АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Описаны способы генерации больших количеств рекомбинантных аденовирусов, которые затем могут быть использованы для трансдукции нативного уротелия грызунов, позволяющего экспрессировать трансгены или подавлять эндогенные генные продукты.

Аннотация

Предполагается, что в дополнение к образованию барьера с высоким сопротивлением уротелий, выстилающий почечную лоханку, мочеточники, мочевой пузырь и проксимальный отдел уретры, воспринимает и передает информацию об окружающей среде в подлежащие ткани, способствуя мочеиспусканию и поведению. Нарушение уротелиального барьера или его сенсорной/преобразовательной функции может привести к заболеванию. Изучение этих сложных событий затруднено отсутствием простых стратегий изменения экспрессии генов и белков в уротелии. Здесь описаны методы, которые позволяют исследователям генерировать большое количество аденовируса с высоким титром, который затем может быть использован для трансдукции уротелия грызунов с высокой эффективностью и относительно простым способом. Как кДНК, так и малые интерферирующие РНК могут быть экспрессированы с помощью аденовирусной трансдукции, а влияние экспрессии трансгена на функцию уротелия можно оценить через 12 часов или несколько дней. Эти методы имеют широкое применение для изучения нормальной и аномальной уротелиальной биологии с использованием моделей мышей или крыс.

Введение

Уротелий представляет собой специализированный эпителий, который выстилает почечную лоханку, мочеточники, мочевой пузырь и проксимальный отделуретры 1. Он состоит из трех слоев: слоя высокодифференцированных и поляризованных, часто двуядерных зонтичных клеток, апикальные поверхности которых омываются мочой; промежуточный клеточный слой с популяцией двуядерных транзитно-амплифицирующих клеток, которые могут давать начало поверхностным зонтичным клеткам в ответ на их острую потерю; и один слой базальных клеток, подмножество которых функционирует как стволовые клетки, которые могут регенерировать весь уротелий в ответ на хроническое повреждение. Зонтичные клетки в основном ответственны за формирование высокорезистентного уротелиального барьера, компоненты которого включают апикальную мембрану (богатую холестерином и цереброзидами) с низкой проницаемостью для воды и растворенных веществ и высокоомистный апикальный соединительный комплекс (состоящий из плотных соединений, адгезивных соединений, десмосом и связанного с ними актомиозинового кольца)1 . Как апикальная поверхность зонтичной клетки, так и ее соединительное кольцо расширяются во время наполнения мочевого пузыря и быстро возвращаются в предварительно заполненное состояние после мочеиспускания 1,2,3,4,5. В дополнение к своей роли в барьерной функции, предполагается также, что уротелий обладает сенсорными и преобразовательными функциями, которые позволяют ему ощущать изменения во внеклеточной среде (например, растяжение) и передавать эту информацию через высвобождение медиаторов (включая АТФ, аденозин и ацетилхолин) в подлежащие ткани, включая субуротелиальные афферентные нервные отростки 6,7,8 . Недавние доказательства этой роли были обнаружены у мышей, у которых отсутствует уротелиальная экспрессия как Piezo1, так и Piezo2, что приводит к изменению функции мочеиспускания9. Кроме того, у крыс, сверхэкспрессирующих порообразующий белок CLDN2 с плотным соединением в зонтичном клеточном слое, развиваются воспаление и боль, аналогичные тем, которые наблюдаются у пациентов с интерстициальным циститом10. Предполагается, что нарушение уротелиальной сенсорной/преобразовательной или барьерной функции может способствовать нескольким заболеваниям мочевого пузыря 6,11.

Лучшее понимание биологии уротелия в нормальных и болезненных состояниях зависит от наличия инструментов, которые позволят исследователям легко подавлять экспрессию эндогенных генов или разрешать экспрессию трансгенов в нативной ткани. В то время как один из подходов к подавлению экспрессии генов заключается в создании условных мышей с нокаутом уротелия, этот подход зависит от наличия мышей с флоксированными аллелями, является трудоемким и может занять от нескольких месяцев донескольких лет. Неудивительно, что исследователи разработали методы трансфекции или трансдукции уротелия, что может привести к результатам в более короткие сроки. Опубликованные методы трансфекции включают использование катионных липидов13, антисмысловых фосфоротиосодержащих олигодеоксинуклеотидов 14 или антисмысловых нуклеиновых кислот, привязанных к 11-мерному пептиду15 белка ТАТ ВИЧ. Тем не менее, основное внимание в этом протоколе уделяется использованию аденовирально-опосредованной трансдукции, хорошо изученной методологии, которая эффективна при доставке генов в широкий спектр клеток, была протестирована в многочисленных клинических испытаниях и совсем недавно использовалась для доставки кДНК, кодирующей капсидный белок COVID-19, реципиентам одного варианта вакцины противCOVID-19 16. 17. Для более подробного описания жизненного цикла аденовируса, аденовирусных векторов и клинического применения аденовирусов читатель направляется к ссылке17.

