Expression de transgènes dans l’urothélium vésical natif par transduction médiée par adénovirus

Résumé

Des méthodes sont décrites pour la génération de grandes quantités d’adénovirus recombinants, qui peuvent ensuite être utilisés pour transduire l’urothélium de rongeur natif permettant l’expression de transgènes ou la régulation négative de produits géniques endogènes.

Résumé

En plus de former une barrière à haute résistance, l’urothélium qui tapisse le bassinet du rein, les uretères, la vessie et l’urètre proximal est supposé détecter et transmettre des informations sur son environnement aux tissus sous-jacents, favorisant ainsi la fonction et le comportement de miction. La perturbation de la barrière urothéliale, ou de sa fonction sensorielle/transductrice, peut entraîner une maladie. L’étude de ces événements complexes est entravée par le manque de stratégies simples pour modifier l’expression des gènes et des protéines dans l’urothélium. Les méthodes décrites ici permettent aux chercheurs de générer de grandes quantités d’adénovirus à titre élevé, qui peuvent ensuite être utilisés pour transduire l’urothélium des rongeurs avec une grande efficacité et d’une manière relativement simple. Les ADNc et les petits ARN interférents peuvent être exprimés par transduction adénovirale, et l’impact de l’expression transgénique sur la fonction urothéliale peut être évalué 12 h à plusieurs jours plus tard. Ces méthodes ont une large applicabilité aux études de biologie urothéliale normale et anormale utilisant des modèles animaux de souris ou de rats.

Introduction

L’urothélium est l’épithélium spécialisé qui tapisse le bassinet du rein, les uretères, la vessie et l’urètre proximal¹. Il comprend trois strates : une couche de cellules parapluies hautement différenciées et polarisées, souvent binucléées, dont les surfaces apicales baignent dans l’urine ; une couche cellulaire intermédiaire avec une population de cellules binucléées amplifiant le transit qui peut donner naissance à des cellules parapluies superficielles en réponse à leur perte aiguë; et une seule couche de cellules basales, dont un sous-ensemble fonctionne comme des cellules souches qui peuvent régénérer la totalité de l’urothélium en réponse à une lésion chronique. Les cellules parapluies sont principalement responsables de la formation de la barrière urothéliale à haute résistance, dont les composants comprennent une membrane apicale (riche en cholestérol et en cérébrosides) avec une faible perméabilité à l’eau et aux solutés, et un complexe jonctionnel apical à haute résistance (composé de jonctions serrées, de jonctions adhérentes, de desmosomes et d’un cycle actomyosine associé)¹ . La surface apicale de la cellule parapluie et son anneau jonctionnel se dilatent pendant le remplissage de la vessie et reviennent rapidement à leur état pré-rempli après l’évacuation de 1,2,3,4,5. En plus de son rôle dans la fonction de barrière, on suppose également que l’urothélium a des fonctions sensorielles et transductrices qui lui permettent de détecter les changements dans le milieu extracellulaire (p. ex. étirement) et de transmettre cette information par la libération de médiateurs (y compris l’ATP, l’adénosine et l’acétylcholine) aux tissus sous-jacents, y compris les processus nerveux afférents sous-urothéliaux ^6,7,8 . Des preuves récentes de ce rôle sont trouvées chez les souris dépourvues d’expression urothéliale de Piezo1 et Piezo2, ce qui entraîne une altération de la fonction de miction⁹. De plus, les rats surexprimant la protéine CLDN2 formant des pores à jonction serrée dans la couche cellulaire parapluie développent une inflammation et une douleur analogues à celles observées chez les patients atteints de cystite interstitielle¹⁰. On suppose que la perturbation de la fonction sensorielle/transductrice urothéliale ou de la barrière peut contribuer à plusieurs troubles de la vessie ^6,11.

