使用腺病毒介导的转导在天然膀胱尿氦中表达转基因

摘要

描述了用于生成大量重组腺病毒的方法，然后可用于转导天然啮齿动物尿路上皮，从而表达转基因或下调内源性基因产物。

摘要

除了形成高阻力屏障外，肾盂、输尿管、膀胱和近端尿道内壁的尿路上皮还被假设为感知其环境信息并将其传递到下层组织，从而促进排尿功能和行为。尿路上皮屏障或其感觉/换能器功能的破坏可导致疾病。由于缺乏改变尿路上皮中基因和蛋白质表达的简单策略，研究这些复杂事件受到阻碍。这里描述了允许研究人员产生大量高滴度腺病毒的方法，然后可以使用这些病毒以相对直接的方式高效转导啮齿动物尿路上皮。cDNA和小干扰RNA都可以使用腺病毒转导表达，并且可以在12小时至几天后评估转基因表达对尿路上皮功能的影响。这些方法对使用小鼠或大鼠动物模型研究正常和异常尿路上皮生物学具有广泛的适用性。

引言

尿路上皮是排列在肾盂、输尿管、膀胱和近端尿道¹ 上的特化上皮。它包括三个层:一层高度分化和极化的通常双核伞状细胞，其顶端表面沐浴在尿液中;具有双核转运扩增细胞群的中间细胞层，可产生浅表伞形细胞以应对其急性丢失;以及单层基底细胞，其中一部分作为干细胞发挥作用，可以再生整个尿路上皮以应对慢性损伤。伞状细胞主要负责形成高抗性尿路上皮屏障，其组成部分包括对水和溶质通透性低的顶膜（富含胆固醇和脑苷脂）和高抗性顶端连接复合物（由紧密连接、粘附连接、桥粒和相关肌动球蛋白环组成）¹.伞状细胞的顶端表面及其连接环在膀胱充盈过程中均膨胀，并在排尿后迅速恢复到预充盈状态1，²，^3，4，5。除了在屏障功能中的作用外，尿路上皮还被假设具有感觉和换能器功能，使其能够感知细胞外环境的变化（例如拉伸），并通过释放介质（包括ATP，腺苷和乙酰胆碱）将此信息传递到下层组织，包括尿路上皮下^{传入神经过程}6，^7，8.在缺乏Piezo1和Piezo2尿路上皮表达的小鼠中发现了这种作用的最新证据，这导致排尿功能改变⁹。此外，在伞状细胞层中过度表达紧密连接孔形成蛋白CLDN2的大鼠会产生类似于间质性膀胱炎患者的炎症和疼痛¹⁰。据推测，尿路上皮感觉/换能器或屏障功能的破坏可能导致几种膀胱疾病^6，11。

更好地了解正常和疾病状态下尿路上皮的生物学取决于工具的可用性，这些工具将使研究人员能够轻松下调内源性基因表达或允许在天然组织中表达转基因。虽然下调基因表达的一种方法是产生条件性尿路上皮敲除小鼠，但这种方法取决于具有絮状等位基因的小鼠的可用性，是劳动密集型的，并且可能需要数月至数年才能完成¹²。毫不奇怪，研究人员已经开发出转染或转导尿路上皮的技术，这可以导致更短的时间尺度的结果。已发表的转染方法包括使用阳离子脂质¹³、反义硫代磷酸化寡脱氧核苷酸¹⁴或拴在穿透11-mer肽¹⁵的HIV TAT蛋白上的反义核酸。然而，该协议的重点是使用腺病毒介导的转导，这是一种经过充分研究的方法，可有效地将基因递送到广泛的细胞，已在众多临床试验中进行了测试，最近用于将编码 COVID-19 衣壳蛋白的 cDNA 递送给 COVID-19 疫苗的一种变体的接受者^16，17.有关腺病毒生命周期、腺病毒载体和腺病毒临床应用的更全面描述，读者可参考参考文献¹⁷。

