التعبير عن الجينات المحورة في ظهارة المسالك البولية في المثانة الأصلية باستخدام النقل بوساطة الفيروس الغدي

Summary

يتم وصف طرق لتوليد كميات كبيرة من الفيروسات الغدية المؤتلفة ، والتي يمكن استخدامها بعد ذلك لتحويل ظهارة القوارض الأصلية مما يسمح بالتعبير عن الجينات المحورة أو خفض تنظيم منتجات الجينات الداخلية.

Abstract

بالإضافة إلى تشكيل حاجز عالي المقاومة ، يفترض أن الظهارة البولية المبطنة للحوض الكلوي والحالب والمثانة والإحليل القريب لاستشعار ونقل المعلومات حول بيئتها إلى الأنسجة الكامنة ، مما يعزز وظيفة الإفراغ والسلوك. يمكن أن يؤدي تعطيل حاجز الظهارة البولية ، أو وظيفته الحسية / محول الطاقة ، إلى المرض. تعوق دراسة هذه الأحداث المعقدة عدم وجود استراتيجيات بسيطة لتغيير التعبير الجيني والبروتيني في الظهارة البولية. يتم وصف الطرق هنا التي تسمح للمحققين بتوليد كميات كبيرة من الفيروس الغدي عالي العيار ، والذي يمكن استخدامه بعد ذلك لتحويل ظهارة القوارض بكفاءة عالية ، وبطريقة مباشرة نسبيا. يمكن التعبير عن كل من cDNAs والحمض النووي الريبي الصغير المتداخل باستخدام نقل الفيروس الغدي ، ويمكن تقييم تأثير التعبير الجيني على وظيفة الظهارة البولية بعد 12 ساعة إلى عدة أيام. هذه الطرق لها قابلية تطبيق واسعة على دراسات بيولوجيا الظهارة البولية الطبيعية وغير الطبيعية باستخدام نماذج الفئران أو الفئران.

Introduction

الظهارة البولية هي الظهارة المتخصصة التي تبطن الحوض الكلوي والحالب والمثانة والإحليل القريب¹. وهو يتألف من ثلاث طبقات: طبقة من الخلايا المظلة ثنائية النواة شديدة التمايز والاستقطاب في كثير من الأحيان، والتي تغمرها أسطحها القمية في البول؛ وطبقة من الخلايا المظلية ثنائية النواة شديدة التمايز والاستقطاب، التي تغمرها أسطحها القمية في البول؛ وطبقة من الخلايا المظلية ثنائية النواة شديدة التمايز والاستقطاب، التي تغمرها أسطحها القمية في البول؛ و طبقة خلية وسيطة مع مجموعة من الخلايا العابرة ثنائية النواة التي يمكن أن تؤدي إلى خلايا مظلة سطحية استجابة لفقدانها الحاد ؛ وطبقة واحدة من الخلايا القاعدية ، تعمل مجموعة فرعية منها كخلايا جذعية يمكنها تجديد كامل الظهارة البولية استجابة للإصابة المزمنة. الخلايا المظلية مسؤولة بشكل رئيسي عن تشكيل حاجز الظهارة البولية عالي المقاومة ، وتشمل مكوناته غشاء قمي (غني بالكوليسترول والمخيبروسيدات) مع نفاذية منخفضة للماء والمواد المذابة ، ومركب وصلة قمي عالي المقاومة (يتكون من تقاطعات ضيقة ، وتقاطعات ملتصقة ، وديسموسومات ، وحلقة أكتوميوسين مرتبطة بها) ¹ . يتمدد كل من السطح القمي للخلية المظلية وحلقتها الموصلة أثناء ملء المثانة ويعودان إلى حالتهما المملوءة مسبقا بسرعة بعد إفراغ¹،²،³،^4،5. بالإضافة إلى دورها في وظيفة الحاجز ، يفترض أيضا أن يكون للظهارة البولية وظائف حسية ومحول طاقة تسمح لها باستشعار التغيرات في الوسط خارج الخلية (على سبيل المثال ، التمدد) ونقل هذه المعلومات عن طريق إطلاق الوسطاء (بما في ذلك ATP والأدينوزين والأسيتيل كولين) إلى الأنسجة الكامنة ، بما في ذلك عمليات العصب الوارد تحت الظهارة⁶،^7،8 . تم العثور على أدلة حديثة على هذا الدور في الفئران التي تفتقر إلى التعبير البولية لكل من Piezo1 و Piezo2 ، مما يؤدي إلى تغيير وظيفة الإفراغ⁹. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الفئران التي تفرط في التعبير عن البروتين CLDN2 المكون للمسام ذات الوصلات الضيقة في طبقة الخلية المظلة تصاب بالتهاب وألم مشابه لتلك التي تظهر في المرضى الذين يعانون من التهاب المثانة الخلالي¹⁰. من المفترض أن اضطراب وظيفة الظهارة البولية الحسية / محول الطاقة أو الحاجز قد يساهم في العديد من اضطرابات المثانة ^6,11.