Une meilleure compréhension de la biologie de l’urothélium dans les états normaux et pathologiques dépend de la disponibilité d’outils qui permettront aux chercheurs de réguler facilement à la baisse l’expression des gènes endogènes ou de permettre l’expression des transgènes dans le tissu natif. Alors qu’une approche pour réguler à la baisse l’expression des gènes consiste à générer des souris knockout urothéliales conditionnelles, cette approche dépend de la disponibilité de souris avec des allèles floxés, nécessite beaucoup de travail et peut prendre des mois ou des années pour compléter¹². Il n’est donc pas surprenant que les chercheurs aient mis au point des techniques pour transfecter ou transduire l’urothélium, ce qui peut conduire à des résultats sur une échelle de temps plus courte. Les méthodes publiées pour la transfection comprennent l’utilisation de lipides cationiques¹³, d’oligodésoxynucléotides phosphorothioés antisens¹⁴ ou d’acides nucléiques antisens attachés à la protéine TAT du VIH pénétrant le peptide^{11-mère 15}. Cependant, ce protocole met l’accent sur l’utilisation de la transduction médiée par l’adénoviral, une méthodologie bien étudiée qui est efficace pour la livraison de gènes à un large éventail de cellules, qui a été testée dans de nombreux essais cliniques et, plus récemment, a été utilisée pour administrer l’ADNc codant pour la protéine de capside COVID-19 aux receveurs d’une variante du vaccin COVID-19^{16, 17}. Pour une description plus complète du cycle de vie de l’adénovirus, des vecteurs adénoviraux et des applications cliniques des adénovirus, le lecteur est invité à consulter la référence¹⁷.

Une étape importante dans l’utilisation des adénovirus pour transduire l’urothélium a été un rapport de Ramesh et al. qui a montré de courts prétraitements avec des détergents, y compris le N-dodécyl-β-D-maltoside (DDM) considérablement amélioré la transduction de l’urothélium par un adénovirus codant β-galactosidase¹⁸. En utilisant cette étude de preuve de principe comme guide, la transduction médiée par adénoviral de l’urothélium a maintenant été utilisée pour exprimer une variété de protéines, y compris les GTPases de la famille Rab, les facteurs d’échange guanine-nucléotide, les fragments moteurs de myosine, les claudines associées à la jonction serrée formant des pores et ADAM17 10,19,20,21,22 . La même approche a été adaptée pour exprimer de petits ARN interférents (siRNA), dont les effets ont été sauvés par la co-expression de variantes résistantes au siRNA du transgène²². Le protocole décrit ici comprend des méthodes générales pour générer de grandes quantités d’adénovirus hautement concentrés, une exigence pour ces techniques, ainsi que des adaptations des méthodes de Ramesh et ^al.18 pour exprimer les transgènes dans l’urothélium avec une grande efficacité.

Protocole

Les expériences impliquant la génération d’adénovirus, qui nécessite une certification BSL2, ont été réalisées avec l’approbation des bureaux de santé et de sécurité environnementales de l’Université de Pittsburgh et du comité institutionnel de biosécurité. Toutes les expériences sur les animaux effectuées, y compris la transduction adénovirale (qui nécessite une certification ABSL2), ont été effectuées conformément aux directives / règlements pertinents de la politique du service de santé publique sur les soins et l’utilisation sans cruauté des animaux de laboratoire et de la loi sur le bien-être des animaux, et sous l’approbation du comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université de Pittsburgh. Des gants, une protection oculaire et une tenue appropriée sont portés pour toutes les procédures impliquant des virus recombinants. Tout déchet liquide ou solide doit être éliminé comme décrit ci-dessous. La litière des animaux après la transduction, et toute carcasse d’animaux qui en résulte, doivent être traitées comme des matières biologiques dangereuses et éliminées conformément aux politiques de l’établissement.

1. Préparation des stocks d’adénovirus à titre élevé

NOTE: La transduction efficace des vessies de rongeurs dépend de l’utilisation de souches virales purifiées et concentrées, généralement 1 x 10⁷ à 1 x 10⁸ particules virales infectieuses (IVP) par μL. Cette partie du protocole est axée sur la génération de stocks d’adénovirus à titre élevé à partir de préparations virales existantes. Toutes les étapes doivent être effectuées dans une hotte de culture cellulaire à l’aide de réactifs et d’outils stériles. Alors que les souches disponibles d’adénovirus utilisées aujourd’hui sont défectueuses de réplication, la plupart des institutions exigent une approbation pour utiliser des adénovirus et de l’ADN recombinant. Cela comprend souvent la désignation d’une salle de culture cellulaire en tant qu’installation approuvée par BSL2 pour produire et amplifier les adénovirus. Certaines considérations générales comprennent l’utilisation de masques, de protections oculaires, de gants et de vêtements appropriés à toutes les étapes de la production et de la purification du virus. Lors de la centrifugation, les capuchons de sécurité sont recommandés si les tubes de centrifugation manquent de bouchons étanches. Tous les matériaux non jetables, y compris les bouchons de sécurité des centrifugeuses, les bouteilles et les rotors potentiellement contaminés, sont traités avec une solution antivirale (voir le tableau des matériaux), puis rincés à l’eau ou à l’éthanol à 70 %. Les déchets liquides sont traités en ajoutant de l’eau de Javel à une concentration finale de 10 % (v/v). L’élimination de ces déchets liquides dépendra des politiques institutionnelles. Les déchets solides sont généralement éliminés dans des déchets biologiques dangereux.

