בידוד ותרבית של מקרופאגים שמקורם במח עצם מעכברים

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הבידוד והתרבית של מקרופאגים שמקורם במח עצם מעכברים.

Abstract

למקרופאגים יש תפקידים משפיעים חשובים בהומאוסטזיס ובדלקת. תאים אלה נמצאים בכל רקמה בגוף ויש להם יכולת חשובה לשנות את הפרופיל שלהם בהתאם לגירויים הקיימים במיקרו-סביבה. ציטוקינים יכולים להשפיע עמוקות על הפיזיולוגיה של המקרופאגים, במיוחד IFN-γ ואינטרלוקין 4, ולייצר סוגי M1 ו-M2 בהתאמה. בגלל הרבגוניות של תאים אלה, ייצור אוכלוסייה של מקרופאגים שמקורם במח עצם יכול להיות צעד בסיסי במודלים ניסיוניים רבים של ביולוגיה של התא. מטרת פרוטוקול זה היא לסייע לחוקרים בבידוד ובתרבית של מקרופאגים שמקורם באבות מח עצם. אבות מח עצם מעכברי C57BL/6 נטולי פתוגן הופכים למקרופאגים עם חשיפה לגורם מגרה מושבת מקרופאגים (M-CSF) אשר, בפרוטוקול זה, מתקבל מהסופרנאטנט של שושלת הפיברובלסטים L-929. לאחר הדגירה, מקרופאגים בוגרים זמינים לשימוש מהיום^ה-7 עד היום^ה-10 . בעל חיים בודד יכול להיות המקור של בערך 2 x 10⁷ מקרופאגים. לכן, זהו פרוטוקול אידיאלי להשגת כמויות גדולות של מקרופאגים ראשוניים באמצעות שיטות בסיסיות של תרבית תאים.

Introduction

מונוציטים ומקרופאגים הם פאגוציטים חד-גרעיניים שניתן להפיק מאבות במוח העצם. מחקרים אחרונים דיווחו כי מקורם של מקרופאגים גם באבות אריתרו-מיאלואידים שמקורם בשק חלמון¹. ללא קשר לגזירה שלהם, לויקוציטים אלה יש פונקציות השפעה חשובות בהומאוסטזיס ודלקת ^2,3. מונוציטים הם תאים מדם היקפי שיכולים להתמיין עוד יותר למקרופאגים ברקמה ^2,4, ואילו מקרופאגים הם תאים הטרוגניים המציגים פנוטיפים ותפקודים המווסתים על ידי חשיפה מקומית של גורמי גדילה וציטוקינים⁵. מאחר שהמקרופאגים מראים מגוון תפקודי כזה, הם נחקרו במודלים רבים של מחלות. כך הפכה תרבית המקרופאגים לכלי חשוב להבנת הפיזיולוגיה שלהם ותפקידם במחלות שונות. מח העצם הוא מקור חשוב לתאי אב, כולל אבות מקרופאגים, שניתן לבודד ולהכפיל, מה שמגדיל באופן אקספוננציאלי את מספר המקרופאגים המתקבלים. בנוסף, מקרופאגים שמקורם במח עצם חשובים במיוחד כדי למנוע את ההשפעות הנוצרות על ידי מיקרו-סביבה של רקמות, שכן מקרופאגים משנים את הפנוטיפ שלהם בתגובה לגירויים שונים ברקמות ^6,7. אבות מח עצם הופכים למקרופאגים עם חשיפה לגורם מגרה מושבת מקרופאגים (M-CSF)⁸. לא ניתן להבדיל בין מקרופאגים שמקורם במח עצם לבין מקרופאגים שמקורם במונוציטים על ידי סמנים ביוכימיים ברקמות. תאים אלה מייצגים אוכלוסייה הומוגנית מאוד של תאים ראשוניים, שבמובנים רבים אחרים דומים למקרופאגים פריטוניאליים ^6,9.