Важной вехой в использовании аденовирусов для трансдукции уротелия стал отчет Ramesh et al., в котором показано, что короткие предварительные обработки детергентами, включая N-додецил-β-D-мальтозид (DDM), резко усиливают трансдукцию уротелия аденовирусом, кодирующим β-галактозидазу18. Используя это исследование в качестве руководства, аденовирально-опосредованная трансдукция уротелия в настоящее время используется для экспрессии различных белков, включая ГТФазы семейства Rab, факторы обмена гуанин-нуклеотидов, моторные фрагменты миозина, порообразующие плотные соединения, связанные с клаудинами, и ADAM17 10,19,20,21,22 . Тот же подход был адаптирован для экспрессии малых интерферирующих РНК (миРНК), эффекты которых были спасены коэкспрессирующими миРНК-резистентными вариантами трансгена22. Описанный здесь протокол включает в себя общие методы получения больших количеств высококонцентрированного аденовируса, что является требованием для этих методов, а также адаптацию методов Ramesh et al.18 для экспрессии трансгенов в уротелии с высокой эффективностью.

протокол

Эксперименты, связанные с генерацией аденовирусов, для которых требуется сертификация BSL2, были проведены с одобрения отделов гигиены и безопасности окружающей среды Университета Питтсбурга и Институционального комитета по биобезопасности. Все проведенные эксперименты на животных, включая аденовирусную трансдукцию (которая требует сертификации ABSL2), были проведены в соответствии с соответствующими руководящими принципами / правилами Политики службы общественного здравоохранения по гуманному уходу и использованию лабораторных животных и Закона о благополучии животных, а также с одобрения Комитета по институциональному уходу за животными и их использованию Университета Питтсбурга. Перчатки, средства защиты глаз и соответствующая одежда надеваются на все процедуры, связанные с рекомбинантными вирусами. Любые жидкие или твердые отходы следует утилизировать, как описано ниже. Подстилка животных после трансдукции и любые полученные в результате этого туши животных должны рассматриваться как биологически опасные материалы и утилизироваться в соответствии с институциональной политикой.

1. Подготовка запасов аденовируса с высоким титром

ПРИМЕЧАНИЕ: Эффективная трансдукция мочевого пузыря грызунов зависит от использования очищенных и концентрированных вирусных запасов, обычно от 1 x 107 до 1 x 108 инфекционных вирусных частиц (IVP) на мкл. Эта часть протокола ориентирована на создание запасов аденовирусов с высоким титром из существующих вирусных препаратов. Все этапы должны выполняться в вытяжке для культивирования клеток с использованием стерильных реагентов и инструментов. В то время как доступные штаммы аденовируса, используемые сегодня, имеют дефекты репликации, большинству учреждений требуется разрешение на использование аденовирусов и рекомбинантной ДНК. Это часто включает в себя обозначение помещения для культивирования клеток в качестве одобренного BSL2 объекта для производства и амплификации аденовирусов. Некоторые общие соображения включают использование масок, средств защиты глаз, перчаток и соответствующей одежды на всех этапах производства и очистки вируса. При выполнении центрифугирования рекомендуется использовать защитные колпачки, если в центрифужных пробирках отсутствуют плотно прилегающие крышки. Все одноразовые материалы, включая потенциально загрязненные крышки центрифуг, бутылки и роторы, обрабатывают противовирусным раствором (см. Таблицу материалов), а затем промывают водой или 70% этанолом. Жидкие отходы обрабатываются добавлением отбеливателя до конечной концентрации 10% (об. / об.). Утилизация этих жидких отходов будет зависеть от институциональной политики. Твердые отходы, как правило, утилизируются вместе с биологически опасными отходами.