يعتمد الفهم الأفضل لبيولوجيا الظهارة البولية في الحالات الطبيعية والمرضية على توافر الأدوات التي ستسمح للمحققين بتقليل تنظيم التعبير الجيني الداخلي بسهولة أو السماح بالتعبير عن الجينات المحورة في الأنسجة الأصلية. في حين أن أحد الأساليب لتقليل تنظيم التعبير الجيني هو توليد فئران بالضربة القاضية الشرطية ، فإن هذا النهج يعتمد على توافر الفئران ذات الأليلات المتخبطة ، وهو كثيف العمالة ، ويمكن أن يستغرق شهورا إلى سنوات لإكمال¹². ليس من المستغرب إذن أن يطور الباحثون تقنيات لنقل أو تحويل الظهارة البولية ، والتي يمكن أن تؤدي إلى نتائج على نطاق زمني أقصر. تشمل الطرق المنشورة للنقل استخدام الدهون الكاتيونية¹³ ، أو oligodeoxynucleotides المضادة للفسفور¹⁴ ، أو الأحماض النووية المضادة للحساسية المربوطة ببروتين فيروس نقص المناعة البشرية TAT الذي يخترق 11-mer^{peptide 15}. ومع ذلك ، فإن تركيز هذا البروتوكول ينصب على استخدام التنبيغ بوساطة غدية ، وهي منهجية مدروسة جيدا وفعالة في توصيل الجينات إلى مجموعة واسعة من الخلايا ، وقد تم اختبارها في العديد من التجارب السريرية ، وتم استخدامها مؤخرا لتوصيل cDNA الذي يشفر بروتين قفيصة COVID-19 إلى متلقي متغير واحد من لقاح COVID-19^{16 ، 17}. للحصول على وصف أكثر شمولا لدورة حياة الفيروس الغدي ، ونواقل الفيروسات الغدية ، والتطبيقات السريرية للفيروسات الغدية ، يتم توجيه القارئ إلى المرجع¹⁷.

كان معلما مهما في استخدام الفيروسات الغدية لتحويل الظهارة البولية ، تقريرا أعده Ramesh et al. أظهر معالجات مسبقة قصيرة بالمنظفات ، بما في ذلك N-dodecyl-β-D-maltoside (DDM) عززت بشكل كبير نقل الظهارة البولية بواسطة تشفير الفيروس الغدي β-galactosidase¹⁸. باستخدام دراسة إثبات المبدأ هذه كدليل ، تم الآن استخدام نقل الظهارة البولية بوساطة غدية للتعبير عن مجموعة متنوعة من البروتينات ، بما في ذلك GTPases من عائلة Rab ، وعوامل تبادل الجوانين ونوكليوتيدات ، وشظايا محرك الميوسين ، والكلاودينات المرتبطة بالوصلات الضيقة المكونة للمسام ، و ADAM17 10،¹⁹،²⁰،^21،22 . تم تكييف نفس النهج للتعبير عن الحمض النووي الريبي المتداخل الصغير (siRNA) ، والذي تم إنقاذ آثاره من خلال التعبير المشترك عن المتغيرات المقاومة ل siRNA من الجينات^{المحورة 22}. يتضمن البروتوكول الموصوف هنا طرقا عامة لتوليد كميات كبيرة من الفيروس الغدي عالي التركيز ، وهو مطلب لهذه التقنيات ، بالإضافة إلى تعديلات طرق Ramesh et ^al.18 للتعبير عن جينات التحوير في الظهارة البولية بكفاءة عالية.

Protocol

تم إجراء التجارب التي تنطوي على توليد الفيروسات الغدية ، والتي تتطلب شهادة BSL2 ، بموجب موافقة من مكاتب الصحة والسلامة البيئية بجامعة بيتسبرغ ولجنة السلامة البيولوجية المؤسسية. تم إجراء جميع التجارب على الحيوانات ، بما في ذلك نقل الفيروسات الغدية (الذي يتطلب شهادة ABSL2) ، وفقا للمبادئ التوجيهية / اللوائح ذات الصلة لسياسة خدمة الصحة العامة بشأن الرعاية الإنسانية واستخدام المختبر وقانون رعاية الحيوان ، وبموافقة لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية بجامعة بيتسبرغ. يتم ارتداء القفازات وحماية العين والزي المناسب لجميع الإجراءات التي تنطوي على الفيروسات المؤتلفة. يجب التخلص من أي نفايات سائلة أو صلبة كما هو موضح أدناه. وينبغي معاملة فراش الحيوانات بعد نقل اللحية وأي جثث حيوانية ناتجة عنها كمواد خطرة بيولوجيا والتخلص منها وفقا للسياسات المؤسسية.

