагами ^6,9.

Из-за своего гетерогенного набора клеточных функций макрофаги уже давно тщательно изучены исследователями. Эти клетки могут быть использованы в различных экспериментальных моделях, в том числе при инфекционных и воспалительных заболеваниях, так как они участвуют в этих процессах^10,11. Они также могут быть полезны для исследования поляризации макрофагов в ответ на различные микроэкологические стимулы^12,13. Таким образом, здесь представлен простой и надежный протокол с целью получения большого количества первичных макрофагов из костного мозга мыши.

протокол

Этот протокол был выполнен в соответствии с Национальным советом по контролю за экспериментами на животных (Concea) и с одобрения Комитета по этике и использованию животных (CEUA). Мыши C57BL/6 были приобретены в Biotério Central Федерального университета Минас-Жерайс (UFMG), Белу-Оризонти, Бразилия. Средства индивидуальной защиты (СИЗ), такие как лабораторные халаты, перчатки и средства защиты глаз, должны использоваться на всех этапах, описанных в данном протоколе.

1. Получение надосадочной жидкости линии фибробластов L-929 в качестве источника М-КСФ

1. Разморозьте клетки линии фибробластов L-929 (American Type Culture Collection Certified Cell Line-ATCC CCL1) и немедленно начните процесс культивирования для сохранения жизнеспособности.
2. В ламинарном проточном шкафу биобезопасности с помощью пипетки объемом 1000 мкл перенесите клетки линии фибробластов L-929 из флакона в стерильную центрифужную пробирку объемом 50 мл.
3. С помощью серологической пипетки добавьте 50 мл стерильного фосфатно-солевого буфера (PBS), не содержащего кальция и магния.
4. Центрифуга при 300 x g, 4 °C в течение 10 минут. Выбросьте надосадочную жидкость.
5. Ресуспендируйте гранулу в 20 мл модифицированной Eagle medium-F12 от Dulbecco, дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и 1 мл пенициллина/стрептомицина (P/S) (DMEM/F12-10) с помощью серологической пипетки.
6. Перенесите ресуспендированные клетки в колбу для клеточных культур T75.
7. Инкубировать в инкубаторе с температурой 37 °C, 5%_CO2 до полного слияния.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При работе с колбой будьте осторожны, чтобы не намочить крышку раствором, так как это может стать источником загрязнения. Для получения удобного количества надосадочной жидкости необходимо реплицировать клетки после того, как они покроют всю поверхность колбы с клеточной культурой. Клетки L-929 ингибируются при контакте. Подогрейте раствор трипсина/этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), DMEM/F12-10 и стерильный PBS до 37 °C, чтобы начать экспансию клеточной культуры, как описано в следующих этапах.
8. Как только будет достигнуто полное слияние, выбросьте надосадочную жидкость из колбы для клеточных культур внутри шкафа биобезопасности с ламинарным потоком.
9. Промойте колбу с клеточными культурами 20 мл стерильного PBS с помощью серологической пипетки и выбросьте раствор.
10. Добавьте 10 мл трипсина/ЭДТА (0,05% раствора) в колбу для клеточных культур, содержащую адгезивные клетки.
11. Перенесите колбу с клеточной культурой из ламинарного потока в инкубатор с температурой 37°C и 5%_CO2 и инкубируйте в течение 3 минут.
12. Встряхните колбу с клеточными культурами, чтобы отделить клетки от поверхности колбы для культур, и используйте микроскоп, чтобы убедиться, что все клетки были диссоциированы.
13. Инактивируйте трипсин/ЭДТА (0,05% раствор) 10 мл среды DMEM/F12-10.
14. Перенесите раствор с помощью серологической пипетки в стерильную центрифужную пробирку объемом 50 мл.
15. Центрифугировать при 300 x g при 4 °C в течение 10 минут. Выбросьте надосадочную жидкость.
16. Суспендируйте гранулу в 10 мл среды DMEM/F12-10.
17. Добавьте 1 мл клеточной суспензии в колбу для клеточных культур T175 (культура 1:10).
18. Повторите процедуру, чтобы получить десять колб для клеточных культур T175.
19. Добавьте по 50 мл DMEM/F12-10 в каждую колбу для клеточных культур.
20. Инкубировать в инкубаторе с температурой 37 °C, 5%_CO2 до полного слияния.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти шаги гарантируют 500 мл надосадочной жидкости L-929 клеток. На 5-й день, после того как клетки покроют поверхность колбы клеточной культуры Т175, надосадочная жидкость будет обогащена M-CSF и должна быть собрана¹⁴.
21. Извлеките колбу с клеточными культурами из инкубатора на 5-е сутки после контактного ингибирования.
22. Переложите среду в стерильную центрифужную пробирку объемом 50 мл.
23. Центрифуга при 3 200 x g, при 4 °C в течение 10 мин.
24. Соберите надосадочную жидкость, обогащенную M-CSF, и переложите раствор в стерильную центрифужную пробирку объемом 50 мл. Хранить в морозильной камере при температуре -20 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Центрифугирование чрезвычайно важно для удаления клеток и мусора из надосадочной жидкости.
25. Надосадочная жидкость L-929 является удобным и недорогим источником макрофагального колониестимулирующего фактора (M-CSF) и обычно содержит от 5 до 10 нг/мл M-CSF⁸. Эти надосадочные жидкости также содержат следовые количества других цитокинов и факторов роста, но они не оказывают глубокого влияния на физиологию макрофагов¹⁵. Тем не менее, очищенный M-CSF может быть приобретен и использован в качестве альтернативы надосадочной жидкости L-929 в концентрациях от 1 до 2 нг/^мл8.