  1. Культивирование клеток HEK293T
    1. Разморозьте замороженный флакон с клетками HEK293T на водяной бане при 37 ° C и используйте пипетку объемом 5 мл для переноса клеток в чашку для культивирования клеток диаметром 15 см. Используя пипетку объемом 25 мл, медленно добавьте в блюдо 20 мл модифицированной среды Dulbecco Eagle Medium (DMEM), содержащей 10% (v/v) эмбриональной бычьей сыворотки и антибиотик пенициллин/стрептомицин (DMEM-FBS-PS). Инкубируют клетки в инкубаторе клеточных культур при температуре 37 °C, отравленном газом с 5% (об. / об.) CO 2 до тех пор, пока они не достигнут слияния 80% -90% (~2 x 107 клеток).
    2. Используя стеклянную пипетку, прикрепленную к источнику вакуума, аспирируйте среду, а затем промойте клетки, перенеся 20 мл стерильного PBS (2,7 мМ KCl, 1,5 мМ KH 2 PO 4, 136,9 мМ NaCl и 8,9 мМ Na2HPO4) в чашку с помощью пипетки объемом 25 мл. Аспирируйте отработанный PBS, а затем с помощью пипетки объемом 5 мл перенесите 3 мл теплого (37 °C) раствора протеиназы (см. Таблицу материалов) в чашку, инкубируя чашку в инкубаторе клеточных культур до тех пор, пока клетки не отсоединятся (~3-4 мин).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эффективный протеолиз можно лучше всего оценить, медленно наклоняя чашку вперед и назад в поисках высвобождения клеток из всех частей чашки в движущуюся жидкость. Клетки HEK293T чувствительны к длительному лечению протеиназой и погибнут, если оставить их более чем на несколько минут в растворе протеиназы.
    3. Используйте пипетку объемом 10 мл для переноса 7 мл DMEM-FBS-PS в чашку с отделившимися клетками, а затем используйте ту же пипетку для аспирации клеток и среды. Перенесите взвешенные клетки в коническую пробирку объемом 50 мл, а затем гранулируйте клетки, центрифугируя суспензию в низкоскоростной клинической центрифуге при 200 x g в течение 5 мин. Аспирируйте надосадочную жидкость с помощью стеклянной пипетки, прикрепленной к источнику вакуума. Используйте пипетку объемом 25 мл для ресуспендирования клеточной гранулы в 15 мл DMEM-FBS-PS.
    4. Добавьте 1 мл клеточной суспензии в каждую из пятнадцати 15-сантиметровых чаек, содержащих 19 мл DMEM-FBS-PS.
    5. Выращивайте клетки в инкубаторе тканевых культур до тех пор, пока они не достигнут слияния 85%-90% (~ 3-4 дня).
  2. Приготовьте разбавленный раствор вируса
    1. Добавьте ~ 1,5 x 10 9 до 3 x 109 IVP существующего вирусного запаса (5-10 IVP / клетка) в коническую пробирку объемом 50 мл, заполненную 45 мл DMEM, в котором отсутствуют FBS или антибиотики.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Можно использовать более низкую концентрацию вируса (1-5 IVP/клетка); Однако для производства вируса потребуется больше времени.
  3. Заразить культивируемые клетки вирусом.
    1. Используя стеклянную пипетку, прикрепленную к источнику вакуума, аспирируйте среду из почти сливающихся клеток на шаге 1.1.5.
    2. Используйте пипетку объемом 25 мл для переноса 3,0 мл разбавленного раствора вируса (приготовленного на шаге 1.2.1) в каждую чашку для клеточной культуры. Затем с помощью пипетки объемом 10 мл добавьте 7,0 мл среды DMEM (в которой отсутствуют FBS или антибиотики) в каждую чашку. Инкубировать в течение 60 мин в инкубаторе клеточных культур, а затем добавить 10 мл DMEM, содержащего 20% (об./об.) FBS и 2x PS в каждую чашку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Использование одной из 15 чашек в качестве контрольной пластины (в которую вирус не добавляется) облегчает идентификацию вызванного вирусом округления клеток и гибели инфицированных клеток на следующем этапе.
    3. Инкубируйте клетки в инкубаторе клеточных культур в течение 2-4 дней, пока большинство из них не начнет округляться и >60% клеток не отделятся.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании более низкого титра вируса гибель клеток может занять до недели. Если гибель клеток не происходит в течение недели, вполне вероятно, что процесс необходимо будет повторить с использованием более высокого титра вируса.
  4. Восстановление вируса из клеточных лизатов
    1. Используйте скребок для ячеек, чтобы соскоблить дно каждой чашки, высвобождая прикрепленные клетки в среду.