בגלל מערך התפקודים התאיים ההטרוגניים שלהם, מקרופאגים נחקרו זה מכבר ביסודיות על ידי חוקרים. תאים אלה יכולים לשמש במודלים ניסיוניים שונים, כולל מחלות זיהומיות ודלקתיות, כפי שהם מופיעים בתהליכים אלה^10,11. הם יכולים גם להיות שימושיים לחקר קיטוב המקרופאגים בתגובה לגירויים מיקרו-סביבתיים שונים^12,13. לפיכך, פרוטוקול פשוט ואמין מסופק כאן לצורך קבלת מספר גבוה של מקרופאגים ראשוניים ממח עצם עכבר.

Protocol

פרוטוקול זה בוצע בהתאם למועצה הלאומית לפיקוח על ניסויים בבעלי חיים (Concea) ובאישור ועדת האתיקה והשימוש בבעלי חיים (CEUA). עכברי C57BL/6 נרכשו מחברת Biotério Central של האוניברסיטה הפדרלית של מינאס ז'ראיס (UFMG), בלו הוריזונטה, ברזיל. יש להשתמש בציוד מגן אישי (PPE) כגון מעילי מעבדה, כפפות והגנה על העיניים בכל השלבים המתוארים בפרוטוקול זה.

1. הכנת פיברובלסט L-929 שושלת סופרנאטנט כמקור ל-M-CSF

1. הפשיר תאי שושלת פיברובלסטים L-929 (American Type Culture Collection Certified Cell Line-ATCC CCL1) והתחל את תהליך התרבית באופן מיידי כדי לשמר את הכדאיות.
2. בארון בטיחות ביולוגית של זרימה למינרית, באמצעות פיפטה של 1,000 מיקרוליטר, מעבירים את תאי השושלת הפיברובלסטית L-929 מהבקבוקון לצינור צנטריפוגה סטרילי בנפח 50 מ"ל.
3. השתמש פיפטה סרולוגית כדי להוסיף 50 מ"ל של מלוחים סטריליים חוצצים פוספט (PBS), ללא סידן ומגנזיום.
4. צנטריפוגה ב 300 x גרם, 4 ° C למשך 10 דקות. השליכו את הסופרנטנט.
5. יש להשהות מחדש את הגלולה ב-20 מ"ל של Dulbecco′s Medium-F12 בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי (FBS) ו-1 מ"ל פניצילין/סטרפטומיצין (P/S) (DMEM/F12-10) באמצעות פיפטה סרולוגית.
6. העבר את התאים המרחפים מחדש לצלוחית תרבית תאים T75.
7. יש לדגור באינקובטור של 37°C, 5% CO₂ עד למפגש מלא.
   הערה: בעת מניפולציה של הצלוחית, היזהר להימנע מהרטבת הכיסוי בתמיסה, מכיוון שזה יכול להיות מקור לזיהום. כדי להשיג כמות נוחה של supernatant, יש צורך לשכפל את התאים לאחר שהם מכסים את פני השטח המלא של בקבוק תרבית התא. תאי L-929 מעוכבים על ידי מגע. תמיסת טריפסין/אתילאנדיאמין טטראצטית חמה (EDTA), DMEM/F12-10 ו-PBS סטרילי עד 37°C כדי להתחיל את הרחבת תרבית התא, כמתואר בשלבים הבאים.
8. ברגע שמגיעים למפגש מלא, השליכו את הסופרנאטנט מבקבוק תרבית התא, בתוך ארון הבטיחות הביולוגית של הזרימה הלמינרית.
9. לשטוף את בקבוק תרבית התא עם 20 מ"ל של PBS סטרילי באמצעות פיפטה סרולוגית ולהשליך את התמיסה.
10. הוסף 10 מ"ל של טריפסין/EDTA (0.05% תמיסה) לבקבוק תרבית התאים המכיל את התאים המודבקים.
11. מעבירים את בקבוק תרבית התאים מזרימה למינרית לאינקובטור_CO2 של 37°C, 5% CO ודוגרים למשך 3 דקות.
12. נערו את בקבוק תרבית התאים כדי לנתק את התאים מפני השטח של בקבוק התרבית והשתמשו במיקרוסקופ כדי לוודא שכל התאים נותקו.
13. נטרל את פעולת הטריפסין/EDTA (תמיסת 0.05%) עם 10 מ"ל של מדיום DMEM/F12-10.
14. מעבירים את התמיסה באמצעות פיפטה סרולוגית לצינור צנטריפוגה סטרילי בנפח 50 מ"ל.
15. צנטריפוגה ב 300 x גרם ב 4 ° C במשך 10 דקות. השליכו את הסופרנטנט.
16. להשהות את הגלולה ב 10 מ"ל של DMEM / F12-10 בינוני.
17. הוסף 1 מ"ל של תרחיף התא לבקבוק תרבית תאים T175 (תרבית 1:10).
18. חזור על ההליך כדי להשיג עשר צלוחיות תרבית תאים T175.
19. הוסף 50 מ"ל של DMEM/F12-10 לכל בקבוק תרבית תאים.
20. יש לדגור באינקובטור של 37°C, 5% CO₂ עד למפגש מלא.
    הערה: שלבים אלה מבטיחים 500 מ"ל של תא L-929 supernatant. ביום 5, לאחר שהתאים כיסו את משטח הבקבוק של תרבית תאי T175, הסופרנאטנט יועשר עבור M-CSF ויש לאסוף אותו¹⁴.
21. הסר את בקבוק תרבית התאים מהאינקובטור ביום 5 לאחר עיכוב מגע.
22. מעבירים את המדיום לצינור צנטריפוגה סטרילי בנפח 50 מ"ל.
23. צנטריפוגה ב-3,200 x גרם, ב-4°C למשך 10 דקות.
24. אוספים את הסופרנאטנט המועשר ב-M-CSF ומעבירים את התמיסה לצינור צנטריפוגה סטרילי בנפח 50 מ"ל. יש לאחסן במקפיא בטמפרטורה של -20°C.
    הערה: צנטריפוגה חשובה ביותר לסילוק תאים ופסולת מהסופרנאטנטים.
25. סופרנאטנט L-929 הוא מקור נוח וזול לגורם מגרה מושבת מקרופאגים (M-CSF) ובדרך כלל מכיל 5 עד 10 ננוגרם/מ"ל של M-CSF⁸. סופרנאטנטים אלה מכילים גם כמויות זעירות של ציטוקינים אחרים וגורמי גדילה, אך אין להם השפעה עמוקה על הפיזיולוגיה של המקרופאגים¹⁵. עם זאת, ניתן לרכוש M-CSF מטוהר ולהשתמש בו כחלופה לסופרנאטנטים L-929 בריכוזים של 1 עד 2 ננוגרם/מ"ל⁸.