2. Удаление бедренной и большеберцовой костей

1. Продолжить эвтаназию 8-недельного самца мыши дикого типа C57BL-6 путем вывиха шейки матки после удушья углекислым газом в соответствии с нормативной резолюцией No 18 Национального совета по экспериментам на животных (Concea) и с одобрения Комитета по этике и использованию животных (CEUA).
2. Смочите мышь в 70% растворе этанола и с помощью стерильных ножниц сделайте разрез на 1 см вдоль живота.
3. Снимайте кожу до тех пор, пока мышцы задних лап полностью не обнажаются.
4. Задние ноги уберите на уровне бедер, стараясь не сломать бедренную и большеберцовую кости.
5. Поместите задние ноги в коническую центрифужную пробирку с 70% раствором этанола.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда используйте мышей, свободных от патогенов. Обязательно собирайте обе ноги, чтобы добиться большего количества клеток. Шаг 2 выполняется в нестерильной среде (настольной). Следовательно, важно аккуратно удалять бедренную и большеберцовую кости, чтобы они оставались неповрежденными, чтобы избежать бактериального загрязнения. Остальные этапы этой процедуры выполняются в ламинарном проточном шкафу биобезопасности. Время воздействия на ноги 70% раствора этанола должно быть ограничено 10 мин. Если время больше, могут быть поражены предшественники костного мозга.

3. Получить предшественников костного мозга из просвета большеберцовой и бедренной костей

1. Извлеките ноги из 70% раствора этанола и переложите их в стерильный PBS.
2. С помощью щипцов и дезинфицирующих салфеток удалите все мышцы и фасции. После этого шага косточка должна быть чистой.
3. Используйте стерильное лезвие хирургического скальпеля, чтобы разрезать костный эпифиз с обоих концов, чтобы обнажить костный мозг.
4. Наполните шприц объемом 20 мл 10 мл стерильного PBS с добавлением 2% раствора пенициллина/стрептомицина и подключите иглу 26 G.
5. Удерживайте кость с помощью анатомических рассекционных щипцов одной рукой, а другой вводите иглу в костную полость. Будьте осторожны, чтобы не раздавить кость щипцами.
6. Промойте внутреннюю часть кости с помощью PBS и соберите костный мозг в стерильную коническую центрифужную пробирку. После этого шага костная полость должна казаться белой.
7. Центрифугируйте собранные клетки в течение 10 мин при 300 x g при 4 °C.
8. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 1 мл DMEM/F12-10.
9. Гомогенизируйте и добавьте еще 9 мл среды DMEM/F12-10, чтобы довести общее количество клеток до 10 мл.

