Farelerden Kemik İliği Kaynaklı Makrofajların İzolasyonu ve Kültürü

Özet

Bu protokol, farelerden kemik iliği kaynaklı makrofajların izolasyonunu ve kültürünü açıklamaktadır.

Özet

Makrofajlar homeostaz ve inflamasyonda önemli efektör fonksiyonlara sahiptir. Bu hücreler vücuttaki her dokuda bulunur ve mikro çevrede bulunan uyaranlara göre profillerini değiştirme konusunda önemli bir yeteneğe sahiptir. Sitokinler, makrofaj fizyolojisini, özellikle IFN-γ ve interlökin 4'ü derinden etkileyerek sırasıyla M1 ve M2 tiplerini oluşturabilir. Bu hücrelerin çok yönlülüğü nedeniyle, kemik iliği türevli makrofaj popülasyonunun üretimi, hücre biyolojisinin birçok deneysel modelinde temel bir adım olabilir. Bu protokolün amacı, kemik iliği progenitörlerinden türetilen makrofajların izolasyonu ve kültüründe araştırmacılara yardımcı olmaktır. Patojen içermeyen C57BL / 6 farelerinden elde edilen kemik iliği progenitörleri, bu protokolde murin fibroblast soyunun L-929'un süpernatantından elde edilen makrofaj koloni uyarıcı faktöre (M-CSF) maruz kaldıklarında makrofajlara dönüştürülür. İnkübasyondan sonra, olgun makrofajlar 7. günden 10^{. güne kadar kullanılabilir}. Tek bir hayvan yaklaşık 2 x 10⁷ makrofajın kaynağı olabilir. Bu nedenle, temel hücre kültürü yöntemlerini kullanarak büyük miktarlarda primer makrofaj elde etmek için ideal bir protokoldür.

Giriş

Monositler ve makrofajlar, kemik iliğindeki progenitörlerden türetilebilen mononükleer fagositlerdir. Son yıllarda yapılan çalışmalarda makrofajların yolk kesesi kaynaklı eritromiyeloid progenitörlerden de köken aldığı bildirilmiştir¹. Türevlerinden bağımsız olarak, bu lökositlerin homeostaz ve inflamasyonda önemli efektör işlevleri vardır ^2,3. Monositler, dokuda makrofajlara daha fazla farklılaşabilen periferik kandan^alınan hücrelerdir ^2,4, makrofajlar ise büyüme faktörlerinin ve sitokinlerin⁵ lokal maruziyeti ile düzenlenen fenotipler ve işlevler sergileyen heterojen hücrelerdir. Makrofajlar bu tür fonksiyonel çeşitlilik gösterdikleri için birçok hastalık modelinde incelenmiştir. Bu nedenle, makrofajların in vitro kültürü, fizyolojilerini ve farklı hastalıklardaki rollerini anlamak için önemli bir araç haline gelmiştir. Kemik iliği, elde edilen makrofaj sayısını katlanarak artıran, izole edilebilen ve çoğaltılabilen makrofaj progenitörleri de dahil olmak üzere önemli bir progenitör hücre kaynağıdır. Ek olarak, kemik iliği kaynaklı makrofajlar, doku mikroçevresi tarafından oluşturulan etkilerden kaçınmak için özellikle önemlidir, çünkü makrofajlar dokulardaki farklı uyaranlara yanıt olarak fenotiplerini değiştirir ^6,7. Kemik iliği progenitörleri, makrofaj koloni uyarıcı faktöre (M-CSF) maruz kaldıklarında makrofajlara ^dönüşür8. Kemik iliği kaynaklı makrofajlar, dokudaki biyokimyasal belirteçler ile monosit kaynaklı makrofajlardan ayırt edilemez. Bu hücreler, diğer birçok açıdan peritoneal makrofajlarla^{karşılaştırılabilir} olan, oldukça homojen bir birincil hücre popülasyonunu temsil eder ^6,9.