1. تحضير مخزون الفيروسات الغدية عالية العيار

ملاحظة: يعتمد النقل الفعال لمثانات القوارض على استخدام المخزونات الفيروسية النقية والمركزة ، عادة 1 × 10⁷ إلى 1 × 10⁸ جزيئات فيروسية معدية (IVP) لكل ميكرولتر. يركز هذا الجزء من البروتوكول على توليد مخزونات عالية من الفيروسات الغدية من الاستعدادات الحالية للفيروس. يجب تنفيذ جميع الخطوات في غطاء زراعة الخلايا باستخدام الكواشف والأدوات المعقمة. في حين أن السلالات المتاحة من الفيروس الغدي المستخدمة اليوم معيبة في النسخ المتماثل ، فإن معظم المؤسسات تتطلب الموافقة على استخدام الفيروسات الغدية والحمض النووي المؤتلف. يتضمن ذلك غالبا تعيين غرفة زراعة الخلايا كمنشأة معتمدة من BSL2 لإنتاج وتضخيم الفيروسات الغدية. تشمل بعض الاعتبارات العامة استخدام الأقنعة وحماية العين والقفازات والزي المناسب في جميع مراحل إنتاج الفيروس وتنقيته. عند إجراء الطرد المركزي ، يوصى باستخدام أغطية الأمان إذا كانت أنابيب الطرد المركزي تفتقر إلى أغطية ضيقة. تتم معالجة جميع المواد التي لا يمكن التخلص منها ، بما في ذلك أغطية أمان أجهزة الطرد المركزي والزجاجات والدوارات التي يحتمل أن تكون ملوثة بمحلول مضاد للفيروسات (انظر جدول المواد) ، ثم تشطف بالماء أو 70٪ من الإيثانول. تتم معالجة النفايات السائلة عن طريق إضافة المبيض إلى تركيز نهائي بنسبة 10٪ (v / v). وسيعتمد التخلص من هذه النفايات السائلة على السياسات المؤسسية. عادة ما يتم التخلص من النفايات الصلبة في النفايات الخطرة بيولوجيا.