4. Культура макрофагов

1. Добавьте по 1 мл клеток-предшественников в каждую из круглых пластиковых чашек Петри размером 100 мм x 20 мм (всего 10 чашек), распределив клетки по планшетам с помощью пипетки для получения равномерного распределения. Не используйте посуду, обработанную культурой тканей.
2. Добавьте 9 мл DMEM/F12-10 с добавлением 20% надосадочной жидкости L-929 в каждую посуду.
3. Инкубировать в инкубаторе с температурой 37 °C, 5%_CO2 .
4. На^3-й день добавьте в каждую посуду по 10 мл среды DMEM/F12-10 с добавлением 20% надосадочной жидкости клеток L-929. Таким образом, чашки для культур теперь имеют в общей сложности 20 мл питательной среды, достаточную для роста клеток до конца их созревания.
   ПРИМЕЧАНИЯ: Не следует использовать чашки, обработанные тканевыми культурами, потому что макрофаги, как естественные адгезивные клетки, отмеченные сильным взаимодействием с поверхностями, не будут легко диссоциироваться с чашкой позже. Как правило, клеточные предшественники от одной мыши (двух бедренных костей) могут быть высажены в 10 культуральных чашах. Клеточные предшественники превратятся в макрофаги, которые можно использовать с 7 по 10 день инкубации. Подтверждение созревания определяется изменениями морфологии макрофагов. Зрелые макрофаги являются адгезивными и демонстрируют неоднородную морфологию, объясняемую эмиссией псевдоподий в разных направлениях. Примеры этих зрелых клеток показаны в репрезентативных результатах.

5. Сбор макрофагов

1. Откажитесь от надосадочной жидкости из всех блюд культуры.
2. Вымойте каждую чашку для посева 10 мл теплого (37 °C) стерильного Mg²⁺ и Ca²⁺ free PBS.
3. Слейте раствор с каждой посуды.
4. Предварительно подогрейте неферментативный раствор для диссоциации клеток до 37 °C и добавьте по 3 мл в каждую посуду. Инкубировать в течение 10 минут в инкубаторе с температурой 37 °C, 5% CO₂ . Используйте инвертированный микроскоп, чтобы визуализировать, диссоциируют ли макрофаги от культуральных чашек.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Использование пластиковых пластин, обработанных не тканевыми культурами, должно обеспечить легкую диссоциацию клеток и избежать необходимости соскабливать клетки с пластины.
5. Мойте посуду с помощью серологической пипетки с раствором для диссоциации неферментативных клеток снова и снова, выполняя круговые движения, чтобы убедиться, что все макрофаги диссоциированы от чашки.
6. Соберите раствор со всех чашек с культурой вместе в коническую центрифужную пробирку объемом 50 мл.
7. Добавьте 10 мл стерильного предварительно подогретого PBS в пустые формы для культуры и действуйте, как в пункте 5.4. Эта процедура является повторением шага 5.4 и призвана гарантировать сбор всех макрофагов.
8. Центрифуга при 300 x g, 4 °C в течение 10 минут.
9. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу с 1 мл DMEM/F12-10. Медленно и осторожно гомогенизируйте вверх и вниз с помощью пипетки, чтобы не повредить клетки.
10. Приготовьте аликвоту из 10 мкл раствора макрофага, разведенного с 10 мкл Трипана Синего для подсчета клеток с помощью гемоцитометра.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На 7-й день каждое блюдо будет производить примерно 2 x 10⁶ макрофагов. Это означает, что одна мышь может производить примерно 2 x 10⁷ первичных макрофагов при сборе в десять планшетов. Поскольку M-CSF только стимулирует созревание макрофагов, процедура гарантирует популяцию клеток, которая по существу является просто макрофагами и свободна от других загрязняющих лейкоцитов^.

Результаты

Макрофаги – это крупные и сросшиеся клетки с особыми физиологическими характеристиками. Они демонстрируют разнообразие морфологических проявлений в культуре из-за способности прилипать к стеклу и пластику, а их типичная морфология распространения связана с эмиссией цитоплазматиче?...