Heterojen hücresel fonksiyonları nedeniyle, makrofajlar uzun zamandır araştırmacılar tarafından kapsamlı bir şekilde incelenmiştir. Bu hücreler, bu süreçlerde yer aldıkları için bulaşıcı ve enflamatuar hastalıklar da dahil olmak üzere farklı deneysel modellerde kullanılabilir^10,11. Çeşitli mikro-çevresel uyaranlara yanıt olarak makrofaj polarizasyonunu araştırmak için de yararlı olabilirler ^12,13. Bu nedenle, fare kemik iliğinden yüksek sayıda primer makrofaj elde etmek amacıyla burada basit ve güvenilir bir protokol sağlanmaktadır.

Protokol

Bu protokol, Hayvan Deneylerinin Kontrolü Ulusal Konseyi'ne (Concea) uygun olarak ve Hayvanların Etik ve Kullanımı Komitesi'nin (CEUA) onayı ile gerçekleştirilmiştir. C57BL/6 fareleri, Brezilya'nın Belo Horizonte kentindeki Minas Gerais Federal Üniversitesi'nin (UFMG) Biotério Central'ından satın alındı. Laboratuvar önlükleri, eldivenler ve göz koruması gibi kişisel koruyucu ekipman (KKD) bu protokolde açıklanan tüm adımlarda kullanılmalıdır.

1. M-CSF kaynağı olarak fibroblast L-929 soy süpernatantının hazırlanması

1. L-929 fibroblast soy hücrelerinin (Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu Sertifikalı Hücre Hattı-ATCC CCL1) defrostunu çözün ve canlılığı korumak için kültür işlemine hemen başlayın.
2. Laminer akışlı bir biyogüvenlik kabininde, 1.000 μL'lik bir pipet kullanarak, L-929 fibroblast soy hücrelerini flakondan 50 mL'lik bir steril santrifüj tüpüne aktarın.
3. Kalsiyum ve magnezyum içermeyen 50 mL steril fosfat tamponlu salin (PBS) eklemek için serolojik bir pipet kullanın.
4. 300 x g'da, 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
5. Pelet, serolojik bir pipet kullanarak% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve 1 mL penisilin / streptomisin (P / S) (DMEM / F12-10) ile desteklenmiş Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle'ın orta-F12'sinin 20 mL'sinde yeniden süspanse edin.
6. Yeniden süspanse edilmiş hücreleri bir T75 hücre kültürü şişesine aktarın.
7. 37 °C,% 5 CO₂ inkübatörde tam birleşene kadar inkübe edin.
   NOT: Şişeyi manipüle ederken, bir kontaminasyon kaynağı olabileceğinden, kapağı solüsyonla ıslatmaktan kaçınmaya dikkat edin. Uygun miktarda süpernatan elde etmek için, hücrelerin hücre kültürü şişesinin tüm yüzeyini kapladıktan sonra çoğaltılması gerekir. L-929 hücreleri temas ile inhibe edilir. Aşağıdaki adımlarda açıklandığı gibi hücre kültürü genişlemesini başlatmak için tripsin/etilendiamintetraasetik asit (EDTA) çözeltisi, DMEM/F12-10 ve steril PBS'yi 37 °C'ye ısıtın.
8. Tam birleşmeye ulaşıldığında, süpernatanı laminer akış biyogüvenlik kabininin içindeki hücre kültürü şişesinden atın.
9. Hücre kültürü şişesini serolojik bir pipet kullanarak 20 mL steril PBS ile yıkayın ve çözeltiyi atın.
10. Yapışan hücreleri içeren hücre kültürü şişesine 10 mL tripsin / EDTA (% 0.05 çözelti) ekleyin.
11. Hücre kültürü şişesini laminer akıştan 37 ° C,% 5 CO₂ inkübatöre aktarın ve 3 dakika inkübe edin.
12. Hücreleri kültür şişesinin yüzeyinden ayırmak için hücre kültürü şişesini sallayın ve tüm hücrelerin ayrıştığından emin olmak için bir mikroskop kullanın.
13. Tripsin / EDTA'yı (% 0.05 çözelti) 10 mL DMEM / F12-10 ortamı ile etkisiz hale getirin.
14. Çözeltiyi serolojik bir pipet kullanarak 50 mL'lik bir steril santrifüj tüpüne aktarın.
15. 300 x g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
16. Peletleri 10 mL DMEM / F12-10 ortamında yeniden süspanse edin.
17. Bir T175 hücre kültürü şişesine (1:10 kültür) 1 mL hücre süspansiyonu ekleyin.
18. On adet T175 hücre kültürü şişesi elde etmek için prosedürü tekrarlayın.
19. Her hücre kültürü şişesine 50 mL DMEM / F12-10 ekleyin.
20. 37 °C,% 5 CO₂ inkübatörde tam birleşene kadar inkübe edin.
    NOT: Bu adımlar 500 mL L-929 hücre süpernatantını garanti eder. 5. günde, hücreler T175 hücre kültürü şişesi yüzeyini kapladıktan sonra, süpernatant M-CSF için zenginleştirilecek ve toplanmalıdır¹⁴.
21. Temas inhibisyonundan sonraki 5. günde hücre kültürü şişesini inkübatörden çıkarın.
22. Ortamı 50 mL'lik bir steril santrifüj tüpüne aktarın.
23. 3.200 x g'da, 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin.
24. M-CSF ile zenginleştirilmiş süpernatanı toplayın ve çözeltiyi 50 mL'lik bir steril santrifüj tüpüne aktarın. Dondurucuda -20 °C'de saklayın.
    NOT: Santrifüjleme, süpernatantlardan hücreleri ve kalıntıları uzaklaştırmak için son derece önemlidir.
25. L-929 süpernatant, uygun ve ucuz bir makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) kaynağıdır ve tipik olarak 5 ila 10 ng / mL M-CSF⁸ içerir. Bu süpernatanlar ayrıca eser miktarda diğer sitokinler ve büyüme faktörleri içerir, ancak makrofaj fizyolojisi üzerinde derin bir etki yapmazlar¹⁵. Bununla birlikte, saflaştırılmış M-CSF satın alınabilir ve 1 ila 2 ng/mL⁸ konsantrasyonlarında L-929 süpernatantlarına alternatif olarak kullanılabilir.