1. ثقافة خلايا HEK293T
   1. قم بإذابة قارورة مجمدة من خلايا HEK293T في حمام مائي عند 37 درجة مئوية واستخدم ماصة سعة 5 مل لنقل الخلايا إلى طبق زراعة الخلايا بقطر 15 سم. باستخدام ماصة سعة 25 مل ، أضف ببطء 20 مل من وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) الذي يحتوي على 10٪ (v / v) مصل بقري جنيني ومضاد حيوي للبنسلين / الستربتومايسين (DMEM-FBS-PS) إلى الطبق. احتضان الخلايا في حاضنة زراعة الخلايا 37 درجة مئوية بالغاز مع 5٪ (v / v) CO 2 حتى تصل إلى التقاء 80٪ -90٪ (~₂ × 10⁷ خلايا).
   2. باستخدام ماصة زجاجية متصلة بمصدر فراغ ، قم بشفط الوسط ، ثم اشطف الخلايا عن طريق نقل 20 مل من PBS المعقم (2.7 mM KCl ، 1.5 mM KH 2 PO 4 ، 136.9 mM NaCl ، و 8.9 mM_{Na 2}HPO₄) إلى الطبق باستخدام ماصة 25 مل. قم بنضح برنامج تلفزيوني مستهلك ، ثم استخدم ماصة سعة 5 مل لنقل 3 مل من محلول بروتيناز دافئ (37 درجة مئوية) (انظر جدول المواد) إلى الطبق ، واحتضان الطبق في حاضنة زراعة الخلايا حتى تنفصل الخلايا (~ 3-4 دقائق).
      ملاحظة: يمكن تقييم التحلل البروتيني الفعال بشكل أفضل عن طريق إمالة الطبق ببطء ذهابا وإيابا بحثا عن إطلاق الخلايا من جميع أجزاء الطبق إلى السائل المتحرك. خلايا HEK293T حساسة لعلاج البروتيناز الممتد وستموت إذا تركت أكثر من بضع دقائق في محلول البروتيناز.
   3. استخدم ماصة 10 مل لنقل 7 مل من DMEM-FBS-PS إلى طبق الخلايا المنفصلة ، ثم استخدم نفس الماصة لشفط الخلايا والوسط. انقل الخلايا العالقة إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل ، ثم قم بتكوير الخلايا عن طريق الطرد المركزي للتعليق في جهاز طرد مركزي سريري منخفض السرعة عند 200 × جم لمدة 5 دقائق. نضح المادة الطافية باستخدام ماصة زجاجية متصلة بمصدر فراغ. استخدم ماصة سعة 25 مل لإعادة تعليق حبيبات الخلية في 15 مل من DMEM-FBS-PS.
   4. أضف 1 مل من معلق الخلية إلى كل من خمسة عشر طبقا مقاس 15 سم تحتوي على 19 مل من DMEM-FBS-PS.
   5. تنمو الخلايا في حاضنة زراعة الأنسجة حتى تصل إلى التقاء 85٪ -90٪ (~ 3-4 أيام).
2. تحضير محلول فيروس مخفف
   1. أضف ~ 1.5 × 10 9 إلى 3 × 10⁹ IVP من مخزون فيروس موجود (5-10 IVP / خلية) إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل مملوء ب 45 مل من DMEM يفتقر إلى FBS أو المضادات الحيوية.
      ملاحظة: من الممكن استخدام تركيز أقل من الفيروس (1-5 IVP / خلية) ؛ ومع ذلك ، سوف يستغرق إنتاج الفيروس وقتا أطول.
3. تصيب الخلايا المستزرعة بالفيروس.
   1. باستخدام ماصة زجاجية متصلة بمصدر فراغ ، قم بشفط الوسط من الخلايا المتقاربة تقريبا في الخطوة 1.1.5.
   2. استخدم ماصة سعة 25 مل لنقل 3.0 مل من محلول الفيروس المخفف (المحضر في الخطوة 1.2.1) إلى كل طبق لزراعة الخلايا. بعد ذلك ، استخدم ماصة 10 مل لإضافة 7.0 مل من وسط DMEM (يفتقر إلى FBS أو المضادات الحيوية) إلى كل طبق. احتضن لمدة 60 دقيقة في حاضنة زراعة الخلايا ، ثم أضف 10 مل من DMEM تحتوي على 20٪ (v / v) FBS و 2x PS لكل طبق.
      ملاحظة: إن استخدام أحد الأطباق ال 15 كلوحة تحكم (لا يضاف فيها الفيروس) يجعل من السهل تحديد تقريب الخلايا الناجم عن الفيروس وموتها في الخلايا المصابة في الخطوة التالية.
   3. احتضان الخلايا في حاضنة زراعة الخلايا لمدة 2-4 أيام حتى يبدأ معظمها في التقريب وانفصل >60٪ من الخلايا.
      ملاحظة: في حالة استخدام عيار أقل من الفيروس ، قد يستغرق الأمر ما يصل إلى أسبوع حتى يحدث موت الخلايا. إذا لم يحدث موت الخلايا في غضون أسبوع ، فمن المحتمل أن تحتاج العملية إلى تكرارها باستخدام عيار أعلى من الفيروس.
4. استعادة الفيروس من محللات الخلية
   1. استخدم مكشطة الخلايا لكشط قاع كل طبق ، وإطلاق الخلايا المرفقة في الوسط.