使用腺病毒转导尿路上皮的一个重要里程碑是Ramesh等人的一份报告，该报告显示用洗涤剂（包括N-十二烷基-β-D-麦芽糖苷（DDM））进行短暂的预处理，通过编码β-半乳糖苷酶¹⁸的腺病毒显着增强了尿路上皮的转导。以这项原理验证研究为指导，腺病毒介导的尿路上皮转导现已用于表达多种蛋白质，包括Rab家族GTP酶、鸟嘌呤-核苷酸交换因子、肌球蛋白运动片段、形成孔的紧密连接相关claudins和ADAM17 10，¹⁹，²⁰，^21，22.相同的方法适用于表达小干扰RNA（siRNA），其作用通过共表达转基因²²的siRNA抗性变体来拯救。这里描述的方案包括产生大量高浓度腺病毒的一般方法，这些技术的要求，以及Ramesh等人¹⁸的方法的适应性，以高效率地在尿路上皮表达转基因。

研究方案

涉及产生腺病毒的实验，需要BSL2认证，是在匹兹堡大学环境健康与安全办公室和机构生物安全委员会的批准下进行的。所有进行的动物实验，包括腺病毒转导（需要ABSL2认证），均按照《关于人道护理和实验动物的公共卫生服务政策和动物福利法》的相关指南/规定进行，并得到匹兹堡大学机构动物护理和使用委员会的批准。所有涉及重组病毒的手术均应佩戴手套、护目镜和适当的服装。任何液体或固体废物都应按以下说明进行处理。转导后动物的垫料以及由此产生的任何动物尸体应作为生物危害材料处理，并根据机构政策进行处理。

1. 高滴度腺病毒储液的制备

注意:啮齿动物膀胱的有效转导取决于纯化和浓缩病毒储液的使用，通常每μL1 x 10⁷ 至1 x 10⁸ 感染性病毒颗粒（IVP）。该协议的这一部分侧重于从现有病毒制剂中生成高滴度腺病毒储液。所有步骤都应使用无菌试剂和工具在细胞培养罩中进行。虽然目前使用的腺病毒可用菌株存在复制缺陷，但大多数机构需要批准才能使用腺病毒和重组DNA。这通常包括将细胞培养室指定为BSL2批准的设施，以生产和扩增腺病毒。一些一般注意事项包括在病毒产生和纯化的所有阶段使用口罩、护目镜、手套和适当的服装。进行离心时，如果离心管没有紧密配合的盖子，建议使用安全帽。所有非一次性材料，包括可能被污染的离心机安全盖、瓶子和转子，都用抗病毒溶液处理（见 材料表），然后用水或70%乙醇冲洗。液体废物通过添加漂白剂至终浓度为10%（v / v）来处理。这些液体废物的处置将取决于机构政策。固体废物通常以生物危险废物的形式处置。

