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描述了用于生成大量重组腺病毒的方法,然后可用于转导天然啮齿动物尿路上皮,从而表达转基因或下调内源性基因产物。
除了形成高阻力屏障外,肾盂、输尿管、膀胱和近端尿道内壁的尿路上皮还被假设为感知其环境信息并将其传递到下层组织,从而促进排尿功能和行为。尿路上皮屏障或其感觉/换能器功能的破坏可导致疾病。由于缺乏改变尿路上皮中基因和蛋白质表达的简单策略,研究这些复杂事件受到阻碍。这里描述了允许研究人员产生大量高滴度腺病毒的方法,然后可以使用这些病毒以相对直接的方式高效转导啮齿动物尿路上皮。cDNA和小干扰RNA都可以使用腺病毒转导表达,并且可以在12小时至几天后评估转基因表达对尿路上皮功能的影响。这些方法对使用小鼠或大鼠动物模型研究正常和异常尿路上皮生物学具有广泛的适用性。
尿路上皮是排列在肾盂、输尿管、膀胱和近端尿道1 上的特化上皮。它包括三个层:一层高度分化和极化的通常双核伞状细胞,其顶端表面沐浴在尿液中;具有双核转运扩增细胞群的中间细胞层,可产生浅表伞形细胞以应对其急性丢失;以及单层基底细胞,其中一部分作为干细胞发挥作用,可以再生整个尿路上皮以应对慢性损伤。伞状细胞主要负责形成高抗性尿路上皮屏障,其组成部分包括对水和溶质通透性低的顶膜(富含胆固醇和脑苷脂)和高抗性顶端连接复合物(由紧密连接、粘附连接、桥粒和相关肌动球蛋白环组成)1.伞状细胞的顶端表面及其连接环在膀胱充盈过程中均膨胀,并在排尿后迅速恢复到预充盈状态1,2,3,4,5。除了在屏障功能中的作用外,尿路上皮还被假设具有感觉和换能器功能,使其能够感知细胞外环境的变化(例如拉伸),并通过释放介质(包括ATP,腺苷和乙酰胆碱)将此信息传递到下层组织,包括尿路上皮下传入神经过程6,7,
涉及产生腺病毒的实验,需要BSL2认证,是在匹兹堡大学环境健康与安全办公室和机构生物安全委员会的批准下进行的。所有进行的动物实验,包括腺病毒转导(需要ABSL2认证),均按照《关于人道护理和实验动物的公共卫生服务政策和动物福利法》的相关指南/规定进行,并得到匹兹堡大学机构动物护理和使用委员会的批准。所有涉及重组病毒的手术均应佩戴手套、护目镜和适当的服装。任何液体或固体废物都应按以下说明进行处理。转导后动物的垫料以及由此产生的任何动物尸体应作为生物危害材料处理,并根据机构政策进行处理。
1. 高滴度腺病毒储液的制备
注意:啮齿动物膀胱的有效转导取决于纯化和浓缩病毒储液的使用,通常每μL1 x 107 至1 x 108 感染性病毒颗粒(IVP)。该协议的这一部分侧重于从现有病毒制剂中生成高滴度腺病毒储液。所有步骤都应使用无菌试剂和工具在细胞培养罩中进行。虽然目前使用的腺病毒可用菌株存在复制缺陷,但大多数机构需要批准才能使用腺病毒和重组DNA。这通常包括将细胞培养室指定为BSL2批准的设施,以生产和扩增腺病毒。一些一般注意事项包括在病毒产生和纯化的所有阶段使用口罩、护目镜、手套和适当的服装。进行离心时,如果离心管没有紧密配合的盖子,建议使用安全帽。所有非一次性材料,包括可能被污染的离心机安全盖、瓶子和转子,都用抗病毒溶液处理(见 材料表<....