    2. Используя пипетку объемом 25 мл, соберите и объедините среду, клетки и клеточный мусор из каждой чашки для культивирования клеток в коническую пробирку для культуры клеток объемом 50 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для экономии ресурсов среду из двух посуды можно объединить в одну пробирку объемом 50 мл.
    3. Гранулирование клеточного материала центрифугированием с использованием низкоскоростной настольной центрифуги: 5 мин при комнатной температуре при 3 000 x g. Используйте стеклянную пипетку, прикрепленную к вакуумному устройству, для аспирации надосадочной жидкости.
    4. Используйте пипетку объемом 10 мл в сочетании с растиранием, чтобы консолидировать весь полученный гранулированный материал в общей сложности 7 мл стерильно отфильтрованного 100 мМ Tris-HCl pH 7,4, содержащего 10 мМ ЭДТА (раствор трис-ЭДТА). Переложите объединенный материал в стерильную коническую пробирку для клеточной культуры объемом 15 мл и поместите на лед.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе подготовку к вирусу можно заморозить при -80 ° C на неопределенный срок.
  5. Подготовьте лизаты клеток
    1. Выполните три цикла замораживания-оттаивания, чтобы разрушить оставшиеся клетки и, таким образом, дополнительно высвободить образовавшиеся вирусные частицы. Заморозьте объединенный материал на шаге 1.4.4, погрузив трубку в жидкий азот (~30-60 с). Быстро разморозьте образец, поместив пробирку в инкубатор с температурой 37 °C. Встряхните образец в течение 15 с, а затем повторите процедуру быстрого замораживания и оттаивания еще 2 раза.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор вируса можно быстро разморозить при температуре 37 ° C на водяной бане, но следует соблюдать осторожность, так как колебания температуры могут привести к растрескиванию трубки, что приведет к высвобождению вирусного раствора в водяную баню. Чтобы этого не произошло, поместите пробирку, содержащую вирусную надосадочную жидкость, в большую пробирку, которую затем устанавливают на водяной бане.
    2. Используйте пипетку объемом 10 мл для переноса трижды размороженного клеточного материала в сверхскоростную центрифужную пробирку. Центрифугируйте материал в пробирке в течение 30 мин при 4 °C сверхскоростной центрифуге при ~ 18 500 x g.
    3. Извлеките ~ 7 мл богатой вирусами надосадочной жидкости с помощью пипетки объемом 10 мл и перенесите ее в коническую пробирку объемом 15 мл. Оставьте образец на льду до следующего шага.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе рассмотрите возможность сохранения аликвоты неочищенной вирусной надосадочной жидкости в качестве преамбулы для начала нового вирусного препарата (или в качестве резервной копии). Храните аликвоту при температуре -80 °C.
  6. Изолируйте и очистите вирус с помощью центрифугирования с градиентом плотности.
    1. Приготовьте прерывистый градиент CsCl в тонкостенной прозрачной ультрацентрифужной пробирке из ПЭТ объемом 12 мл (см. Таблицу материалов) или эквивалентной. Используйте шприц объемом 3 мл, оснащенный иглой 18 г, чтобы осторожно ввести 2,5 мл раствора CsCl 1,4 г / мл на дно пробирки, а затем используйте новый шприц / иглу, чтобы наложить на него 2,5 мл раствора CsCl 1,25 г / мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Капание растворов непосредственно поверх уже существующего слоя приведет к значительному и нежелательному перемешиванию. Вместо этого поместите скошенную часть иглы к краю трубки, а затем очень медленно нажмите на поршень шприца, повышая положение иглы по мере того, как раствор заполняет трубку.
    2. Загрузите ~ 7 мл вирусной надосадочной жидкости поверх градиента аналогичным образом, используя шприц объемом 10 мл. Если между надосадочной жидкостью вируса и верхней частью пробирки более 2-3 мм пространства, добавьте дополнительный раствор Tris-EDTA, чтобы заполнить пробирку до тех пор, пока не останется только 2-3 мм пространства.
    3. Сделайте аналогично подготовленную балансовую трубку, содержащую слои CsCl, но заменяющую раствор Tris-EDTA на вирусную надосадочную жидкость.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Две трубки должны иметь одинаковый вес (и одинаковую плотность), чтобы предотвратить потенциально опасную ситуацию с несбалансированной нагрузкой в ультрацентрифуге.