1. 培养HEK293T细胞
   1. 在37°C的水浴中解冻HEK293T细胞的冷冻小瓶，并使用5mL移液管将细胞转移到直径为15cm的细胞培养皿中。使用 25 mL 移液器，将 20 mL 含有 10% （v/v） 胎牛血清和青霉素/链霉素抗生素 （DMEM-FBS-PS） 的 Dulbecco 改良鹰培养基 （DMEM） 缓慢加入培养皿中。将细胞在用5%（v / v）CO₂ 气体的37°C细胞培养箱中孵育，直到它们达到80%-90%汇合（~2 x 10⁷ 个细胞）。
   2. 使用连接到真空源的玻璃移液管吸出培养基，然后使用 25 mL 移液管将 20 mL 无菌 PBS（2.7 mM KCl、1.5 mM KH 2 PO 4、136.9 mM NaCl 和 8.9 mM Na₂HPO₄）转移到培养皿中来冲洗细胞。吸出用过的PBS，然后使用5mL移液管将3mL温热（37°C）蛋白酶溶液（参见材料表）转移到培养皿中，将培养皿在细胞培养箱中孵育直至细胞分离（~3-4分钟）。
      注意:有效的蛋白水解可以通过缓慢地来回倾斜培养皿来评估，寻找细胞从培养皿的所有部分释放到移动流体中。HEK293T细胞对延长的蛋白酶治疗敏感，如果在蛋白酶溶液中放置超过几分钟就会死亡。
   3. 使用 10 mL 移液器将 7 mL DMEM-FBS-PS 转移到分离细胞的培养皿中，然后使用相同的移液器吸出细胞和培养基。将悬浮细胞转移到50mL锥形管中，然后通过在低速临床离心机中以200× g 离心5分钟来沉淀细胞。使用连接到真空源的玻璃移液管吸出上清液。使用 25 mL 移液器将细胞沉淀重悬于 15 mL DMEM-FBS-PS 中。
   4. 将 1 mL 细胞悬液添加到含有 19 mL DMEM-FBS-PS 的 15 个 15 cm 培养皿中。
   5. 在组织培养箱中培养细胞，直到它们达到85%-90%汇合（~3-4天）。
2. 制备稀释的病毒溶液
   1. 将现有病毒原液（5-10 IVP/细胞）的 ~1.5 x 10 9 至 3 x 10⁹ IVP 加入装有 45 mL 缺乏 FBS 或抗生素的 DMEM 的 50 mL 锥形管中。
      注意:可以使用较低浓度的病毒（1-5 IVP /细胞）;但是，病毒的产生需要更长的时间。
3. 用病毒感染培养的细胞。
   1. 使用连接到真空源的玻璃移液管，在步骤1.1.5中从几乎汇合的细胞中吸出培养基。
   2. 使用 25 mL 移液管将 3.0 mL 稀释的病毒溶液（在步骤 1.2.1 中制备）转移到每个细胞培养皿中。然后，使用 10 mL 移液器向每个培养皿中加入 7.0 mL DMEM 培养基（不含 FBS 或抗生素）。在细胞培养箱中孵育60分钟，然后向每个培养皿中加入10mL含有20%（v / v）FBS和2x PS的DMEM。
      注意:使用15个培养皿之一作为对照板（其中不添加病毒）可以在下一步中更容易识别病毒诱导的细胞在感染细胞中的四舍五入和死亡。
   3. 将细胞在细胞培养箱中孵育2-4天，直到大多数细胞开始四舍五入并且>60%的细胞脱落。