   2. باستخدام ماصة سعة 25 مل ، قم بجمع وتجميع الوسط والخلايا وحطام الخلية من كل طبق من أطباق زراعة الخلايا في أنبوب زراعة خلية مخروطي سعة 50 مل.
      ملاحظة: لتوفير الموارد ، يمكن دمج الوسيط من طبقين في أنبوب واحد سعة 50 مل.
   3. قم بتجميع المادة الخلوية عن طريق الطرد المركزي باستخدام جهاز طرد مركزي منخفض السرعة على سطح الطاولة: 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة عند 3000 × جم. استخدم ماصة زجاجية متصلة بجهاز تفريغ لشفط المادة الطافية.
   4. استخدم ماصة 10 مل ، جنبا إلى جنب مع التثليث ، لدمج جميع المواد الحبيبية الناتجة في ما مجموعه 7 مل من 100 مللي متر من درجة حموضة Tris-HCl المعقمة المفلترة 7.4 التي تحتوي على 10 mM EDTA (محلول Tris-EDTA). انقل المادة المجمعة إلى أنبوب مخروطي معقم لزراعة الخلايا سعة 15 مل وضعها على الجليد.
      ملاحظة: في هذه المرحلة ، يمكن تجميد تحضير الفيروس عند -80 درجة مئوية إلى أجل غير مسمى.
5. تحضير محللات الخلية
   1. قم بإجراء ثلاث دورات تجميد وذوبان لتعطيل الخلايا المتبقية ، وبالتالي زيادة تحرير جزيئات الفيروس المشكلة. قم بتجميد المادة المجمعة في الخطوة 1.4.4 عن طريق غمر الأنبوب في النيتروجين السائل (~ 30-60 ثانية). قم بإذابة العينة بسرعة عن طريق وضع الأنبوب في حاضنة 37 درجة مئوية. دوامة العينة لمدة 15 ثانية ، ثم كرر إجراء التجميد والذوبان السريع 2x إضافي.
      ملاحظة: يمكن إذابة محلول الفيروس بسرعة في درجة حرارة 37 درجة مئوية في حمام مائي ، ولكن هناك ما يبرر الحذر لأن تقلبات درجة الحرارة يمكن أن تتسبب في تصدع الأنبوب ، مما يؤدي إلى إطلاق محلول الفيروس في حمام مائي. لمنع حدوث ذلك ، ضع الأنبوب الذي يحتوي على المادة الطافية الفيروسية في أنبوب أكبر ، ثم يتم وضعه في حمام مائي.
   2. استخدم ماصة سعة 10 مل لنقل المادة الخلوية المذابة بالتجميد ثلاث مرات إلى أنبوب طرد مركزي فائق السرعة. أجهزة الطرد المركزي المواد في الأنبوب لمدة 30 دقيقة عند 4 °C أجهزة الطرد المركزي فائقة السرعة في ~ 18500 × ز.
   3. استرجع ~ 7 مل من المادة الطافية الغنية بالفيروسات باستخدام ماصة 10 مل وانقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل. احتفظ بالعينة على الثلج حتى الخطوة التالية.
      ملاحظة: في هذه المرحلة ، ضع في اعتبارك الاحتفاظ بقسمة من المادة الطافية الفيروسية غير المنقاة كديباجة لبدء إعداد فيروس جديد (أو كنسخة احتياطية). قم بتخزين هذه القسيمة في -80 درجة مئوية.
6. عزل وتنقية الفيروس باستخدام الطرد المركزي المتدرج الكثافة.
   1. قم بإعداد تدرج متقطع ل CsCl في أنبوب طرد مركزي فائق شفاف PET سعة 12 مل (انظر جدول المواد) أو ما يعادله. استخدم حقنة سعة 3 مل مزودة بإبرة 18 جم لإدخال 2.5 مل من محلول CsCl سعة 1.4 جم / مل بعناية في قاع الأنبوب ، ثم استخدم حقنة / إبرة جديدة لوضعها في طبقة 2.5 مل من محلول CsCl 1.25 جم / مل.
      ملاحظة: سيؤدي إسقاط المحاليل مباشرة فوق طبقة موجودة مسبقا إلى خلط كبير وغير مرغوب فيه. بدلا من ذلك ، ضع الجزء المشطوف من الإبرة على حافة الأنبوب ، ثم اضغط ببطء شديد على مكبس المحقنة ، وارفع موضع الإبرة بينما يملأ المحلول الأنبوب.
   2. قم بتحميل ~ 7 مل من المادة الطافية الفيروسية أعلى التدرج بطريقة مماثلة باستخدام حقنة سعة 10 مل. إذا كان هناك أكثر من 2-3 مم من المسافة بين المادة الطافية الفيروسية وأعلى الأنبوب ، أضف محلول Tris-EDTA إضافي لملء الأنبوب حتى يتبقى 2-3 مم فقط من المساحة.
   3. اصنع أنبوب توازن معد بالمثل ، يحتوي على طبقات من CsCl ، ولكن استبدل محلول Tris-EDTA بالطافية الفيروسية.
      ملاحظة: يجب أن يكون للأنبوبين أوزان متطابقة (وكثافات مماثلة) لمنع حدوث حالة تحميل غير متوازنة يحتمل أن تكون خطرة في أجهزة الطرد المركزي الفائقة.