  7. Изолируют вирус с помощью скорозонального ультрацентрифугирования.
    1. Загрузите градиенты, сформированные на этапах 1.6.2-1.6.3, в ковши ротора SW41 или аналогичного ротора. Завинтите крышки ведра, поместите ротор в ультрацентрифугу (предварительно охлажденную до 4 °C) и центрифугу в течение 1 часа при ~ 150 000 x g.
    2. Во время центрифугирования уравновесьте колонку, описанную на этапе 1.9.1 ниже.
  8. Восстановление изолированных вирусных частиц
    1. В конце этапа центрифугирования осторожно отсоедините ведра от ротора и в колпаке для культивирования клеток снимите крышки ведра, а затем снимите пробирки и поместите их в стойку.
    2. Соберите полосчатый материал, богатый вирусными частицами, который плавает на границе раздела между раствором CsCl 1,25 г/мл и 1,4 г/мл. Держа пробирку, содержащую градиент, над нижней половиной чашки для клеточных культур (которая будет улавливать любые пролитые материалы), используйте 1-дюймовую иглу 18 G, прикрепленную к шприцу объемом 3 мл, чтобы осторожно проколоть пробирку, чуть ниже полосатого вируса. Медленно аспирируйте вирус, который обычно восстанавливается в ~ 1 мл.
    3. Извлеките иглу из трубки, в результате чего оставшийся материал в градиенте вытечет из трубки в нижнюю половину чашки для клеточных культур (любые жидкости следует рассматривать как опасные отходы).
    4. Переведите раствор вируса в шприце в стерильную микроцентрифужную пробирку на льду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При извлечении вируса на этом этапе расположите иглу так, чтобы просвет иглы был направлен вверх, а игла открылась на несколько мм ниже богатой вирусом полосы. Избегайте заражения тонкой полосой неправильно собранного вируса, которая иногда наблюдается на 2-3 мм выше полосчатого вируса (см. тонкую черную стрелку на рисунке 1A).
  9. Удалите CsCl из образца с помощью гель-фильтрации.
    1. Уравновесьте колонку PD-10 (предварительно упакованную Sephadex G-25M), прикрепленную к опорной подставке, 50 мл 0,2 мкм стерильно отфильтрованного PBS, содержащего 10% (об. / об.) глицерина.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Начальный этап уравновешивания занимает 2-3 часа и необходим для обеспечения полного вымывания консервантов, которые используются производителем для стабилизации колонны.
    2. Дайте промывочному раствору отступить ниже фритты (защитный диск из белого материала в верхней части среды колонны), а затем осторожно перенесите очищенный раствор вируса, собранный на шаге 1.8, в верхнюю часть колонки. Дайте богатому вирусами раствору отступить ниже фритты, а затем начните заполнять колонку PBS-глицерином.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Одной из функций фритты является предотвращение высыхания колонны. В результате допускаются короткие задержки, прежде чем в колонну будет добавлено больше элюанта.
    3. Соберите элюат в 12 стерильных микроцентрифужных пробирок по 0,5 мл на фракцию.
  10. Определите вирусный выход.
    1. Определите пиковые фракции вируса с помощью спектрофотометрии. Приготовьте разбавление каждой фракции в соотношении 1:100 в PBS и измерьте OD260 в спектрофотометре, используя разбавление 1:100 только буфера в качестве заготовки. Вирусные частицы должны растворяться в объеме пустоты, начиная примерно с фракции 6. Объедините фракции, содержащие самые высокие показания OD260 .
    2. Разбавьте объединенные вирусные фракции в соотношении 1:100 и повторно отмерьте OD260. Рассчитайте конечную концентрацию вирусных частиц и количество IVP в объединенных фракциях по следующей формуле: Вирусные частицы на мл = OD260 × 100 (это с поправкой на коэффициент разбавления) × 1012. Общая оценка заключается в том, что 1% вирусных частиц являются IVP, как таковые: IVP / мл = OD 260 × 100 ×10 10 или IVP / мкл = OD260 × 100 ×10 7.
  11. Аликвотируйте объединенные фракции вируса (содержащие от 5 x 107 до 1 x 108 IVP) в стерильные микроцентрифужные пробирки или криовиалы. Храните образцы при температуре -80 °C.