2. הסרת עצם הירך והטיביה

1. המשך עם המתת חסד של עכבר זכר מסוג C57BL-6 בן 8 שבועות על ידי פריקת צוואר הרחם לאחר חנק פחמן דו חמצני, בהתאם להחלטה נורמטיבית מספר 18 של המועצה הלאומית לניסויים בבעלי חיים (Concea) ובאישור ועדת האתיקה והשימוש בבעלי חיים (CEUA).
2. השרו את העכבר בתמיסת אתנול 70% והשתמשו במספריים סטריליים כדי לבצע חתך של 1 ס"מ לאורך הבטן.
3. יש להסיר את העור עד לחשיפה מלאה של שריר הרגליים האחוריות.
4. הסר את הרגליים האחוריות בגובה הירך, נזהר לא לשבור את עצם הירך ואת השוקה.
5. שים את הרגליים האחוריות בצינור צנטריפוגה חרוטי עם תמיסת אתנול 70%.
   הערה: השתמש תמיד בעכברים ללא פתוגנים. הקפד לאסוף את שתי הרגליים כדי להשיג מספר גדול יותר של תאים. שלב 2 מבוצע בסביבה לא סטרילית (benchtop). לכן, חשוב להסיר את עצם הירך ואת השוקה בזהירות כך שהם יישארו שלמים כדי למנוע זיהום חיידקי. השלבים הנותרים של הליך זה מתבצעים בארון בטיחות ביולוגית זרימה למינרית. זמן החשיפה של הרגליים לתמיסת אתנול 70% צריך להיות מוגבל ל -10 דקות. אם הזמן ארוך יותר, אבות מח עצם יכולים להיות מושפעים.