2. Femur ve tibianın çıkarılması

1. Ulusal Hayvan Deneyleri Konseyi'nin (Concea) 18 numaralı normatif kararına uygun olarak ve Hayvanların Etik ve Kullanımı Komitesi'nin (CEUA) onayı ile karbondioksit boğulmasından sonra servikal çıkık yoluyla 8 haftalık, C57BL-6 vahşi tip erkek fare ötenazisi ile devam edin.
2. Fareyi% 70 etanol çözeltisi ile ıslatın ve karın boyunca 1 cm'lik bir kesi yapmak için steril makas kullanın.
3. Arka bacakların kası tamamen açığa çıkana kadar cildi çıkarın.
4. Femur ve kaval kemiğini kırmamaya dikkat ederek arka bacakları kalça yüksekliğinde çıkarın.
5. Arka bacakları% 70 etanol çözeltisi içeren konik bir santrifüj tüpüne koyun.
   NOT: Daima patojen içermeyen fareler kullanın. Daha fazla sayıda hücre elde etmek için her iki bacağınızı da topladığınızdan emin olun. Adım 2, steril olmayan bir ortamda (tezgah üstü) gerçekleştirilir. Bu nedenle, bakteriyel kontaminasyonu önlemek için uyluk kemiği ve kaval kemiğinin sağlam kalması için dikkatli bir şekilde çıkarılması önemlidir. Bu prosedürün geri kalan adımları, laminer akışlı bir biyogüvenlik kabininde gerçekleştirilir. Bacakların% 70 etanol çözeltisine maruz kalma süresi 10 dakika ile sınırlandırılmalıdır. Süre uzarsa, kemik iliği progenitörleri etkilenebilir.