Обсуждение

Получение популяции макрофагов, полученных из костного мозга, является основным шагом во многих экспериментальных моделях клеточной биологии, особенно когда важно достичь однородной популяции первичных клеток. Как уже упоминалось, клеточные предшественники могут превращаться в мак?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
20-cc syringe	DESCARPACK	SI100S4G	Sterile syringe
26-G needles	BD	497AQDKT7	Sterile needles
50-ml conical centrifuge tube	SARSTEDT	62547254	Plastic conical tubes suitable for centrifugation
70% ethanol solution	EMFAL	490	Ethanol solution for esterilization
Anatomical dissection forceps	3B SCIENTIFIC	W1670	Maintain in sterile beaker containing 70% ethanol solution
C57Bl/6 wild type mouse	Purchased from Biotério Central at Federal University of Minas Gerais	Not applicable	Mice must be specific-pathogen-free, age between 6 and 10 weeks. Mice need be accommodated at least one week earlier for recovering from the stress of transportation
Cell culture flask T175	GREINER	C7481-50EA	T-175 flask, canted neck, surface area 75 cm2, with filter cap, DNase free, RNase free
Cell culture flask T75	GREINER	C7231-120EA	T-75 flask, canted neck, surface area 75 cm2, with filter cap, DNase free, RNase free
Disinfecting or baby Wipes?	CLOROX	Not applicable	It helps cleaning the bone
Distilled Water	GIBCO	15230	Sterile distilled water
DMEM/F12-10	Not applicable	Not applicable	Add 10 mL of Fetal Bovine Serum (FBS) and 1 mL of Penicillin/ Streptomycin (P/S) to DMEM/F12 (q.s.p. 100 mL)
DMEM/F12-10 + supernatant of L-929 cells	Not applicable	Not applicable	Add 20% of supernatant of L929 cells culture on DMEM/F-12-10
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium - F12 (DMEM/F12)	GIBCO	12500096	DMEM: F-12 Medium contains 2.5 mM L-glutamine, 15 mM HEPES, 0.5 mM sodium pyruvate, and 1200 mg/L sodium bicarbonate.Resuspend powder to 1 liter of distilled water and add 3,7 g of sodium bicarbonate. Adjust pH to 7,2 and filter with 0,22 µM. Storage at 2 - 8 °C freezer
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, United States (FBS)	GIBCO	10082147	Enrichment for DMEM-F12
Hemocytometer	SIGMA-ALDRICH	Z359629	Used to count macrophages at microscopy
L-929 cells	SIGMA-ALDRICH	ATCC # CCL-1	L-929 is a lineage of mouse fibroblast cells used as a source of macrophage colony stimulating factor (M-CSF)
Nikon TI eclipse	NIKON	Not applicable	Nikon TI Eclipse is a fluorescence and phase contrast microscope
Non-enzymatic cell dissociation solution	CELLSTRIPER (CORNING)	25-056-CI	Non-enzimatic cell dissociation solution remove macrophages from the plate without damaging them
Non-treated round culture dishes 100 × 20–mm	CORNING	CLS430591	Do not use tissue culture treated petri dishes or any tissue culture treated plate
P3199 Penicillin G Potassium Salt	USBIOLOGICAL	113-98-4	Antibiotics
Penicillin and streptomycin (P/S) solution			Use 0,26 grams of penicillin and 0,40 grams of streptomycin. Mix with 40 mL of sterile PBS. Inside a horizontal laminar flow cabinet, use a 0,22 µM filter and store aliquots of 1.0 mL in 1.5 ml microfuge tubes in the freezer (-20°C)
Phosphate Buffered Saline free from Calcium and Magnesium (PBS)	MEDIATECH	21-040-CM	Sterile
S7975 Streptomycin Sulfate, 650-850U/mg	USBIOLOGICAL	3810-74-0	Antibiotics
Serological pipettes of 10mL or 25 mL	SARSTEDT	861254001	Serological pipettes is used volumes higher than 1 mL
Sodium Bicarbonate	SIGMA-ALDRICH	144-55-8	pH correction for DMEM-F12
Software Nis Elements Viewer	NIKON	Not applicable	NIS-Elements Viewer is a free standalone program to view image files and datasets
Sterile PBS and 2% of P/S solution	LABORCRIN	590338	Add 1 mL of P/S in 40 mL of sterile PBS
Straight iris scissors	KATENA	Not applicable	Maintain in sterile beaker containing 70% ethanol solution
Supernatant of L-929 cells	Not applicable	Not applicable	L-929 is a lineage of mouse fibroblast cells used as a source of macrophage colony stimulating factor (M-CSF). L-929 supernatant was obtain from the protocol
Surgical Scalpel Blade No.24 Stainless Steel	SWANN-MORTON	311	Used for exposing epiphysis from bones
Trypan Blue Solution, 0.4%	GIBCO	15250061	Trypan Blue Solution, 0.4%, is routinely used as a cell stain to assess cell viability using the dye exclusion test
Trypsin/EDTA solution 0,05%	GIBCO	25300-062	Used to dissociate cells from culture bottle
Water for Injection (WFI) for Cell Culture	GIBCO	A12873	Sterile and endotoxin-free water