      注意:如果使用较低的病毒滴度，可能需要长达一周的时间才能发生细胞死亡。如果细胞死亡在一周内没有发生，则可能需要使用更高滴度的病毒重复该过程。
4. 从细胞裂解物中回收病毒
   1. 使用细胞刮刀刮擦每个培养皿的底部，将附着的细胞释放到培养基中。
   2. 使用 25 mL 移液器收集每个细胞培养皿中的培养基、细胞和细胞碎片并将其汇集到 50 mL 锥形细胞培养管中。
      注意:为了节省资源，可以将两个培养皿中的培养基组合成一个 50 mL 管。
   3. 通过使用低速台式离心机离心沉淀细胞材料:室温下3，000× g下5分钟。使用连接到真空装置的玻璃移液管吸出上清液。
   4. 使用 10 mL 移液器，结合研磨，将所有所得沉淀材料合并到总共 7 mL 无菌过滤的 100 mM Tris-HCl pH 7.4 中，其中含有 10 mM EDTA（Tris-EDTA 溶液）。将混合材料转移到无菌的 15 mL 细胞培养锥形管中并置于冰上。
      注意:此时，病毒制备可以无限期地在-80°C下冷冻。
5. 制备细胞裂解物
   1. 执行三个冻融循环以破坏剩余的细胞，从而进一步释放形成的病毒颗粒。通过将管浸入液氮（~30-60秒）中，在步骤1.4.4中冷冻混合的材料。通过将试管置于37°C培养箱中快速解冻样品。涡旋样品15秒，然后重复快速冷冻和解冻过程2倍。
      注意:病毒溶液可以在37°C的水浴中快速解冻，但要小心，因为温度波动会导致试管破裂，将病毒溶液释放到水浴中。为防止这种情况发生，请将含有病毒上清液的管放入较大的管中，然后将其置于水浴中。
   2. 使用 10 mL 移液器将三次冻融的细胞材料转移到超高速离心管中。将管中的材料在~18，500× g的4°C超高速离心机下离心30分钟。
   3. 用 10 mL 移液管回收 ~7 mL 富含病毒的上清液，并将其转移到 15 mL 锥形管中。将样品保留在冰上，直到下一步。
      注意:此时，请考虑保留未纯化的病毒上清液的等分试样作为开始新病毒制备的前导码（或作为备份）。将此等分试样储存在-80°C。
6. 使用密度梯度离心分离和纯化病毒。
   1. 在 12 mL PET 薄壁透明超速离心管（参见 材料表）或等效物中制备不连续的 CsCl 梯度。使用配备 18 G 针头的 3 mL 注射器小心地将 2.5 mL 的 1.4 g/mL CsCl 溶液引入试管底部，然后使用新的注射器/针头将其与 2.5 mL 的 1.25 g/mL CsCl 溶液分层。
      注意:将溶液直接滴在预先存在的层上会导致大量不必要的混合。相反，将针头的斜面部分放在管的边缘，然后非常缓慢地按压注射器柱塞，在溶液充满管时提高针头的位置。
   2. 使用 10 mL 注射器以类似的方式将 ~7 mL 病毒上清液加载到梯度顶部。如果病毒上清液和试管顶部之间的空间超过 2-3 mm，则添加额外的 Tris-EDTA 溶液以填充试管，直到仅剩 2-3 mm 的空间。
   3. 制作类似制备的平衡管，其中包含CsCl层，但用Tris-EDTA溶液代替病毒上清液。