3. להשיג אבות מח עצם מן לומן של השוקה ואת עצם הירך

1. הסר את הרגליים מתמיסת אתנול 70% והעבר אותן ל- PBS סטרילי.
2. שימוש במלקחיים ומגבוני חיטוי להסרת כל השרירים והפאשיה. העצם צריכה להיות נקייה לאחר שלב זה.
3. השתמש בלהב אזמל כירורגי סטרילי כדי לחתוך את אפיפיזה העצם בשני הקצוות כדי לחשוף את מח העצם.
4. מלאו מזרק 20 מ"ל ב-10 מ"ל PBS סטרילי בתוספת תמיסת 2% פניצילין/סטרפטומיצין וחברו מחט 26 גרם.
5. החזיקו את העצם באמצעות מלקחיים אנטומיים ביד אחת, והשתמשו ביד השנייה כדי להחדיר את המחט לחלל העצם. היזהר לא למחוץ את העצם עם המלקחיים.
6. שטפו את החלק הפנימי של העצם עם PBS ואספו את מח העצם בצינור צנטריפוגה חרוטי סטרילי. לאחר שלב זה, חלל העצם צריך להיראות לבן.
7. צנטריפוגה את התאים שנאספו במשך 10 דקות ב 300 x גרם ב 4 ° C.
8. השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את גלולת התא ב-1 מ"ל של DMEM/F12-10.
9. הומוגניזציה ולהוסיף עוד 9 מ"ל של מדיום DMEM/F12-10 כדי להביא את התאים עד סך של 10 מ"ל.

4. תרבות מקרופאגים

1. הוסף 1 מ"ל של אבות התא לכל אחד מכלי פטרי פלסטיק עגולים בגודל 100 מ"מ x 20 מ"מ (סה"כ 10 כלים), ופיזר את התאים על פני הצלחות עם פיפטה כדי לקבל פיזור אחיד. אין להשתמש במנות שטופלו בתרבית רקמות.
2. הוסף 9 מ"ל של DMEM/F12-10 בתוספת 20% של תא L-929 supernatant לכל מנה.
3. דגירה באינקובטור 37°C, 5% CO₂ .
4. ביום^השלישי , יש להוסיף 10 מ"ל של מדיום DMEM/F12-10 בתוספת 20% מהסופרנאטנט של תאי L-929 לכל מנה. בדרך זו, לצלחות התרבית יש כעת סך של 20 מ"ל של מדיום תרבית, מספיק לצמיחת התאים עד סוף הבשלתם.
   הערות: אין להשתמש במנות שטופלו בתרבית רקמה מכיוון שמקרופאגים, כתאי דבק טבעיים המסומנים באינטראקציות חזקות עם משטחים, לא יתנתקו בקלות מהתבשיל מאוחר יותר. בדרך כלל, ניתן לזרוע אבות תאים מעכבר אחד (שתי עצמות הירך) ב-10 צלחות תרבית. אבות התא יהפכו למקרופאגים, בהם ניתן להשתמש מיום הדגירה 7 עד 10. אישור ההתבגרות מזוהה על ידי שינויים במורפולוגיה של המקרופאגים. מקרופאגים בוגרים דבקים ומראים מורפולוגיה הטרוגנית, המוסברת על ידי פליטת פסאודופודיה לכיוונים שונים. דוגמאות לתאים בוגרים אלה מוצגות בתוצאות המייצגות.