2. Трансдукция мочевого пузыря грызунов

ПРИМЕЧАНИЕ: Если вы новичок в этой технике, рекомендуется ограничить количество животных, передаваемых за один раз, до 2-4. Это может быть достигнуто путем поэтапного распределения времени начала для каждого животного, особенно во время обработки моющим средством на шаге 2.2, а затем инкубации вируса на шаге 2.3. Опытные исследователи могут трансдуцировать до шести животных одновременно.

  1. Катетеризация мочевого пузыря
    1. Анестезируют самок мышей C57Bl / 6J (обычно 8-10 недель, ~ 20-25 г) или самок крыс Sprague Dawley (обычно 2-3 месяца, ~ 250 г) с помощью испарителя с прикрепленным носовым конусом. Откалибруйте испаритель для получения 3,0% (об./об.) изофлурана, 97% (об./об.) O2 для мышей или 4,0% (об./об.) изофлурана, 96% (об./об.)O2 для крыс. Убедитесь, что животные находятся под наркозом, убедившись, что они не реагируют на ущипывание пальцев ног (обычно через 1-2 минуты).
    2. Поддерживайте температуру тела животного, помещая животных на гретую подушку. Следите за животным на протяжении всего протокола трансдукции, чтобы убедиться, что животные находятся под наркозом и не испытывают боли во время этой процедуры.
    3. Уменьшите изофлуран до 1,5% (об./об.) для мышей или 2,0% (об./об.) для крыс и поддерживайте животных под наркозом в течение всего срока действия протокола.
    4. Чтобы предотвратить попадание воздуха в мочевой пузырь, заполните пластиковую часть катетера для внутривенного введения (см. Таблицу материалов) и связанный с ним концентратор стерильным PBS с помощью пипетки для переноса.
    5. Когда животное находится в положении лежа на спине, протрите наружный проход 70% спиртом и вставьте стерильный катетер в наружный проход, затем в мочеиспускательный канал, а затем в мочевой пузырь.
      1. Чтобы выполнить эту задачу, используйте тонкие щипцы, чтобы осторожно захватить ткань, образующую наружный проход, и вытянуть ее вертикально, подальше от животного. Другой рукой осторожно введите катетер вертикально примерно на 3-4 мм в проход уретры (холмик плоти чуть выше отверстия влагалища). Затем, из-за изгиба мочеиспускательного канала, опустите катетер, вставленный в наружный проход, к хвосту животного, что облегчит его проникновение в часть уретры, проходящую ниже лобковой кости, и, в конечном итоге, в мочевой пузырь
        . ПРИМЕЧАНИЕ: Особенно в случае мыши катетер может быть слишком длинным, и не более 1,0-1,1 см его следует вводить животному. В противном случае последует повреждение слизистой оболочки мочевого пузыря. Чтобы предотвратить это, пометьте катетер на ~1 см ниже его кончика, а затем не вставляйте катетер за пределы этой маркировки.
    6. Дайте моче в мочевом пузыре вытечь. Удалите остатки мочи, выполнив маневр Креде: помассируйте и осторожно надавите на шишку мочевого пузыря в нижней части живота.
  2. Сделайте уротелий восприимчивым к трансдукции, обработав его раствором моющего средства.
    1. Промойте мочевой пузырь мыши или крысы, присоединив стерильный шприц объемом 1 мл, наполненный PBS, к концентратору катетера. Введите 100 мкл стерильного PBS в мочевой пузырь мыши (или 450 мкл в случае мочевого пузыря крысы). Отсоедините шприц от штуцера катетера и дайте PBS стечь. При необходимости выполните маневр Креде для удаления лишней жидкости мочевого пузыря.
    2. Закапывают 100 мкл 0,1% (мас./об.) N-додецил-β-D-мальтозида (DDM) (растворенного в PBS и стерилизованного фильтром 0,2 мкм) в мочевой пузырь мыши с помощью стерильного шприца объемом 1 мл. Удерживайте DDM в мочевом пузыре в течение 10 минут, оставив шприц на месте. У крыс объем ДДМ увеличивают до 450 мкл.
    3. Удалите DDM из мочевого пузыря, отсоединив шприц и позволив ему вытечь. При необходимости выполните маневр Креда.
  3. Ввести вирус в мочевой пузырь.
    1. Прикрепите стерильный шприц объемом 1 мл к концентратору катетера и закапывайте в мочевой пузырь 0,5 x 10от 7 до 1 x 108 IVP аденовируса (приготовленного на этапе 1), разведенного в 100 мкл стерильного PBS для мышей или 450 мкл для крыс. Оставьте шприц прикрепленным к катетеру, чтобы предотвратить утечку вирусного раствора.
    2. Через 30 минут отсоедините шприц и дайте раствору вируса эвакуироваться из мочевого пузыря на одноразовую прокладку. Промокните остатки вирусного раствора впитывающей салфеткой, выбросьте прокладку и протрите биологически опасные отходы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Глицерин цитотоксичен. Таким образом, максимальный объем раствора вируса, закапываемого мышам, ограничен 5 мкл (что при разбавлении 100 мкл PBS приведет к конечной концентрации глицерина ~ 0,5% [об./об.]). Кроме того, можно повысить эффективность трансдукции за счет увеличения количества инстиллированных IVP и продления инкубации вируса до 45 минут.
    3. Необязательный шаг: мочевой пузырь можно промыть с помощью PBS, как описано на шаге 2.2.1 выше; Однако это не обязательно.
  4. Дайте животному восстановиться.
    1. Прекратите поток изофлурана и дайте животному восстановиться и быть полностью мобильным, прежде чем возвращать его в клетку, особенно если животные содержатся в группе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку трансдукция вируса сама по себе не вызывает наблюдаемых симптомов или боли в нижних мочевыводящих путях, обычно нет необходимости в послеоперационном лечении. Однако, если кодируемый трансген токсичен, может потребоваться послепроцедурная анальгезия или антибиотики в соответствии с требованиями учреждения.
  5. Проанализируйте эффекты экспрессии трансгена через 12-72 ч после лечения, используя такие методы, как гибридизация мРНК in situ, вестерн-блоттинг или иммунофлюоресценция 9,10,23 (см. репрезентативные результаты).

Результаты

Подготовка к вирусу
Пример очистки от вирусов центрифугированием в градиенте плотности показан на рисунке 1А. Светло-розовая полоса, обнаруженная на границе раздела загруженного клеточного материала и слоя CsCl 1,25 г/мл, в основном состоит из разрушенных клеток...

Обсуждение

В то время как Рамеш и др. были сосредоточены на разработке стратегий использования аденовирусной трансдукции в лечении рака мочевого пузыря 18, более поздние отчеты продемонстрировали полезность этих методов для изучения нормальной уротелиальной биологии / физиологии и патофизиолог?...

Раскрытие информации

Авторам раскрывать нечего.