1. Culture de cellules HEK293T
   1. Décongeler un flacon congelé de cellules HEK293T dans un bain-marie à 37 °C et utiliser une pipette de 5 ml pour transférer les cellules dans une boîte de culture cellulaire de 15 cm de diamètre. À l’aide d’une pipette de 25 mL, ajouter lentement 20 mL de milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco contenant 10 % (v/v) de sérum fœtal bovin et d’antibiotique pénicilline/streptomycine (DMEM-FBS-PS) dans la boîte. Incuber les cellules dans un incubateur de culture cellulaire à 37 °C gazé avec 5% (v/v) de CO₂ jusqu’à ce qu’elles atteignent 80%-90% de confluence (~2 x 10⁷ cellules).
   2. À l’aide d’une pipette en verre fixée à une source sous vide, aspirer le milieu, puis rincer les cellules en transférant 20 mL de PBS stérile (2,7 mM KCl, 1,5 mM KH₂PO 4, 136,9 mM NaCl et 8,9 mM Na2_HPO4) dans la boîte à l’aide d’une pipette de 25 mL. Aspirer le PBS usé, puis utiliser une pipette de 5 mL pour transférer 3 mL de solution tiède (37 °C) de protéinase (voir le tableau des matières) dans la boîte, en incubant la capsule dans l’incubateur de culture cellulaire jusqu’à ce que les cellules se détachent (~3-4 min).
      REMARQUE: Une protéolyse efficace peut être mieux évaluée en inclinant lentement la boîte d’avant en arrière à la recherche de la libération des cellules de toutes les parties de la boîte dans le liquide en mouvement. Les cellules HEK293T sont sensibles au traitement prolongé par la protéinase et mourront si elles sont laissées plus de quelques minutes dans une solution de protéinase.
   3. Utilisez une pipette de 10 mL pour transférer 7 mL de DMEM-FBS-PS dans la boîte des cellules détachées, puis utilisez la même pipette pour aspirer les cellules et le milieu. Transférer les cellules en suspension dans un tube conique de 50 mL, puis granuler les cellules en centrifugeant la suspension dans une centrifugeuse clinique à basse vitesse à 200 x g pendant 5 min. Aspirer le surnageant à l’aide d’une pipette en verre fixée à une source de vide. Utilisez une pipette de 25 mL pour remettre en suspension la pastille de cellule dans 15 mL de DMEM-FBS-PS.
   4. Ajouter 1 mL de la suspension cellulaire à chacune des quinze boîtes de 15 cm contenant 19 mL de DMEM-FBS-PS.
   5. Cultiver les cellules dans un incubateur de culture tissulaire jusqu’à ce qu’elles atteignent 85% à 90% de confluence (~3-4 jours).
2. Préparer une solution virale diluée
   1. Ajouter ~1,5 x 10 9 à 3 x 10⁹ IVP d’un stock de virus existant (5-10 IVP/cellule) dans un tube conique de 50 mL rempli de 45 mL de DMEM sans FBS ou antibiotiques.
      REMARQUE: Il est possible d’utiliser une concentration plus faible du virus (1-5 IVP / cellule); Cependant, il faudra plus de temps pour que la production de virus s’ensuive.
3. Infectez les cellules cultivées avec le virus.
   1. À l’aide d’une pipette en verre fixée à une source de vide, aspirer le milieu des cellules presque confluentes à l’étape 1.1.5.
   2. Utiliser une pipette de 25 mL pour transférer 3,0 mL de solution virale diluée (préparée à l’étape 1.2.1) dans chaque boîte de culture cellulaire. Ensuite, utilisez une pipette de 10 mL pour ajouter 7,0 mL de milieu DMEM (sans FBS ou antibiotiques) à chaque boîte. Incuber pendant 60 minutes dans un incubateur de culture cellulaire, puis ajouter 10 ml de DMEM contenant 20% (v/v) FBS et 2x PS à chaque boîte.
      REMARQUE: L’utilisation de l’une des 15 boîtes comme plaque de contrôle (dans laquelle le virus n’est pas ajouté) facilite l’identification de l’arrondi cellulaire induit par le virus et de la mort dans les cellules infectées à l’étape suivante.
   3. Incuber les cellules dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 2 à 4 jours jusqu’à ce que la majorité d’entre elles commencent à s’arrondir et que >60% des cellules se soient détachées.
      REMARQUE: Si vous utilisez un titre inférieur du virus, la mort cellulaire peut prendre jusqu’à une semaine. Si la mort cellulaire ne se produit pas dans la semaine, il est probable que le processus devra être répété en utilisant un titre plus élevé du virus.
4. Récupérer le virus des lysats cellulaires