7. عزل الفيروس باستخدام معدل الطرد المركزي المناطقي.
   1. قم بتحميل التدرجات التي تشكلت في الخطوات 1.6.2-1.6.3 في جرافات دوار SW41 أو ما يعادله. المسمار في أغطية دلو ، ووضع الدوار في جهاز طرد مركزي فائق (مبرد مسبقا إلى 4 °C) ، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 1 ساعة في ~ 150,000 × غرام.
   2. أثناء الطرد المركزي ، وازن العمود الموصوف في الخطوة 1.9.1 أدناه.
8. استعادة جزيئات الفيروس المعزولة
   1. في نهاية خطوة الطرد المركزي ، افصل الدلاء بعناية عن الدوار ، وفي غطاء زراعة الخلايا ، قم بإزالة أغطية الجرافة ، ثم قم بإزالة الأنابيب ووضعها في رف.
   2. اجمع المواد ذات النطاقات ، الغنية بجزيئات الفيروس ، التي تطفو على السطح البيني بين محلول CsCl 1.25 جم / مل و 1.4 جم / مل CsCl. عند إمساك الأنبوب الذي يحتوي على التدرج فوق النصف السفلي من طبق زراعة الخلايا (الذي سيلتقط أي مواد مسكوبة) ، استخدم إبرة 1 بوصة 18 جم متصلة بحقنة سعة 3 مل لثقب الأنبوب بعناية ، أسفل الفيروس المربوط مباشرة. استنشاق الفيروس ببطء ، والذي يتم استرداده عادة في ~ 1 مل.
   3. قم بإزالة الإبرة من الأنبوب ، مما سيؤدي إلى تدفق المادة المتبقية في التدرج من الأنبوب إلى النصف السفلي من طبق زراعة الخلايا (يجب معاملة أي سوائل على أنها نفايات خطرة).
   4. نقل محلول الفيروس في المحقنة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق معقم على الجليد.
      ملاحظة: عند استعادة الفيروس في هذه الخطوة ، ضع الإبرة بحيث يكون تجويف الإبرة متجها لأعلى مع فتح الإبرة على بعد بضعة مم أسفل الشريط الغني بالفيروس. تجنب التلوث بالشريط الرفيع للفيروس الذي تم تجميعه بشكل غير صحيح والذي لوحظ أحيانا 2-3 مم فوق الفيروس ذي النطاقات (انظر السهم الأسود الرفيع في الشكل 1 أ).
9. قم بإزالة CsCl من العينة عن طريق الترشيح الهلامي.
   1. قم بموازنة عمود PD-10 (معبأ مسبقا ب Sephadex G-25M) ، مثبت بحامل دعم ، مع 50 مل من PBS المعقم المصفى 0.2 ميكرومتر يحتوي على 10٪ (v / v) من الجلسرين.
      ملاحظة: تستغرق خطوة التوازن الأولية 2-3 ساعات لإكمالها وهي ضرورية لضمان الغسل الكامل للمواد الحافظة التي تستخدمها الشركة المصنعة لتثبيت العمود.
   2. اترك محلول الغسيل ينحسر أسفل فريت (قرص واقي من مادة بيضاء في الجزء العلوي من وسط العمود) ، ثم انقل بعناية محلول الفيروس المنقى الذي تم جمعه في الخطوة 1.8 إلى أعلى العمود. اسمح للمحلول الغني بالفيروسات بالانحسار أسفل فريت ، ثم ابدأ في ملء العمود بجلسرين PBS.
      ملاحظة: تتمثل إحدى وظائف فريت في منع العمود من الجفاف. نتيجة لذلك ، يتم التسامح مع التأخيرات القصيرة قبل إضافة المزيد من eluant إلى العمود.
   3. اجمع الشطف في 12 أنبوب طرد مركزي دقيق معقم ، 0.5 مل لكل كسر.
10. تحديد العائد الفيروسي.
    1. تحديد كسور فيروس الذروة باستخدام القياس الطيفي. قم بإعداد تخفيف 1: 100 لكل كسر في PBS وقم بقياس OD₂₆₀ في مقياس الطيف الضوئي ، باستخدام تخفيف 1: 100 من المخزن المؤقت وحده كفراغ. يجب أن تتلاشى جزيئات الفيروس في حجم الفراغ ، بدءا من الجزء 6 تقريبا. قم بتجميع الكسور التي تحتوي على أعلى قراءات OD₂₆₀ .
    2. قم بتخفيف 1: 100 من الكسور الفيروسية المجمعة وأعد قياس OD₂₆₀. احسب التركيز النهائي لجزيئات الفيروس وعدد IVP في الكسور المجمعة باستخدام الصيغة التالية: جسيمات الفيروس لكل مل = OD₂₆₀ × 100 (هذا يصحح عامل التخفيف) × 10¹². التقدير العام هو أن 1٪ من جزيئات الفيروس هي IVP ، على هذا النحو: IVP / mL = OD 260 × 100 × 10¹⁰ أو IVP / μL = OD₂₆₀ × 100 ×^{10 7}.
11. قسمة كسور الفيروس المجمعة (التي تحتوي على 5 × 10⁷ إلى 1 × 10⁸ IVP) في أنابيب طرد مركزي دقيقة معقمة أو cryovials. قم بتخزين العينات في درجة حرارة -80 درجة مئوية.