      注意:两个试管必须具有相同的重量（和相似的密度），以防止超速离心机中出现潜在的危险不平衡负载情况。
7. 使用速率区间超速离心分离病毒。
   1. 将步骤 1.6.2-1.6.3 中形成的梯度加载到 SW41 转子或等效产品的铲斗中。拧入桶盖，将转子放入超速离心机（预冷至4°C），并在~150，000× g下离心1小时。
   2. 在离心过程中，平衡下面步骤1.9.1中描述的色谱柱。
8. 恢复分离的病毒颗粒
   1. 在离心步骤结束时，小心地将桶从转子上拆下，并在细胞培养罩中取下桶盖，然后取出试管并将其放入架子中。
   2. 收集漂浮在 1.25 g/mL 和 1.4 g/mL CsCl 溶液之间界面处的富含病毒颗粒的条带状材料。将含有梯度的试管放在细胞培养皿的下半部分（将捕获任何溢出的材料），使用连接到 3 mL 注射器的 1 英寸 18 G 针头小心地刺穿管，就在带状病毒下方。缓慢吸出病毒，通常在~1 mL中回收。
   3. 从试管中取出针头，这将导致梯度中的剩余物质从试管流出到细胞培养皿的下半部分（任何液体都应被视为危险废物）。
   4. 将注射器中的病毒溶液转移到冰上的无菌微量离心管中。
      注意:在此步骤中恢复病毒时，请将针头定位，使针头的管腔朝上，针头开口在富含病毒的带子下方几毫米处。避免被组装不当的病毒细带污染，有时在带状病毒上方2-3毫米处观察到（参见 图1A中的黑色细箭头）。
9. 通过凝胶过滤从样品中去除CsCl。
   1. 用含有 10% （v/v） 甘油的 50 mL 0.2 μm 无菌过滤 PBS 平衡夹在支撑架上的 PD-10 色谱柱（预填充有 Sephadex G-25M）。
      注意:初始平衡步骤需要2-3小时才能完成，并且是确保制造商用于稳定色谱柱的防腐剂完全洗蚀所必需的。
   2. 让洗涤液退到筛板下方（柱介质顶部的白色物质保护盘），然后小心地将步骤1.8中收集的纯化病毒溶液转移到色谱柱顶部。让富含病毒的溶液退到筛板下方，然后开始用PBS-甘油填充色谱柱。
      注意:筛板的一个功能是防止色谱柱干涸。因此，在向色谱柱中添加更多洗脱液之前，可以容忍短暂的延迟。
   3. 将洗脱液收集在 12 个无菌微量离心管中，每级分 0.5 mL。
10. 确定病毒产量。
    1. 使用分光光度法测定峰值病毒级分。在PBS中制备每个级分的1:100稀释度，并在分光光度计中测量OD₂₆₀ ，单独使用1:100稀释的缓冲液作为空白。病毒颗粒应在空隙体积中洗脱，从部分 6 左右开始。合并包含最高OD₂₆₀ 读数的馏分。
    2. 对混合的病毒级分进行1:100稀释，并重新测量OD₂₆₀。使用以下公式计算病毒颗粒的最终浓度和合并级分中的IVP数量:每毫升病毒颗粒= OD_260×100（这校正了稀释因子），×10¹²。一般估计是1%的病毒颗粒是IVP，因此:IVP/mL = OD 260 × 100 × 10 10或IVP/μL = OD₂₆₀ ×^{100 × 10 7}。
11. 将混合的病毒级分试样（含有5 x 10⁷ 至1 x 10^{8 IVP} ）放入无菌微量离心管或冷冻管中。将样品储存在-80°C。

2.啮齿动物膀胱的转导

注意:如果该技术不熟悉，建议一次转导的动物数量限制在2-4只。这可以通过错开每只动物的开始时间来实现，特别是在步骤2.2中的洗涤剂处理期间，然后在步骤2.3中进行病毒孵育。经验丰富的研究人员一次最多可以转导六只动物。

1. 膀胱导尿
   1. 使用带有附加鼻锥的蒸发器麻醉雌性C57Bl / 6J小鼠（通常为8-10周龄，~20-25g）或雌性Sprague Dawley大鼠（通常为2-3个月大，~250g）。校准蒸发器以产生3.0%（v / v）异氟烷，小鼠97%（v / v）O 2或4.0%（v / v）异氟烷，大鼠96%（v / v）O₂。通过确保动物对脚趾夹伤没有反应（通常在 1-2 分钟后）来确认动物已麻醉。
   2. 通过将动物放在加热垫上来保持动物的体温。在整个转导方案中监测动物，以确保动物被麻醉并且在此过程中不会感到任何疼痛。
   3. 将异氟醚降低至小鼠的1.5%（v / v）或大鼠的2.0%（v / v），并在方案期间将动物保持在麻醉状态。
   4. 为防止将空气引入膀胱，请使用移液器将IV导管的塑料导管部分（见 材料表）和相关轮毂与无菌PBS填充。
   5. 在动物仰卧位的情况下，用70%的酒精擦拭外道，然后将无菌导管插入外鼻道，然后插入尿道，然后插入膀胱。
      1. 要执行此任务，请使用细镊子轻轻抓住形成外鼻道的组织并将其垂直伸出，远离动物。用另一只手，小心地将导管垂直插入尿道口（阴道口上方的一堆肉）约3-4毫米。然后，由于尿道弯曲，将插入外道的导管朝动物的尾部降低，这使其更容易进入通过耻骨下方的尿道部分，并最终进入膀胱
         .注意:特别是在小鼠的情况下，导管可能太长，不应超过1.0-1.1厘米插入动物体内。否则，膀胱粘膜将随之受损。为防止这种情况，请在导管尖端下方~1厘米处标记导管，然后不要将导管插入超出此标记的位置。
   6. 让膀胱中的尿液泄漏出来。通过执行 Credé 的动作去除任何残留尿液:按摩并轻轻按压下腹部的膀胱凸起。
2. 通过用洗涤剂溶液处理尿路上皮细胞来接受转导。
   1. 通过将装有PBS的无菌1mL注射器连接到导管枢纽来洗涤小鼠或大鼠膀胱。将 100 μL 无菌 PBS 注入小鼠膀胱（或大鼠膀胱为 450 μL）。将注射器从导管接头上拆下，并允许PBS引流。如有必要，执行 Crede 的动作以去除多余的膀胱液。
   2. 使用无菌 1 mL 注射器将 100 μL 0.1% （w/v） N-十二烷基-β-D-麦芽糖苷 （DDM）（溶解在 PBS 中并经 0.2 μm 过滤器灭菌）滴入小鼠膀胱。通过将注射器留在原位，将DDM保留在膀胱中10分钟。在大鼠中，DDM的体积增加到450μL。
   3. 通过拆下注射器并使其排出，从膀胱中取出DDM。如有必要，执行克里德的动作。
3. 将病毒引入膀胱。
   1. 将无菌 1 mL 注射器连接到导管枢纽，并将 0.5 x 10^{7 至} 1 x 10⁸ IVP 腺病毒（在步骤 1 中制备），用 100 μL 无菌 PBS 稀释（小鼠）或 450 μL （大鼠）注入膀胱。将注射器连接到导管上，以防止病毒溶液逸出。
   2. 30分钟后，拆下注射器，让病毒溶液将膀胱排空到一次性垫子上。用吸收性湿巾吸干任何残留的病毒溶液，然后丢弃垫子并擦拭生物危害废物。
      注意:甘油具有细胞毒性。因此，滴注小鼠体内病毒溶液的最大体积限制为5μL（当稀释到100μLPBS中时，最终甘油浓度为~0.5%[v / v]）。此外，可以通过增加滴注IVP的数量并将病毒孵育期延长至45分钟来提高转导效率。
   3. 可选步骤:可以按照上述步骤2.2.1所述用PBS冲洗膀胱;但是，这不是必需的。
4. 让动物恢复。
   1. 停止异氟醚的流动，让动物恢复并完全移动，然后再将其放回笼子，特别是如果动物是集体饲养的。
      注意:由于病毒转导 本身 不会引起可观察到的下尿路症状或疼痛，因此通常不需要术后治疗。但是，如果编码的转基因有毒，则可能需要根据机构的要求进行术后镇痛或抗生素治疗。
5. 使用mRNA原位杂交，蛋白质印迹或免疫荧光⁹，^10，23等方法分析处理后12-72小时转基因表达的效果（参见代表性结果）。

结果

病毒制备
通过密度梯度离心纯化病毒的示例如图 1A所示。浅粉红色条带位于上样细胞材料和1.25 g/mL CsCl层的界面处，主要由破碎的细胞及其碎片组成（参见 图1A中的洋红色箭头）。它的粉红色来自从方案中步骤1.5中携带的少量培养基。目标病毒颗粒呈乳白色条带，位于 1.25 g/mL CsCl 和 1.40 g/mL CsCl 溶液的界面处（参见 图 1A