5. קצירת מקרופאגים

1. השליכו את הסופרנאטנטים מכל מנות התרבות.
2. לשטוף כל צלחת תרבית עם 10 מ"ל של חם (37 ° C) סטרילי Mg²⁺ ו Ca²⁺ PBS חינם.
3. השליכו את התמיסה מכל מנה.
4. תמיסת דיסוציאציה של תאים לא אנזימטיים מחממים מראש ל-37°C ומוסיפים 3 מ"ל לכל מנה. יש לדגור במשך 10 דקות באינקובטור של 37°C, 5% CO₂ . השתמשו במיקרוסקופ הפוך כדי לדמיין אם המקרופאגים מתנתקים מכלי התרבית.
   הערה: השימוש בצלחות פלסטיק שאינן מטופלות בתרבית רקמה אמור לאפשר דיסוציאציה קלה של תאים ולהימנע מהצורך לגרד את התאים מהצלחת.
5. שטפו את הכלים באמצעות פיפטה סרולוגית עם תמיסת הדיסוציאציה התאית הלא אנזימטית שוב ושוב, תוך ביצוע תנועות מעגליות כדי לאשר שכל המקרופאגים מנותקים מהמנה.
6. אוספים את התמיסה של כל מנות התרבות יחד לצינור צנטריפוגה חרוטי של 50 מ"ל.
7. הוסיפו 10 מ"ל של PBS סטרילי שחומם מראש לצלחות התרבית הריקות והמשיכו כמו בשלב 5.4. הליך זה הוא חזרה על שלב 5.4 ומתכוון להבטיח שכל המקרופאגים נאספים.
8. צנטריפוגה ב 300 x גרם, 4 ° C למשך 10 דקות.
9. השליכו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את הגלולה עם 1 מ"ל DMEM/F12-10. הומוגניזציה לאט ובזהירות למעלה ולמטה באמצעות פיפטה כדי למנוע נזק לתאים.
10. הכינו aliquot של 10 μL של תמיסת מקרופאגים מדוללים עם 10 μL של Trypan Blue כדי לספור את התאים באמצעות המוציטומטר.
    הערה: ביום 7, כל מנה תפיק בערך 2 x 10⁶ מקרופאגים. משמעות הדבר היא כי עכבר אחד יכול לייצר בערך 2 x 10⁷ מקרופאגים ראשוניים כאשר נקצר בעשר צלחות. מכיוון ש-M-CSF מניע רק את הבשלת המקרופאגים, ההליך מבטיח אוכלוסיית תאים שהיא למעשה רק מקרופאגים וללא לויקוציטים מזהמים אחרים¹⁶.

תוצאות

מקרופאגים הם תאים גדולים ודבקים בעלי מאפיינים פיזיולוגיים מיוחדים. הם מראים מגוון של מצגות מורפולוגיות בתרבית בגלל היכולת להיצמד לזכוכית ולפלסטיק, והמורפולוגיה המתפשטת האופיינית שלהם קשורה לפליטה של שלוחות ציטופלזמיות (איור 1). ברגע שאבות מח העצם נחשפים ל-M-CSF מסופרנאטנט ?...

Discussion

יצירת אוכלוסייה של מקרופאגים שמקורם במח עצם היא צעד בסיסי במודלים ניסיוניים רבים של ביולוגיה של התא, במיוחד כאשר חשוב להשיג אוכלוסייה הומוגנית של תאים ראשוניים. כאמור, אבות התא יכולים להפוך למקרופאגים רק בנוכחות M-CSF. סופרנאטנטים של תאי L-929 יכולים לשמש כמקור העיקרי של M-CSF. מלבד העלות, אין בע?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
20-cc syringe	DESCARPACK	SI100S4G	Sterile syringe
26-G needles	BD	497AQDKT7	Sterile needles
50-ml conical centrifuge tube	SARSTEDT	62547254	Plastic conical tubes suitable for centrifugation
70% ethanol solution	EMFAL	490	Ethanol solution for esterilization
Anatomical dissection forceps	3B SCIENTIFIC	W1670	Maintain in sterile beaker containing 70% ethanol solution
C57Bl/6 wild type mouse	Purchased from Biotério Central at Federal University of Minas Gerais	Not applicable	Mice must be specific-pathogen-free, age between 6 and 10 weeks. Mice need be accommodated at least one week earlier for recovering from the stress of transportation
Cell culture flask T175	GREINER	C7481-50EA	T-175 flask, canted neck, surface area 75 cm2, with filter cap, DNase free, RNase free
Cell culture flask T75	GREINER	C7231-120EA	T-75 flask, canted neck, surface area 75 cm2, with filter cap, DNase free, RNase free
Disinfecting or baby Wipes?	CLOROX	Not applicable	It helps cleaning the bone
Distilled Water	GIBCO	15230	Sterile distilled water
DMEM/F12-10	Not applicable	Not applicable	Add 10 mL of Fetal Bovine Serum (FBS) and 1 mL of Penicillin/ Streptomycin (P/S) to DMEM/F12 (q.s.p. 100 mL)
DMEM/F12-10 + supernatant of L-929 cells	Not applicable	Not applicable	Add 20% of supernatant of L929 cells culture on DMEM/F-12-10
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium - F12 (DMEM/F12)	GIBCO	12500096	DMEM: F-12 Medium contains 2.5 mM L-glutamine, 15 mM HEPES, 0.5 mM sodium pyruvate, and 1200 mg/L sodium bicarbonate.Resuspend powder to 1 liter of distilled water and add 3,7 g of sodium bicarbonate. Adjust pH to 7,2 and filter with 0,22 µM. Storage at 2 - 8 °C freezer
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, United States (FBS)	GIBCO	10082147	Enrichment for DMEM-F12
Hemocytometer	SIGMA-ALDRICH	Z359629	Used to count macrophages at microscopy
L-929 cells	SIGMA-ALDRICH	ATCC # CCL-1	L-929 is a lineage of mouse fibroblast cells used as a source of macrophage colony stimulating factor (M-CSF)
Nikon TI eclipse	NIKON	Not applicable	Nikon TI Eclipse is a fluorescence and phase contrast microscope
Non-enzymatic cell dissociation solution	CELLSTRIPER (CORNING)	25-056-CI	Non-enzimatic cell dissociation solution remove macrophages from the plate without damaging them
Non-treated round culture dishes 100 × 20–mm	CORNING	CLS430591	Do not use tissue culture treated petri dishes or any tissue culture treated plate
P3199 Penicillin G Potassium Salt	USBIOLOGICAL	113-98-4	Antibiotics
Penicillin and streptomycin (P/S) solution			Use 0,26 grams of penicillin and 0,40 grams of streptomycin. Mix with 40 mL of sterile PBS. Inside a horizontal laminar flow cabinet, use a 0,22 µM filter and store aliquots of 1.0 mL in 1.5 ml microfuge tubes in the freezer (-20°C)
Phosphate Buffered Saline free from Calcium and Magnesium (PBS)	MEDIATECH	21-040-CM	Sterile
S7975 Streptomycin Sulfate, 650-850U/mg	USBIOLOGICAL	3810-74-0	Antibiotics
Serological pipettes of 10mL or 25 mL	SARSTEDT	861254001	Serological pipettes is used volumes higher than 1 mL
Sodium Bicarbonate	SIGMA-ALDRICH	144-55-8	pH correction for DMEM-F12
Software Nis Elements Viewer	NIKON	Not applicable	NIS-Elements Viewer is a free standalone program to view image files and datasets
Sterile PBS and 2% of P/S solution	LABORCRIN	590338	Add 1 mL of P/S in 40 mL of sterile PBS
Straight iris scissors	KATENA	Not applicable	Maintain in sterile beaker containing 70% ethanol solution
Supernatant of L-929 cells	Not applicable	Not applicable	L-929 is a lineage of mouse fibroblast cells used as a source of macrophage colony stimulating factor (M-CSF). L-929 supernatant was obtain from the protocol
Surgical Scalpel Blade No.24 Stainless Steel	SWANN-MORTON	311	Used for exposing epiphysis from bones
Trypan Blue Solution, 0.4%	GIBCO	15250061	Trypan Blue Solution, 0.4%, is routinely used as a cell stain to assess cell viability using the dye exclusion test
Trypsin/EDTA solution 0,05%	GIBCO	25300-062	Used to dissociate cells from culture bottle
Water for Injection (WFI) for Cell Culture	GIBCO	A12873	Sterile and endotoxin-free water