   1. Utilisez un grattoir de cellules pour gratter le fond de chaque boîte, libérant les cellules attachées dans le milieu.
   2. À l’aide d’une pipette de 25 mL, recueillir et regrouper le milieu, les cellules et les débris cellulaires de chaque boîte de culture cellulaire dans un tube de culture cellulaire conique de 50 mL.
      REMARQUE: Pour économiser des ressources, le milieu de deux boîtes peut être combiné en un tube de 50 mL.
   3. Ensemencer le matériau cellulaire par centrifugation à l’aide d’une centrifugeuse de table à basse vitesse : 5 min à température ambiante à 3 000 x g. Utilisez une pipette en verre fixée à un dispositif à vide pour aspirer le surnageant.
   4. Utiliser une pipette de 10 mL, combinée à une trituration, pour regrouper toute la matière granulée obtenue dans un total de 7 mL de Tris-HCl 100 mM de pH 7,4 filtré stérile contenant 10 mM d’EDTA (solution de Tris-EDTA). Transférer le matériel mis en commun dans un tube conique de culture cellulaire stérile de 15 ml et le placer sur de la glace.
      REMARQUE: À ce stade, la préparation du virus peut être congelée à -80 ° C indéfiniment.
5. Préparer des lysats cellulaires
   1. Effectuer trois cycles de gel-décongélation pour perturber les cellules restantes et ainsi libérer davantage les particules virales formées. Congeler le matériau mélangé à l’étape 1.4.4 en immergeant le tube dans de l’azote liquide (~30-60 s). Décongeler rapidement l’échantillon en plaçant le tube dans un incubateur à 37 °C. Tourbillonner l’échantillon pendant 15 s, puis répéter la procédure de congélation et de décongélation rapides 2x supplémentaires.
      REMARQUE: La solution virale peut être rapidement décongelée à 37 ° C dans un bain-marie, mais la prudence est de mise car les variations de température peuvent provoquer la fissuration du tube, libérant la solution virale dans le bain-marie. Pour éviter que cela ne se produise, placez le tube contenant le surnageant viral dans un tube plus grand, qui est ensuite placé dans le bain-marie.
   2. Utilisez une pipette de 10 ml pour transférer le matériau cellulaire congelé trois fois dans un tube centrifuge ultrarapide. Centrifuger le matériau dans le tube pendant 30 min à 4 °C à une centrifugeuse à 4 °C à ~18 500 x g.
   3. Récupérez le surnageant riche en virus ~7 mL à l’aide d’une pipette de 10 mL et transférez-le dans un tube conique de 15 mL. Conservez l’échantillon sur la glace jusqu’à l’étape suivante.
      REMARQUE : À ce stade, envisagez de conserver une partie aliquote du surnageant viral non purifié comme préambule pour commencer une nouvelle préparation virale (ou comme sauvegarde). Conserver cette partie aliquote à -80 °C.
6. Isoler et purifier le virus par centrifugation à gradient de densité.
   1. Préparer un gradient discontinu de CsCl dans un tube à ultracentrifugation transparent à paroi mince PET de 12 ml (voir le tableau des matières) ou l’équivalent. Utilisez une seringue de 3 mL munie d’une aiguille de 18 G pour introduire délicatement 2,5 mL de solution de CsCl à 1,4 g/mL dans le fond du tube, puis utilisez une nouvelle seringue/aiguille pour la superposer avec 2,5 mL de solution de CsCl à 1,25 g/mL.
      REMARQUE: Laisser tomber des solutions directement sur une couche préexistante entraînera un mélange important et indésirable. Au lieu de cela, placez la partie biseautée de l’aiguille contre le bord du tube, puis appuyez très lentement sur le piston de la seringue, en augmentant la position de l’aiguille lorsque la solution remplit le tube.
   2. Chargez les ~7 mL de surnageant viral sur le dessus du gradient de la même manière à l’aide d’une seringue de 10 mL. S’il y a plus de 2-3 mm d’espace entre le surnageant viral et le haut du tube, ajouter une solution supplémentaire de Tris-EDTA pour remplir le tube jusqu’à ce qu’il ne reste que 2-3 mm d’espace.
   3. Faire un tube d’équilibre préparé de la même manière, contenant des couches de CsCl, mais remplaçant le surnageant viral par une solution de Tris-EDTA.
      NOTE: Les deux tubes doivent avoir des poids identiques (et des densités similaires) pour éviter une situation de charge déséquilibrée potentiellement dangereuse dans l’ultracentrifugeuse.
7. Isoler le virus à l’aide de l’ultracentrifugation à débit.
   1. Chargez les gradients formés aux étapes 1.6.2-1.6.3 dans les godets d’un rotor SW41 ou équivalent. Vissez les bouchons de godet, placez le rotor dans une ultracentrifugeuse (prérefroidi à 4 °C) et centrifugez pendant 1 h à ~150 000 x g.
   2. Pendant la centrifugation, équilibrer la colonne décrite à l’étape 1.9.1 ci-dessous.
8. Récupérer des particules virales isolées
   1. À la fin de l’étape de centrifugation, détachez soigneusement les godets du rotor et, dans une hotte de culture cellulaire, retirez les bouchons du godet, puis retirez les tubes et placez-les dans une grille.
   2. Recueillir le matériau à bandes, riche en particules virales, qui flotte à l’interface entre la solution de CsCl à 1,25 g/mL et 1,4 g/mL. En tenant le tube contenant le gradient sur la moitié inférieure d’une boîte de culture cellulaire (qui attrapera les matières renversées), utilisez une aiguille de 1 pouce de 18 G fixée à une seringue de 3 ml pour percer soigneusement le tube, juste en dessous du virus à bandes. Aspirez lentement le virus, qui est généralement récupéré dans ~ 1 mL.
   3. Retirez l’aiguille du tube, ce qui aura pour conséquence que le matériau restant dans le gradient s’écoulera du tube dans la moitié inférieure de la boîte de culture cellulaire (tout liquide doit être traité comme un déchet dangereux).
   4. Transférer la solution virale dans la seringue dans un tube microcentrifuge stérile sur de la glace.
      REMARQUE: Lors de la récupération du virus à cette étape, placez l’aiguille de manière à ce que la lumière de l’aiguille soit orientée vers le haut avec l’aiguille s’ouvrant quelques mm en dessous de la bande riche en virus. Éviter la contamination par la fine bande de virus mal assemblés qui est parfois observée à 2-3 mm au-dessus du virus à bandes (voir la fine flèche noire à la figure 1A).
9. Retirer CsCl de l’échantillon par filtration sur gel.
   1. Équilibrer une colonne-10 (préemballée avec Sephadex G-25M), fixée à un support de support, avec 50 mL de PBS filtré stérile de 0,2 μm contenant 10% (v/v) de glycérol.
      NOTE: L’étape d’équilibrage initiale prend 2-3 heures et est nécessaire pour assurer le lavage complet des agents de conservation utilisés par le fabricant pour stabiliser la colonne.
   2. Laisser la solution de lavage reculer sous la fritte (un disque protecteur de matériau blanc au sommet du milieu de la colonne), puis transférer délicatement la solution virale purifiée recueillie à l’étape 1.8 vers le haut de la colonne. Laissez la solution riche en virus reculer sous la fritte, puis commencez à remplir la colonne de PBS-glycérol.
      REMARQUE: Une fonction de la fritte est d’empêcher la colonne de s’assécher. En conséquence, de courts délais sont tolérés avant que plus d’éluant ne soit ajouté à la colonne.
   3. Recueillir l’éluat dans 12 tubes microcentrifugés stériles, 0,5 mL par fraction.
10. Déterminez le rendement viral.
    1. Déterminer les fractions virales maximales à l’aide de la spectrophotométrie. Préparer une dilution de 1:100 de chaque fraction dans du PBS et mesurer les DO₂₆₀ dans un spectrophotomètre, en utilisant une dilution de 1:100 du tampon seul comme blanc. Les particules virales doivent éluer dans le volume vide, en commençant par la fraction 6. Regrouper les fractions contenant les lectures de DO₂₆₀ les plus élevées.
    2. Effectuer une dilution de 1:100 des fractions virales regroupées et remesurer la DO₂₆₀. Calculer la concentration finale de particules virales et le nombre de PIV dans les fractions regroupées à l’aide de la formule suivante: Particules virales par mL = DO₂₆₀ × 100 (ceci corrige le facteur de dilution) × 10¹². Une estimation générale est que 1% des particules virales sont IVP, en tant que telles: IVP/mL = DO 260 × 100 × 10¹⁰ ou IVP/μL = DO₂₆₀ × 100 ×^{10 7}.
11. Aliquote les fractions virales regroupées (contenant 5 x 10⁷ à 1 x 10⁸ IVP) dans des tubes de microcentrifugation stériles ou des cryovials. Conserver les échantillons à -80 °C.

2. Transduction de la vessie de rongeur

NOTE: Si cette technique est nouvelle à la fois, il est recommandé de limiter le nombre d’animaux transduits en même temps à 2-4. Cela peut être accompli en échelonnant les heures de début pour chaque animal, en particulier pendant le traitement aux détergents à l’étape 2.2, puis l’incubation du virus à l’étape 2.3. Les enquêteurs expérimentés peuvent transduire jusqu’à six animaux à la fois.

1. Cathétériser la vessie
   1. Anesthésiez les souris femelles C57Bl/6J (généralement âgées de 8 à 10 semaines, ~20 à 25 g) ou les rats Sprague Dawley femelles (généralement âgés de 2 à 3 mois, ~250 g) à l’aide d’un vaporisateur muni d’un cône nasal. Calibrer le vaporisateur pour produire 3,0 % (v/v) d’isoflurane, 97 % (v/v) O 2 pour les souris ou 4,0 % (v/v) d’isoflurane, 96 % (v/v) O₂ pour les rats. Confirmez que les animaux sont anesthésiés en s’assurant qu’ils ne répondent pas au pincement des orteils (généralement après 1 à 2 minutes).
   2. Maintenez la température corporelle de l’animal en plaçant les animaux sur un coussin chauffant. Surveillez l’animal tout au long du protocole de transduction pour vous assurer qu’il est anesthésié et qu’il ne ressent aucune douleur pendant cette procédure.
   3. Réduire l’isoflurane à 1,5 % (v/v) pour les souris ou à 2,0 % (v/v) pour les rats et maintenir les animaux sous anesthésie pendant toute la durée du protocole.
   4. Pour éviter d’introduire de l’air dans la vessie, remplissez la partie du cathéter en plastique d’un cathéter IV (voir le tableau des matériaux) et le moyeu associé avec du PBS stérile à l’aide d’une pipette de transfert.
   5. Avec l’animal en décubitus dorsal, écouvillonner le méat externe avec de l’alcool à 70% et insérer le cathéter stérile dans le méat externe, puis dans l’urètre, puis dans la vessie.
      1. Pour effectuer cette tâche, utilisez une pince fine pour saisir doucement le tissu formant le méat externe et l’étendre verticalement, loin de l’animal. En utilisant l’autre main, insérez soigneusement le cathéter verticalement d’environ 3-4 mm dans le méat urétral (un monticule de chair juste au-dessus de l’ouverture du vagin). Ensuite, en raison d’une courbure de l’urètre, abaissez le cathéter, inséré dans le méat externe, vers la queue de l’animal, ce qui facilite son entrée dans la partie de l’urètre qui passe sous l’os pubien, et finalement dans la vessie.
         . REMARQUE: Surtout dans le cas de la souris, le cathéter peut être trop long et pas plus de 1,0 à 1,1 cm de celui-ci doit être inséré dans l’animal. Sinon, des dommages à la muqueuse de la vessie s’ensuivront. Pour éviter cela, marquez le cathéter ~1 cm sous son extrémité, puis n’insérez pas le cathéter au-delà de ce marquage.
   6. Laissez l’urine dans la vessie s’écouler. Enlevez toute urine résiduelle en effectuant la manœuvre de Credé: masser et appuyer doucement sur la bosse de la vessie dans la région abdominale inférieure.
2. Rendre l’urothélium réceptif à la transduction en le traitant avec une solution détergente.
   1. Lavez la vessie de souris ou de rat en attachant une seringue stérile de 1 mL remplie de PBS au moyeu du cathéter. Injectez 100 μL de PBS stérile dans la vessie de souris (ou 450 μL dans le cas de la vessie de rat). Détachez la seringue de l’ajustement du cathéter et laissez le PBS s’égoutter. Si nécessaire, effectuez la manœuvre de Crede pour éliminer l’excès de liquide vésical.
   2. Instiller 100 μL de N-dodécyl-β-D-maltoside (DDM) à 0,1 % (p/v) (dissous dans du PBS et stérilisé par filtre à 0,2 μm) dans la vessie de souris à l’aide d’une seringue stérile de 1 mL. Retenir le DDM dans la vessie pendant 10 min en laissant la seringue en place. Chez le rat, le volume de DDM est augmenté à 450 μL.
   3. Retirez le DDM de la vessie en détachant la seringue et en la laissant s’écouler. Effectuez la manœuvre de Crede si nécessaire.
3. Introduisez le virus dans la vessie.
   1. Fixer une seringue stérile de 1 mL au moyeu du cathéter et instiller 0,5 x 10⁷ à 1 x 10⁸ IVP d’adénovirus (préparé à l’étape 1), dilué dans 100 μL de PBS stérile pour les souris ou 450 μL pour les rats, dans la vessie. Laissez la seringue attachée au cathéter pour empêcher la solution virale de s’échapper.
   2. Après 30 min, détachez la seringue et laissez la solution virale évacuer la vessie sur une serviette jetable. Épongez toute solution virale résiduelle avec une lingette absorbante, jetez le tampon et essuyez les déchets biologiques dangereux.
      REMARQUE: Le glycérol est cytotoxique. En tant que tel, le volume maximal de solution virale instillée chez la souris est limité à 5 μL (qui, une fois dilué dans 100 μL de PBS, entraînerait une concentration finale de glycérol de ~0,5% [v / v]). De plus, il est possible d’améliorer l’efficacité de la transduction en augmentant le nombre de PIV instillées et en prolongeant l’incubation du virus à 45 min.
   3. Étape facultative : La vessie peut être rincée avec du PBS comme décrit à l’étape 2.2.1 ci-dessus; toutefois, cela n’est pas obligatoire.
4. Laissez l’animal récupérer.
   1. Cesser l’écoulement de l’isoflurane et permettre à l’animal de récupérer et d’être complètement mobile avant de le remettre dans sa cage, en particulier si les animaux sont logés en groupe.
      REMARQUE: Comme la transduction virale en soi ne provoque pas de symptômes ou de douleurs observables des voies urinaires inférieures, il n’est généralement pas nécessaire de traiter après une intervention chirurgicale. Toutefois, si le transgène codé est toxique, une analgésie postopératoire ou des antibiotiques peuvent être nécessaires selon les exigences de l’établissement.
5. Analyser les effets de l’expression transgénique 12-72 h après le traitement en utilisant des méthodes telles que l’hybridation in situ de l’ARNm, le transfert Western ou l’immunofluorescence ^9,10,23 (voir les résultats représentatifs).

Résultats

Préparation du virus
Un exemple de purification virale par centrifugation à gradient de densité est présenté à la figure 1A. La bande rose clair, située à l’interface du matériel cellulaire chargé et de la couche de CsCl de 1,25 g/mL, est principalement composée de cellules perturbées et de leurs débris (voir la flèche magenta à la figure 1A). Il tire sa couleur rosâtre de la petite quantité de milieu de culture qui est rep...

Discussion

Alors que Ramesh et coll. se concentraient sur l’élaboration de stratégies pour utiliser la transduction adénovirale dans le traitement du cancer de la vessie 18, des rapports plus récents ont démontré l’utilité de ces techniques dans l’étude de la biologie, de la physiologie urothéliale normale et de la physiopathologie 10,18,19,20,21

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL pipette	Corning Costar (Millipore Sigma)	CLS4488	sterile, serological pipette, individually wrapped
12 mL ultracentrifuge tube	ThermoFisher	06-752	PET thinwall ultracentrifuge tube
15 mL conical centrifuge tube	Falcon (Corning)	352097	sterile
18 G needle	BD	305196	18 G x 1.5 in needle
20 mL pipette	Corning Costar (Millipore Sigma)	CLS4489	sterile, serological pipette, individually wrapped
50 mL conical centrifuge tube	Falcon (Corning)	352098	sterile
5 mL pipette	Corning Costar (Millipore Sigma)	CLS4487	sterile, serological pipette, individually wrapped
Cavicide	Henry Schein	6400012	Anti-viral solution
Cell culture dish - 15 cm	Falcon (Corning)	353025	sterile, tissue-culture treated  (150 mm x 25 mm dish)
Cell scraper	Sarstedt	893.1832	handle length 24 cm, blade length 1.7 cm
CsCl	Millipore Sigma	C-4306	Molecular Biology grade ≥ 98%
DMEM culture medium (high glucose)	Gibco (ThermoFisher)	11965092	with 4.5 g/L glucose + L-glutamine + phenol red
EDTA	Millipore Sigma	EDS	Bioiultra grade ≥ 99%
Fetal bovine serum	Hyclone (Cytiva)	SH30070.03	defined serum
Glass pipette	Fisher Scientific	13-678-20A	5.75 in glass pipette, autoclaved
Glycerol	Millipore Sigma	G-5516	Molecular Biology grade ≥ 99%
HEK293 cells	ATCC	CRL-3216	HEK293T cells are a variant of HEK293 cells that express the SV40 large T-antigen
Isoflurane	Covetrus	29405
IV catheter - mouse	Smith Medical Jelco	3063	24 G x 3/4 in Safety IV catheter  radiopaque
IV catheter - rat	Smith Medical Jelco	3060	22 G x 1 in Safety IV catheter radiopaque
KCl	Millipore Sigma	P-9541	Molecular Biology grade ≥ 99%
KH2PO4	Millipore Sigma	P5655	Cell culture grade  ≥ 99%
Na2HPO4•7 H2O	Millipore Sigma	431478	≥ 99.99%
NaCl	Millipore Sigma	S3014	Molecular Biology grade ≥ 99%
N-dodecyl-β-D-maltoside	Millipore Sigma	D4641	≥ 98%
Nose cone for multiple animals	custom designed		commercial options include one from Parkland Scientific (RES3200)
PD-10 column	GE Healthcare	17-085-01	Prepacked columns filled ith Sephadex G-25M
Penicillin/streptomycin antibiotic (100x)	Gibco (ThermoFisher)	15070063	100x concentrated solution
Spectrophotometer	Eppendorf	BioPhotometer
Stand and clamp	Fisher Scientific	14-679Q and 05-769-8FQ	available from numerous suppliers
Sterile filter unit	Fisher Scientific (Nalgene)	09-740-65B	0.2 µm rapid-flow filter unit (150 mL)
Sterile filter unit 0.2 µm (syringe)	Fisher Scientific	SLGV004SL	Millipore Sigma Milex 0.22 µm filter unit that attaches to syringe
Super speed centrifuge	Eppendorf	5810R	with Eppendorf F34-6-38 fixed angle rotor (12,000 rpm)
Syringe (1 mL)	BD	309628	1-mL syringe Luer-lok tip - sterile
Syringe (3 mL)	BD	309656	3-mL syringe slip tip - sterile
Table-top centrifuge (low speed)	Eppendorf	5702	with swinging bucket rotor
Transfer pipettes	Fisher Scientific	13-711-9AM	polyethylene 3.4 mL transfer pipette
Tris-base	Millipore Sigma	648310-M	Molecular Biology grade
TrypLE select protease solution	Gibco (ThermoFisher)	12604013	TrypLE express enzyme (1x), no phenol red
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima L-80 XP	with Beckman SW41 rotor (41,000 rpm)
Vaporizer	General Anesthetic Services, Inc.	Tec 3	Isoflurane vaporizer
Vortex Mixer	VWR	10153-838	analog vortex mixer