讨论

虽然Ramesh等人专注于开发使用腺病毒转导治疗膀胱癌的策略¹⁸，但最近的报告表明这些技术在研究正常尿路上皮生物学/生理学和病理生理学的实用性10，¹⁸，¹⁹，^20，21.这种方法的重要特征包括:（i）在整个啮齿动物膀胱壁中，只有尿路上皮被转导10，...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL pipette	Corning Costar (Millipore Sigma)	CLS4488	sterile, serological pipette, individually wrapped
12 mL ultracentrifuge tube	ThermoFisher	06-752	PET thinwall ultracentrifuge tube
15 mL conical centrifuge tube	Falcon (Corning)	352097	sterile
18 G needle	BD	305196	18 G x 1.5 in needle
20 mL pipette	Corning Costar (Millipore Sigma)	CLS4489	sterile, serological pipette, individually wrapped
50 mL conical centrifuge tube	Falcon (Corning)	352098	sterile
5 mL pipette	Corning Costar (Millipore Sigma)	CLS4487	sterile, serological pipette, individually wrapped
Cavicide	Henry Schein	6400012	Anti-viral solution
Cell culture dish - 15 cm	Falcon (Corning)	353025	sterile, tissue-culture treated  (150 mm x 25 mm dish)
Cell scraper	Sarstedt	893.1832	handle length 24 cm, blade length 1.7 cm
CsCl	Millipore Sigma	C-4306	Molecular Biology grade ≥ 98%
DMEM culture medium (high glucose)	Gibco (ThermoFisher)	11965092	with 4.5 g/L glucose + L-glutamine + phenol red
EDTA	Millipore Sigma	EDS	Bioiultra grade ≥ 99%
Fetal bovine serum	Hyclone (Cytiva)	SH30070.03	defined serum
Glass pipette	Fisher Scientific	13-678-20A	5.75 in glass pipette, autoclaved
Glycerol	Millipore Sigma	G-5516	Molecular Biology grade ≥ 99%
HEK293 cells	ATCC	CRL-3216	HEK293T cells are a variant of HEK293 cells that express the SV40 large T-antigen
Isoflurane	Covetrus	29405
IV catheter - mouse	Smith Medical Jelco	3063	24 G x 3/4 in Safety IV catheter  radiopaque
IV catheter - rat	Smith Medical Jelco	3060	22 G x 1 in Safety IV catheter radiopaque
KCl	Millipore Sigma	P-9541	Molecular Biology grade ≥ 99%
KH2PO4	Millipore Sigma	P5655	Cell culture grade  ≥ 99%
Na2HPO4•7 H2O	Millipore Sigma	431478	≥ 99.99%
NaCl	Millipore Sigma	S3014	Molecular Biology grade ≥ 99%
N-dodecyl-β-D-maltoside	Millipore Sigma	D4641	≥ 98%
Nose cone for multiple animals	custom designed		commercial options include one from Parkland Scientific (RES3200)
PD-10 column	GE Healthcare	17-085-01	Prepacked columns filled ith Sephadex G-25M
Penicillin/streptomycin antibiotic (100x)	Gibco (ThermoFisher)	15070063	100x concentrated solution
Spectrophotometer	Eppendorf	BioPhotometer
Stand and clamp	Fisher Scientific	14-679Q and 05-769-8FQ	available from numerous suppliers
Sterile filter unit	Fisher Scientific (Nalgene)	09-740-65B	0.2 µm rapid-flow filter unit (150 mL)
Sterile filter unit 0.2 µm (syringe)	Fisher Scientific	SLGV004SL	Millipore Sigma Milex 0.22 µm filter unit that attaches to syringe
Super speed centrifuge	Eppendorf	5810R	with Eppendorf F34-6-38 fixed angle rotor (12,000 rpm)
Syringe (1 mL)	BD	309628	1-mL syringe Luer-lok tip - sterile
Syringe (3 mL)	BD	309656	3-mL syringe slip tip - sterile
Table-top centrifuge (low speed)	Eppendorf	5702	with swinging bucket rotor
Transfer pipettes	Fisher Scientific	13-711-9AM	polyethylene 3.4 mL transfer pipette
Tris-base	Millipore Sigma	648310-M	Molecular Biology grade
TrypLE select protease solution	Gibco (ThermoFisher)	12604013	TrypLE express enzyme (1x), no phenol red
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima L-80 XP	with Beckman SW41 rotor (41,000 rpm)
Vaporizer	General Anesthetic Services, Inc.	Tec 3	Isoflurane vaporizer
Vortex Mixer	VWR	10153-838	analog vortex mixer