2. نقل المثانة القوارض

ملاحظة: إذا كانت هذه التقنية جديدة ، فمن المستحسن أن يقتصر عدد الحيوانات التي تم تحويلها في وقت واحد على 2-4. يمكن تحقيق ذلك عن طريق ترتيب أوقات البدء لكل ، خاصة أثناء معالجة المنظفات في الخطوة 2.2 ، ثم حضانة الفيروس في الخطوة 2.3. يمكن للمحققين ذوي الخبرة تحويل ما يصل إلى ستة في وقت واحد.

1. قسطرة المثانة
   1. تخدير إناث الفئران C57Bl / 6J (عادة من 8 إلى 10 أسابيع ، ~ 20-25 جم) أو إناث فئران Sprague Dawley (عادة ما تكون 2-3 أشهر ، ~ 250 جم) باستخدام مبخر مع مخروط أنف متصل. قم بمعايرة المرذاذ لإنتاج 3.0٪ (v / v) isoflurane ، 97٪ (v / v) O 2 للفئران أو 4.0٪ (v / v) isoflurane ، 96٪ (v / v) O₂ للفئران. تأكد من تخدير الحيوانات من خلال التأكد من أنها لا تستجيب لقرصة إصبع القدم (عادة بعد 1-2 دقيقة).
   2. الحفاظ على درجة حرارة جسم الحيوان عن طريق وضع الحيوانات على وسادة ساخنة. راقب الحيوان طوال بروتوكول التنبيغ للتأكد من تخدير الحيوانات وعدم التعرض لأي ألم أثناء هذا الإجراء.
   3. تقليل الأيزوفلوران إلى 1.5٪ (v / v) للفئران أو 2.0٪ (v / v) للفئران والحفاظ على الحيوانات تحت التخدير طوال مدة البروتوكول.
   4. لمنع إدخال الهواء إلى المثانة ، املأ جزء القسطرة البلاستيكية من قسطرة وريدية (انظر جدول المواد) والمحور المرتبط بها ب PBS معقم باستخدام ماصة نقل.
   5. مع وجود الحيوان في وضع ضعيف ، قم بمسح الصماخ الخارجي بنسبة 70٪ كحول ، وأدخل القسطرة المعقمة في الصماخ الخارجي ، ثم مجرى البول ، ثم في المثانة.
      1. لأداء هذه المهمة ، استخدم ملقط ناعم للإمساك برفق الأنسجة التي تشكل الصماخ الخارجي وتمديده عموديا ، بعيدا عن الحيوان. باستخدام اليد الأخرى ، أدخل القسطرة بعناية عموديا حوالي 3-4 مم في صماخ مجرى البول (كومة من اللحم فوق فتحة المهبل مباشرة). ثم ، بسبب انحناء في مجرى البول ، قم بخفض القسطرة ، وإدخالها في الصماخ الخارجي ، باتجاه ذيل الحيوان ، مما يسهل دخوله إلى جزء مجرى البول الذي يمر أسفل عظم العانة ، وفي النهاية إلى المثانة.
         . ملاحظة: خاصة في حالة الماوس ، قد تكون القسطرة طويلة جدا ، ويجب إدخال أكثر من 1.0-1.1 سم منها في الحيوان. خلاف ذلك ، سوف يترتب على ذلك تلف الغشاء المخاطي في المثانة. لمنع ذلك ، ضع علامة على القسطرة ~ 1 سم أسفل طرفها ، ثم لا تدخل القسطرة بعد هذه العلامة.
   6. اسمح للبول في المثانة بالتسرب. قم بإزالة أي بول متبقي عن طريق إجراء مناورة Credé: قم بالتدليك واضغط برفق على نتوء المثانة في منطقة أسفل البطن.
2. اجعل الظهارة البولية متقبلة للنقل عن طريق معالجتها بمحلول منظف.
   1. اغسل الفأر أو مثانة الفئران عن طريق توصيل حقنة معقمة سعة 1 مل مملوءة ب PBS بمحور القسطرة. حقن 100 ميكرولتر من PBS المعقمة في مثانة الفأر (أو 450 ميكرولتر في حالة مثانة الفئران). افصل المحقنة عن تركيب القسطرة واترك PBS يستنزف. إذا لزم الأمر ، قم بإجراء مناورة Crede لإزالة سائل المثانة الزائد.
   2. غرس 100 ميكرولتر من 0.1٪ (وزن / حجم) N-dodecyl-β-D-maltoside (DDM) (مذاب في PBS و 0.2 ميكرومتر معقم بالمرشح) في مثانة الفأر باستخدام حقنة معقمة سعة 1 مل. احتفظ ب DDM في المثانة لمدة 10 دقائق عن طريق ترك المحقنة في مكانها. في الفئران ، يتم زيادة حجم DDM إلى 450 ميكرولتر.
   3. قم بإزالة DDM من المثانة عن طريق فصل المحقنة والسماح لها بالتصريف. أداء مناورة Crede إذا لزم الأمر.
3. إدخال الفيروس في المثانة.
   1. نعلق حقنة معقمة 1 مل إلى محور القسطرة وغرس 0.5 × 10⁷ إلى 1 × 10⁸ IVP من الفيروس الغدي (أعدت في الخطوة 1) ، مخففة في 100 ميكرولتر من PBS المعقمة للفئران أو 450 ميكرولتر للفئران ، في المثانة. اترك المحقنة متصلة بالقسطرة لمنع محلول الفيروس من الهروب.
   2. بعد 30 دقيقة ، افصل المحقنة واسمح لمحلول الفيروس بإخلاء المثانة على وسادة يمكن التخلص منها. امسح أي محلول فيروسي متبقي بمنديل ماص ، وتخلص من الوسادة وامسح النفايات الخطرة بيولوجيا.
      ملاحظة: الجلسرين سام للخلايا. على هذا النحو ، يقتصر الحجم الأقصى لمحلول الفيروس الذي يتم غرسه في الفئران على 5 ميكرولتر (والذي عند تخفيفه إلى 100 ميكرولتر من PBS سيؤدي إلى تركيز الجلسرين النهائي ~ 0.5٪ [v / v]). بالإضافة إلى ذلك ، من الممكن تعزيز كفاءة النقل عن طريق زيادة عدد IVP المغروس وتمديد حضانة الفيروس إلى 45 دقيقة.
   3. خطوة اختيارية: يمكن شطف المثانة باستخدام برنامج تلفزيوني كما هو موضح في الخطوة 2.2.1 أعلاه ؛ ومع ذلك ، هذا غير مطلوب.
4. السماح للحيوان بالتعافي.
   1. أوقف تدفق الأيزوفلوران واسمح للحيوان بالتعافي والحركة الكاملة قبل إعادته إلى قفصه ، خاصة إذا كانت الحيوانات مجمعة.
      ملاحظة: نظرا لأن نقل الفيروس في حد ذاته لا يسبب أعراضا أو ألما ملحوظا في المسالك البولية السفلية ، فلا توجد عادة حاجة للعلاج بعد الجراحة. ومع ذلك ، إذا كان جين التحوير المشفر ساما ، فقد يكون التسكين أو المضادات الحيوية بعد الإجراء ضروريا كما هو مطلوب من قبل المؤسسة.
5. تحليل آثار التعبير الجيني التحوير 12-72 ساعة بعد العلاج باستخدام طرق مثل mRNA في التهجين في الموقع ، أو اللطخة الغربية ، أو التألق المناعي⁹،^10،23 (انظر النتائج التمثيلية).

النتائج

إعداد الفيروس
يظهر مثال على تنقية الفيروس عن طريق الطرد المركزي المتدرج الكثافة في الشكل 1 أ. يتكون الشريط الوردي الفاتح ، الموجود في واجهة المادة الخلوية المحملة وطبقة CsCl 1.25 جم / مل ، بشكل أساسي من الخلايا المعطلة وحطامها (انظر السهم الأرجواني في الشك...

Discussion

بينما ركز Ramesh et al. على تطوير استراتيجيات لاستخدام نقل الفيروسات الغدية في علاج سرطان المثانة 18 ، أظهرت التقارير الحديثة فائدة هذه التقنيات في دراسة بيولوجيا الظهارة البولية الطبيعية / علم وظائف الأعضاء والفيزيولوجيا المرضية 10،¹⁸،¹⁹،^20<...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL pipette	Corning Costar (Millipore Sigma)	CLS4488	sterile, serological pipette, individually wrapped
12 mL ultracentrifuge tube	ThermoFisher	06-752	PET thinwall ultracentrifuge tube
15 mL conical centrifuge tube	Falcon (Corning)	352097	sterile
18 G needle	BD	305196	18 G x 1.5 in needle
20 mL pipette	Corning Costar (Millipore Sigma)	CLS4489	sterile, serological pipette, individually wrapped
50 mL conical centrifuge tube	Falcon (Corning)	352098	sterile
5 mL pipette	Corning Costar (Millipore Sigma)	CLS4487	sterile, serological pipette, individually wrapped
Cavicide	Henry Schein	6400012	Anti-viral solution
Cell culture dish - 15 cm	Falcon (Corning)	353025	sterile, tissue-culture treated  (150 mm x 25 mm dish)
Cell scraper	Sarstedt	893.1832	handle length 24 cm, blade length 1.7 cm
CsCl	Millipore Sigma	C-4306	Molecular Biology grade ≥ 98%
DMEM culture medium (high glucose)	Gibco (ThermoFisher)	11965092	with 4.5 g/L glucose + L-glutamine + phenol red
EDTA	Millipore Sigma	EDS	Bioiultra grade ≥ 99%
Fetal bovine serum	Hyclone (Cytiva)	SH30070.03	defined serum
Glass pipette	Fisher Scientific	13-678-20A	5.75 in glass pipette, autoclaved
Glycerol	Millipore Sigma	G-5516	Molecular Biology grade ≥ 99%
HEK293 cells	ATCC	CRL-3216	HEK293T cells are a variant of HEK293 cells that express the SV40 large T-antigen
Isoflurane	Covetrus	29405
IV catheter - mouse	Smith Medical Jelco	3063	24 G x 3/4 in Safety IV catheter  radiopaque
IV catheter - rat	Smith Medical Jelco	3060	22 G x 1 in Safety IV catheter radiopaque
KCl	Millipore Sigma	P-9541	Molecular Biology grade ≥ 99%
KH2PO4	Millipore Sigma	P5655	Cell culture grade  ≥ 99%
Na2HPO4•7 H2O	Millipore Sigma	431478	≥ 99.99%
NaCl	Millipore Sigma	S3014	Molecular Biology grade ≥ 99%
N-dodecyl-β-D-maltoside	Millipore Sigma	D4641	≥ 98%
Nose cone for multiple animals	custom designed		commercial options include one from Parkland Scientific (RES3200)
PD-10 column	GE Healthcare	17-085-01	Prepacked columns filled ith Sephadex G-25M
Penicillin/streptomycin antibiotic (100x)	Gibco (ThermoFisher)	15070063	100x concentrated solution
Spectrophotometer	Eppendorf	BioPhotometer
Stand and clamp	Fisher Scientific	14-679Q and 05-769-8FQ	available from numerous suppliers
Sterile filter unit	Fisher Scientific (Nalgene)	09-740-65B	0.2 µm rapid-flow filter unit (150 mL)
Sterile filter unit 0.2 µm (syringe)	Fisher Scientific	SLGV004SL	Millipore Sigma Milex 0.22 µm filter unit that attaches to syringe
Super speed centrifuge	Eppendorf	5810R	with Eppendorf F34-6-38 fixed angle rotor (12,000 rpm)
Syringe (1 mL)	BD	309628	1-mL syringe Luer-lok tip - sterile
Syringe (3 mL)	BD	309656	3-mL syringe slip tip - sterile
Table-top centrifuge (low speed)	Eppendorf	5702	with swinging bucket rotor
Transfer pipettes	Fisher Scientific	13-711-9AM	polyethylene 3.4 mL transfer pipette
Tris-base	Millipore Sigma	648310-M	Molecular Biology grade
TrypLE select protease solution	Gibco (ThermoFisher)	12604013	TrypLE express enzyme (1x), no phenol red
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima L-80 XP	with Beckman SW41 rotor (41,000 rpm)
Vaporizer	General Anesthetic Services, Inc.	Tec 3	Isoflurane vaporizer
Vortex Mixer	VWR	10153-838	analog vortex mixer