Благодарности

Эта работа была поддержана наградой пилотного проекта через P30DK079307 (для M.G.D.), грантом NIH R01DK119183 (для G.A. и MDC), грантом NIH R01DK129473 (для G.A.), премией Американской ассоциации урологов за развитие карьеры и грантом Фонда Уинтерса (для Н.М.), ядром визуализации клеток и модельных организмов почек Питтсбургского центра исследований почек (P30DK079307), и S10OD028596 (G.A.), который финансировал покупку конфокальной системы, используемой для захвата некоторых изображений, представленных в этой рукописи.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
10 mL pipetteCorning Costar (Millipore Sigma)CLS4488sterile, serological pipette, individually wrapped
12 mL ultracentrifuge tubeThermoFisher06-752PET thinwall ultracentrifuge tube
15 mL conical centrifuge tubeFalcon (Corning)352097sterile
18 G needleBD 30519618 G x 1.5 in needle
20 mL pipetteCorning Costar (Millipore Sigma)CLS4489sterile, serological pipette, individually wrapped
50 mL conical centrifuge tubeFalcon (Corning)352098sterile
5 mL pipetteCorning Costar (Millipore Sigma)CLS4487sterile, serological pipette, individually wrapped
CavicideHenry Schein6400012Anti-viral solution
Cell culture dish - 15 cmFalcon (Corning)353025sterile, tissue-culture treated  (150 mm x 25 mm dish)
Cell scraperSarstedt893.1832handle length 24 cm, blade length 1.7 cm
CsClMillipore SigmaC-4306Molecular Biology grade ≥ 98%
DMEM culture medium (high glucose)Gibco (ThermoFisher)11965092with 4.5 g/L glucose + L-glutamine + phenol red
EDTAMillipore SigmaEDSBioiultra grade ≥ 99%
Fetal bovine serum Hyclone (Cytiva)SH30070.03defined serum
Glass pipetteFisher Scientific13-678-20A5.75 in glass pipette, autoclaved
GlycerolMillipore SigmaG-5516Molecular Biology grade ≥ 99%
HEK293 cellsATCCCRL-3216HEK293T cells are a variant of HEK293 cells that express the SV40 large T-antigen
IsofluraneCovetrus29405
IV catheter - mouseSmith Medical Jelco306324 G x 3/4 in Safety IV catheter  radiopaque
IV catheter - ratSmith Medical Jelco306022 G x 1 in Safety IV catheter radiopaque
KClMillipore SigmaP-9541Molecular Biology grade ≥ 99%
KH2PO4Millipore SigmaP5655Cell culture grade  ≥ 99%
Na2HPO4•7 H2OMillipore Sigma431478 ≥ 99.99%
NaClMillipore SigmaS3014Molecular Biology grade ≥ 99%
N-dodecyl-β-D-maltoside Millipore SigmaD4641 ≥ 98%
Nose cone for multiple animalscustom designedcommercial options include one from Parkland Scientific (RES3200)
PD-10 column GE Healthcare17-085-01Prepacked columns filled ith Sephadex G-25M
Penicillin/streptomycin antibiotic (100x)Gibco (ThermoFisher)15070063100x concentrated solution
SpectrophotometerEppendorf BioPhotometer
Stand and clampFisher Scientific14-679Q and 05-769-8FQavailable from numerous suppliers
Sterile filter unitFisher Scientific (Nalgene)09-740-65B0.2 µm rapid-flow filter unit (150 mL)
Sterile filter unit 0.2 µm (syringe)Fisher Scientific SLGV004SLMillipore Sigma Milex 0.22 µm filter unit that attaches to syringe
Super speed centrifugeEppendorf 5810Rwith Eppendorf F34-6-38 fixed angle rotor (12,000 rpm)
Syringe (1 mL)BD 3096281-mL syringe Luer-lok tip - sterile
Syringe (3 mL)BD 3096563-mL syringe slip tip - sterile
Table-top centrifuge (low speed)Eppendorf 5702with swinging bucket rotor
Transfer pipettesFisher Scientific13-711-9AMpolyethylene 3.4 mL transfer pipette
Tris-baseMillipore Sigma648310-MMolecular Biology grade 
TrypLE select protease solutionGibco (ThermoFisher)12604013TrypLE express enzyme (1x), no phenol red
UltracentrifugeBeckman CoulterOptima L-80 XPwith Beckman SW41 rotor (41,000 rpm)
Vaporizer General Anesthetic Services, Inc.Tec 3Isoflurane vaporizer
Vortex MixerVWR10153-838analog vortex mixer