3. Tibia ve uyluk kemiğinin lümeninden kemik iliği progenitörleri elde edin

1. Bacakları% 70 etanol çözeltisinden çıkarın ve steril PBS'ye aktarın.
2. Tüm kas ve fasyayı çıkarmak için forseps ve dezenfektan mendil kullanmak. Bu adımdan sonra kemiğin temiz olması gerekir.
3. Kemik iliğini ortaya çıkarmak için her iki uçtaki kemik epifizini kesmek için steril bir cerrahi neşter bıçağı kullanın.
4. 20 mL'lik bir şırıngayı% 2 penisilin / streptomisin çözeltisi ile desteklenmiş 10 mL steril PBS ile doldurun ve 26 G'lik bir iğne bağlayın.
5. Bir elinizle anatomik diseksiyon forsepsleri kullanarak kemiği tutun ve diğer elinizle iğneyi kemik boşluğuna sokmak için kullanın. Forseps ile kemiği ezmemeye dikkat edin.
6. Kemiğin içini PBS ile yıkayın ve kemik iliğini steril bir konik santrifüj tüpünde toplayın. Bu adımdan sonra kemik boşluğu beyaz görünmelidir.
7. Toplanan hücreleri 4 ° C'de 300 x g'de 10 dakika santrifüjleyin.
8. Süpernatanı atın ve hücre peletini 1 mL DMEM / F12-10 içinde yeniden süspanse edin.
9. Hücreleri toplam 10 mL'ye çıkarmak için homojenize edin ve 9 mL daha DMEM / F12-10 ortamı ekleyin.

4. Makrofaj kültürü

1. 100 mm x 20 mm'lik yuvarlak plastik Petri kaplarının her birine (toplam 10 tabak) 1 mL hücre progenitörleri ekleyin ve homojen bir dağılım elde etmek için hücreleri bir pipetle plakalara yayın. Doku kültürü uygulanmış tabakları kullanmayın.
2. Her yemeğe %20 L-929 hücre süpernatanı ile takviye edilmiş 9 mL DMEM / F12-10 ekleyin.
3. 37 °C,% 5 CO₂ inkübatörde inkübe edin.
4. 3^{. günde} , her yemeğe L-929 hücrelerinin süpernatanının% 20'si ile takviye edilmiş 10 mL DMEM / F12-10 ortamı ekleyin. Bu şekilde, kültür kapları artık olgunlaşmalarının sonuna kadar hücrelerin büyümesi için yeterli olan toplam 20 mL kültür ortamına sahiptir.
   NOTLAR: Doku kültürü ile muamele edilmiş kaplar kullanılmamalıdır, çünkü yüzeylerle güçlü etkileşimlerle işaretlenmiş doğal yapışkan hücreler olan makrofajlar daha sonra tabaktan kolayca ayrılmayacaktır. Genellikle, bir fareden (iki uyluk kemiği) alınan hücre progenitörleri 10 kültür kabına tohumlanabilir. Hücre progenitörleri, kuluçka günü 7'den 10'a kadar kullanılabilen makrofajlara dönüşecektir. Olgunlaşma onayı, makrofajların morfolojisindeki değişikliklerle tanımlanır. Olgun makrofajlar yapışıktır ve farklı yönlerde psödopodia emisyonu ile açıklanan heterojen morfoloji gösterir. Bu olgun hücrelerin örnekleri temsili sonuçlarda gösterilmiştir.

5. Makrofajların toplanması

1. Süpernatanları tüm kültür kaplarından atın.
2. Her kültür kabını 10 mL ılık (37 °C) steril Mg²⁺ ve Ca²⁺ serbest PBS ile yıkayın.
3. Çözeltiyi her tabaktan atın.
4. Enzimatik olmayan hücre ayrışma solüsyonunu 37 °C'ye ısıtın ve her yemeğe 3 mL ekleyin. 37 °C,% 5 CO₂ inkübatörde 10 dakika inkübe edin. Makrofajların kültür kaplarından ayrılıp ayrılmadığını görselleştirmek için ters çevrilmiş bir mikroskop kullanın.
   NOT: Doku kültürü ile muamele edilmemiş plastik plakaların kullanılması, hücrelerin kolayca ayrışmasına izin vermeli ve hücrelerin plakadan kazınması ihtiyacını ortadan kaldırmalıdır.
5. Bulaşıkları serolojik bir pipet kullanarak enzimatik olmayan hücre ayrışma solüsyonu ile tekrar tekrar yıkayın ve tüm makrofajların tabaktan ayrıldığını doğrulamak için dairesel hareketler gerçekleştirin.
6. Tüm kültür kaplarının çözeltisini konik 50 mL'lik bir santrifüj tüpünde toplayın.
7. Boş kültür kaplarına 10 mL steril önceden ısıtılmış PBS ekleyin ve adım 5.4'teki gibi ilerleyin. Bu prosedür adım 5.4'ün bir tekrarıdır ve tüm makrofajların toplanmasını garanti etmeyi amaçlar.
8. 300 x g'da, 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin.
9. Süpernatanı atın ve peleti 1 mL DMEM / F12-10 ile yeniden süspanse edin. Hücrelere zarar vermemek için pipeti kullanarak yavaş ve dikkatli bir şekilde yukarı ve aşağı homojenize edin.
10. Hemositometreyi kullanarak hücreleri saymak için 10 μL Tripan Mavisi ile seyreltilmiş 10 μL makrofaj çözeltisinden oluşan bir alikot hazırlayın.
    NOT: 7. günde, her çanak yaklaşık 2 x 10⁶ makrofaj üretecektir. Bu, bir farenin on plakada hasat edildiğinde yaklaşık 2 x 10⁷ birincil makrofaj üretebileceği anlamına gelir. M-CSF sadece makrofajların olgunlaşmasını sağladığından, prosedür esasen sadece makrofajlardan oluşan ve diğer kirletici lökositlerden arınmış bir hücre popülasyonunu garanti eder¹⁶.

Sonuçlar

Makrofajlar, özel fizyolojik özelliklere sahip büyük ve yapışık hücrelerdir. Cam ve plastiğe yapışma kabiliyeti nedeniyle kültürde çeşitli morfolojik sunumlar gösterirler ve tipik yayılma morfolojileri sitoplazmik uzantıların emisyonu ile ilgilidir (Şekil 1). Kemik iliği progenitörleri, L-929 hücre süpernatantından M-CSF'ye maruz kaldıklarında ve olgun makrofajlara dönüşümü başlattıklarında, Petri plakasına yapışırlar.

Tartışmalar

Kemik iliğinden türetilmiş bir makrofaj popülasyonu üretmek, özellikle homojen bir birincil hücre popülasyonu elde etmenin önemli olduğu durumlarda, birçok hücre biyolojisi deneysel modelinde temel bir adımdır. Belirtildiği gibi, hücre progenitörleri sadece M-CSF varlığında makrofajlara dönüşebilir. L-929 hücre süpernatantları, M-CSF'nin ana kaynağı olarak kullanılabilir. Maliyet dışında, rekombinant M-CSF'nin kendisinin kullanılmasında herhangi bir sorun yoktur <...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
20-cc syringe	DESCARPACK	SI100S4G	Sterile syringe
26-G needles	BD	497AQDKT7	Sterile needles
50-ml conical centrifuge tube	SARSTEDT	62547254	Plastic conical tubes suitable for centrifugation
70% ethanol solution	EMFAL	490	Ethanol solution for esterilization
Anatomical dissection forceps	3B SCIENTIFIC	W1670	Maintain in sterile beaker containing 70% ethanol solution
C57Bl/6 wild type mouse	Purchased from Biotério Central at Federal University of Minas Gerais	Not applicable	Mice must be specific-pathogen-free, age between 6 and 10 weeks. Mice need be accommodated at least one week earlier for recovering from the stress of transportation
Cell culture flask T175	GREINER	C7481-50EA	T-175 flask, canted neck, surface area 75 cm2, with filter cap, DNase free, RNase free
Cell culture flask T75	GREINER	C7231-120EA	T-75 flask, canted neck, surface area 75 cm2, with filter cap, DNase free, RNase free
Disinfecting or baby Wipes?	CLOROX	Not applicable	It helps cleaning the bone
Distilled Water	GIBCO	15230	Sterile distilled water
DMEM/F12-10	Not applicable	Not applicable	Add 10 mL of Fetal Bovine Serum (FBS) and 1 mL of Penicillin/ Streptomycin (P/S) to DMEM/F12 (q.s.p. 100 mL)
DMEM/F12-10 + supernatant of L-929 cells	Not applicable	Not applicable	Add 20% of supernatant of L929 cells culture on DMEM/F-12-10
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium - F12 (DMEM/F12)	GIBCO	12500096	DMEM: F-12 Medium contains 2.5 mM L-glutamine, 15 mM HEPES, 0.5 mM sodium pyruvate, and 1200 mg/L sodium bicarbonate.Resuspend powder to 1 liter of distilled water and add 3,7 g of sodium bicarbonate. Adjust pH to 7,2 and filter with 0,22 µM. Storage at 2 - 8 °C freezer
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, United States (FBS)	GIBCO	10082147	Enrichment for DMEM-F12
Hemocytometer	SIGMA-ALDRICH	Z359629	Used to count macrophages at microscopy
L-929 cells	SIGMA-ALDRICH	ATCC # CCL-1	L-929 is a lineage of mouse fibroblast cells used as a source of macrophage colony stimulating factor (M-CSF)
Nikon TI eclipse	NIKON	Not applicable	Nikon TI Eclipse is a fluorescence and phase contrast microscope
Non-enzymatic cell dissociation solution	CELLSTRIPER (CORNING)	25-056-CI	Non-enzimatic cell dissociation solution remove macrophages from the plate without damaging them
Non-treated round culture dishes 100 × 20–mm	CORNING	CLS430591	Do not use tissue culture treated petri dishes or any tissue culture treated plate
P3199 Penicillin G Potassium Salt	USBIOLOGICAL	113-98-4	Antibiotics
Penicillin and streptomycin (P/S) solution			Use 0,26 grams of penicillin and 0,40 grams of streptomycin. Mix with 40 mL of sterile PBS. Inside a horizontal laminar flow cabinet, use a 0,22 µM filter and store aliquots of 1.0 mL in 1.5 ml microfuge tubes in the freezer (-20°C)
Phosphate Buffered Saline free from Calcium and Magnesium (PBS)	MEDIATECH	21-040-CM	Sterile
S7975 Streptomycin Sulfate, 650-850U/mg	USBIOLOGICAL	3810-74-0	Antibiotics
Serological pipettes of 10mL or 25 mL	SARSTEDT	861254001	Serological pipettes is used volumes higher than 1 mL
Sodium Bicarbonate	SIGMA-ALDRICH	144-55-8	pH correction for DMEM-F12
Software Nis Elements Viewer	NIKON	Not applicable	NIS-Elements Viewer is a free standalone program to view image files and datasets
Sterile PBS and 2% of P/S solution	LABORCRIN	590338	Add 1 mL of P/S in 40 mL of sterile PBS
Straight iris scissors	KATENA	Not applicable	Maintain in sterile beaker containing 70% ethanol solution
Supernatant of L-929 cells	Not applicable	Not applicable	L-929 is a lineage of mouse fibroblast cells used as a source of macrophage colony stimulating factor (M-CSF). L-929 supernatant was obtain from the protocol
Surgical Scalpel Blade No.24 Stainless Steel	SWANN-MORTON	311	Used for exposing epiphysis from bones
Trypan Blue Solution, 0.4%	GIBCO	15250061	Trypan Blue Solution, 0.4%, is routinely used as a cell stain to assess cell viability using the dye exclusion test
Trypsin/EDTA solution 0,05%	GIBCO	25300-062	Used to dissociate cells from culture bottle
Water for Injection (WFI) for Cell Culture	GIBCO	A12873	Sterile and endotoxin-free water