病毒制备
通过密度梯度离心纯化病毒的示例如图 1A所示。浅粉红色条带位于上样细胞材料和1.25 g/mL CsCl层的界面处,主要由破碎的细胞及其碎片组成(参见 图1A中的洋红色箭头)。它的粉红色来自从方案中步骤1.5中携带的少量培养基。目标病毒颗粒呈乳白色条带,位于 1.25 g/mL CsCl 和 1.40 g/mL CsCl 溶液的界面处(参见 图 1A
虽然Ramesh等人专注于开发使用腺病毒转导治疗膀胱癌的策略18,但最近的报告表明这些技术在研究正常尿路上皮生物学/生理学和病理生理学的实用性10,18,19,20,21.这种方法的重要特征包括:(i)在整个啮齿动物膀胱壁中,只有尿路上皮被转导10,
作者没有什么可透露的。
这项工作得到了P30DK079307(致M.G.D.),NIH拨款R01DK119183(致G.A.和MDC),NIH拨款R01DK129473(致GA),美国泌尿外科协会职业发展奖和温特斯基金会资助(致NM)的支持,由匹兹堡肾脏研究中心的细胞生理学和模式生物肾脏成像核心(P30DK079307), 以及 S10OD028596(致 G.A.),资助购买用于捕获本手稿中呈现的一些图像的共聚焦系统。
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
10 mL pipette | Corning Costar (Millipore Sigma) | CLS4488 | sterile, serological pipette, individually wrapped |
12 mL ultracentrifuge tube | ThermoFisher | 06-752 | PET thinwall ultracentrifuge tube |
15 mL conical centrifuge tube | Falcon (Corning) | 352097 | sterile |
18 G needle | BD | 305196 | 18 G x 1.5 in needle |
20 mL pipette | Corning Costar (Millipore Sigma) | CLS4489 | sterile, serological pipette, individually wrapped |
50 mL conical centrifuge tube | Falcon (Corning) | 352098 | sterile |
5 mL pipette | Corning Costar (Millipore Sigma) | CLS4487 | sterile, serological pipette, individually wrapped |
Cavicide | Henry Schein | 6400012 | Anti-viral solution |
Cell culture dish - 15 cm | Falcon (Corning) | 353025 | sterile, tissue-culture treated (150 mm x 25 mm dish) |
Cell scraper | Sarstedt | 893.1832 | handle length 24 cm, blade length 1.7 cm |
CsCl | Millipore Sigma | C-4306 | Molecular Biology grade ≥ 98% |
DMEM culture medium (high glucose) | Gibco (ThermoFisher) | 11965092 | with 4.5 g/L glucose + L-glutamine + phenol red |
EDTA | Millipore Sigma | EDS | Bioiultra grade ≥ 99% |
Fetal bovine serum | Hyclone (Cytiva) | SH30070.03 | defined serum |
Glass pipette | Fisher Scientific | 13-678-20A | 5.75 in glass pipette, autoclaved |
Glycerol | Millipore Sigma | G-5516 | Molecular Biology grade ≥ 99% |
HEK293 cells | ATCC | CRL-3216 | HEK293T cells are a variant of HEK293 cells that express the SV40 large T-antigen |
Isoflurane | Covetrus | 29405 | |
IV catheter - mouse | Smith Medical Jelco | 3063 | 24 G x 3/4 in Safety IV catheter radiopaque |
IV catheter - rat | Smith Medical Jelco | 3060 | 22 G x 1 in Safety IV catheter radiopaque |
KCl | Millipore Sigma | P-9541 | Molecular Biology grade ≥ 99% |
KH2PO4 | Millipore Sigma | P5655 | Cell culture grade ≥ 99% |
Na2HPO4•7 H2O | Millipore Sigma | 431478 | ≥ 99.99% |
NaCl | Millipore Sigma | S3014 | Molecular Biology grade ≥ 99% |
N-dodecyl-β-D-maltoside | Millipore Sigma | D4641 | ≥ 98% |
Nose cone for multiple animals | custom designed | commercial options include one from Parkland Scientific (RES3200) | |
PD-10 column | GE Healthcare | 17-085-01 | Prepacked columns filled ith Sephadex G-25M |
Penicillin/streptomycin antibiotic (100x) | Gibco (ThermoFisher) | 15070063 | 100x concentrated solution |
Spectrophotometer | Eppendorf | BioPhotometer | |
Stand and clamp | Fisher Scientific | 14-679Q and 05-769-8FQ | available from numerous suppliers |
Sterile filter unit | Fisher Scientific (Nalgene) | 09-740-65B | 0.2 µm rapid-flow filter unit (150 mL) |
Sterile filter unit 0.2 µm (syringe) | Fisher Scientific | SLGV004SL | Millipore Sigma Milex 0.22 µm filter unit that attaches to syringe |
Super speed centrifuge | Eppendorf | 5810R | with Eppendorf F34-6-38 fixed angle rotor (12,000 rpm) |
Syringe (1 mL) | BD | 309628 | 1-mL syringe Luer-lok tip - sterile |
Syringe (3 mL) | BD | 309656 | 3-mL syringe slip tip - sterile |
Table-top centrifuge (low speed) | Eppendorf | 5702 | with swinging bucket rotor |
Transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9AM | polyethylene 3.4 mL transfer pipette |
Tris-base | Millipore Sigma | 648310-M | Molecular Biology grade |
TrypLE select protease solution | Gibco (ThermoFisher) | 12604013 | TrypLE express enzyme (1x), no phenol red |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima L-80 XP | with Beckman SW41 rotor (41,000 rpm) |
Vaporizer | General Anesthetic Services, Inc. | Tec 3 | Isoflurane vaporizer |
Vortex Mixer | VWR | 10153-838 | analog vortex mixer |
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