Ссылки

  1. Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. The Urothelium: Life in a liquid environment. Physiological Reviews. 100 (4), 1621-1705 (2020).
  2. Truschel, S. T., et al. Stretch-regulated exocytosis/endocytosis in bladder umbrella cells. Molecular Biology of the Cell. 13 (3), 830-846 (2002).
  3. Lewis, S. A., de Moura, J. L. C. Incorporation of cytoplasmic vesicles into apical membrane of mammalian urinary bladder epthelium. Nature (London). 297 (5868), 685-688 (1982).
  4. Eaton, A. F., et al. Expansion and contraction of the umbrella cell apical junctional ring in response to bladder filling and voiding. Molecular Biology of the Cell. 30 (16), 2037-2052 (2019).
  5. Yu, W., Khandelwal, P., Apodaca, G. Distinct apical and basolateral membrane requirements for stretch-induced membrane traffic at the apical surface of bladder umbrella cells. Molecular Biology of the Cell. 20 (1), 282-295 (2009).
  6. Birder, L., Andersson, K. E. Urothelial signaling. Physiological Reviews. 93 (2), 653-680 (2013).
  7. Birder, L. A. Urinary bladder, cystitis and nerve/urothelial interactions. Autonomic Neuroscience. 182, 89-94 (2014).
  8. Apodaca, G., Balestreire, E., Birder, L. A. The uroepithelial-associated sensory web. Kidney International. 72 (9), 1057-1064 (2007).
  9. Dalghi, M. G., et al. Functional roles for PIEZO1 and PIEZO2 in urothelial mechanotransduction and lower urinary tract interoception. Journal of Clinical Investigation Insight. 6 (19), 152984 (2021).
  10. Montalbetti, N., et al. Increased urothelial paracellular transport promotes cystitis. American Journal of Physiology: Renal Physiology. 309 (12), 1070-1081 (2015).
  11. Keay, S. K., Birder, L. A., Chai, T. C. Evidence for bladder urothelial pathophysiology in functional bladder disorders. BioMed Research International. 2014, 865463 (2014).
  12. Friedel, R. H., Wurst, W., Wefers, B., Kuhn, R. Generating conditional knockout mice. Methods in Molecular Biology. 693, 205-231 (2011).
  13. Kashyap, M., et al. Down-regulation of nerve growth factor expression in the bladder by antisense oligonucleotides as new treatment for overactive bladder. Journal of Urology. 190 (2), 757-764 (2013).
  14. Bolenz, C., et al. Cellular uptake and ex vivo urothelial penetration by oligodeoxynucleotides for optimizing treatment of transitional cell carcinoma. Analytical and Quantitative Cytology and Histology. 30 (5), 265-273 (2008).
  15. Tyagi, P., et al. Intravesical antisense therapy for cystitis using TAT-peptide nucleic acid conjugates. Molecular Pharmaceutics. 3 (4), 398-406 (2006).
  16. Sadoff, J., et al. Interim results of a phase 1-2a trial of Ad26.COV2.S Covid-19 vaccine. New England Journal of Medicine. 384 (19), 1824-1835 (2021).
  17. Lee, C. S., et al. Adenovirus-mediated gene delivery: Potential applications for gene and cell-Based therapies in the new era of personalized medicine. Genes & Diseases. 4 (2), 43-63 (2017).
  18. Ramesh, N., et al. Identification of pretreatment agents to enhance adenovirus infection of bladder epithelium. Molecular Therapy. 10 (4), 697-705 (2004).
  19. Khandelwal, P., et al. Rab11a-dependent exocytosis of discoidal/fusiform vesicles in bladder umbrella cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15773-15778 (2008).
  20. Khandelwal, P., Ruiz, W. G., Apodaca, G. Compensatory endocytosis in bladder umbrella cells occurs through an integrin-regulated and RhoA- and dynamin-dependent pathway. The European Molecular Biology Organization journal. 29 (12), 1961-1975 (2010).
  21. Khandelwal, P., et al. A Rab11a-Rab8a-Myo5B network promotes stretch-regulated exocytosis in bladder umbrella cells. Molecular Biology of the Cell. 24 (7), 1007-1019 (2013).
  22. Prakasam, H. S., et al. A1 adenosine receptor-stimulated exocytosis in bladder umbrella cells requires phosphorylation of ADAM17 Ser811 and EGF receptor transactivation. Molecular Biology of the Cell. 25 (24), 3798-3812 (2014).
  23. Gallo, L. I., et al. RAB27B requirement for stretch-induced exocytosis in bladder umbrella cells. American Journal of Physiology Cell Physiology. 314 (3), 349-365 (2018).
  24. Amasheh, S., et al. Claudin-2 expression induces cation-selective channels in tight junctions of epithelial cells. Journal of Cell Science. 115, 4969-4976 (2002).
  25. Yu, A. S., et al. Molecular basis for cation selectivity in claudin-2-based paracellular pores: identification of an electrostatic interaction site. The Journal of General Physiology. 133 (1), 111-127 (2009).
  26. Kasahara, H., Aoki, H. Gene silencing using adenoviral RNAi vector in vascular smooth muscle cells and cardiomyocytes. Methods in Molecular Medicine. 112, 155-172 (2005).
  27. Bolognesi, B., Lehner, B. Reaching the limit. eLife. 7, 39804 (2018).
  28. Atasheva, S., Shayakhmetov, D. M. Cytokine responses to adenovirus and adenovirus vectors. Viruses. 14 (5), 888 (2022).
  29. Sanchez Freire, V., et al. MicroRNAs may mediate the down-regulation of neurokinin-1 receptor in chronic bladder pain syndrome. American Journal of Pathology. 176 (1), 288-303 (2010).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

188

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены