Adenovirüs Aracılı Transdüksiyon Kullanılarak Doğal Mesane Urothelyumunda Transgenlerin Ekspresyonu

Özet

Büyük miktarlarda rekombinant adenovirüslerin üretimi için yöntemler tanımlanmıştır, bu daha sonra transgenlerin ekspresyonuna veya endojen gen ürünlerinin aşağı regülasyonuna izin veren doğal kemirgen ürotelyumunu dönüştürmek için kullanılabilir.

Özet

Yüksek dirençli bir bariyer oluşturmanın yanı sıra, renal pelvis, üreterler, mesane ve proksimal üretrayı kaplayan ürotelyumun, çevresi hakkındaki bilgileri altta yatan dokulara algılamak ve iletmek, işeme fonksiyonunu ve davranışını teşvik etmek için varsayılmıştır. Ürotelyal bariyerin veya duyusal / dönüştürücü fonksiyonunun bozulması hastalığa yol açabilir. Bu karmaşık olayları incelemek, ürotelyumdaki gen ve protein ekspresyonunu değiştirmek için basit stratejilerin eksikliği nedeniyle engellenmektedir. Burada, araştırmacıların kemirgen ürotelyumunu yüksek verimlilikle ve nispeten basit bir şekilde dönüştürmek için kullanılabilecek büyük miktarlarda yüksek titreli adenovirüs üretmelerine izin veren yöntemler açıklanmaktadır. Hem cDNA'lar hem de küçük müdahale eden RNA'lar adenoviral transdüksiyon kullanılarak eksprese edilebilir ve transgen ekspresyonunun ürotelyal fonksiyon üzerindeki etkisi 12 saat ila birkaç gün sonra değerlendirilebilir. Bu yöntemler, fare veya sıçan hayvan modellerini kullanan normal ve anormal ürotelyal biyoloji çalışmalarına geniş uygulanabilirliğe sahiptir.

Giriş

Ürotelyum, renal pelvis, üreterler, mesane ve proksimal üretra^1'i kaplayan özel bir epiteldir. Üç tabakadan oluşur: apikal yüzeyleri idrarla yıkanan, oldukça farklılaşmış ve polarize olmuş, genellikle iki çekirdekli şemsiye hücrelerden oluşan bir tabaka; akut kayıplarına yanıt olarak yüzeysel şemsiye hücrelerine yol açabilen bi-nükleat geçiş-yükseltici hücre popülasyonuna sahip bir ara hücre tabakası; ve bir alt kümesi, kronik hasara yanıt olarak ürotelyumun tamamını yenileyebilen kök hücreler olarak işlev gören tek bir bazal hücre tabakası. Şemsiye hücreleri, bileşenleri suya ve çözünürlere karşı düşük geçirgenliğe sahip bir apikal membran (kolesterol ve serebrosidler bakımından zengin) ve yüksek dirençli apikal bileşke kompleksi (sıkı bağlantılar, aderens kavşakları, dezmozomlar ve ilişkili bir aktomiyosin halkasından oluşan) içeren yüksek dirençli ürotelyal bariyerin oluşturulmasından başlıca ^sorumludur.1 . Hem şemsiye hücresinin apikal yüzeyi hem de bileşke halkası mesane dolgusu sırasında genişler ve 1,2,3,4,5 işedikten sonra hızla önceden doldurulmuş hallerine geri döner. Bariyer fonksiyonundaki rolüne ek olarak, ürotelyumun ayrıca hücre dışı ortamdaki değişiklikleri (örneğin, gerilme) algılamasına ve bu bilgiyi subürotelyal afferent sinir süreçleri de dahil olmak üzere altta yatan dokulara (ATP, adenosin ve asetilkolin dahil) salınımı yoluyla iletmesine izin veren duyusal ve dönüştürücü fonksiyonlara sahip olduğu varsayılmıştır ^6,7,8 . Bu rolün son kanıtları, hem Piezo1 hem de Piezo2'nin ürotelyal ekspresyonundan yoksun farelerde bulunur ve bu da işeme fonksiyonunun değişmesine neden olur⁹. Ek olarak, şemsiye hücre tabakasında sıkı bağlantı gözenek oluşturan protein CLDN2'yi aşırı eksprese eden sıçanlar, interstisyel sistit¹⁰ hastalarında görülene benzer inflamasyon ve ağrı geliştirir. Ürotelyal duyusal/transdüser veya bariyer fonksiyonunun bozulmasının birçok mesane bozukluğuna katkıda bulunabileceği varsayılmıştır ^6,11.

Normal ve hastalık durumlarında ürotelyumun biyolojisinin daha iyi anlaşılması, araştırmacıların endojen gen ekspresyonunu kolayca aşağı regüle etmelerine veya doğal dokudaki transgenlerin ekspresyonuna izin vermelerine izin verecek araçların mevcudiyetine bağlıdır. Gen ekspresyonunu aşağı regüle etmeye yönelik bir yaklaşım, koşullu ürotelyal nakavt fareleri üretmek olsa da, bu yaklaşım flokslu alelleri olan farelerin mevcudiyetine bağlıdır, emek yoğundur ve^12'nin tamamlanması aylar ila yıllar sürebilir. Şaşırtıcı olmayan bir şekilde, araştırmacılar ürotelyumu transfekte etmek veya transdübe etmek için teknikler geliştirdiler ve bu da daha kısa bir zaman ölçeğinde sonuçlara yol açabilir. Transfeksiyon için yayınlanmış yöntemler arasında katyonik lipitler 13, anti-sens fosforothioated oligodeoksinükleotidler¹⁴ veya HIV TAT proteinine nüfuz eden 11-mer peptid^15'e bağlı antisens nükleik asitlerin kullanımı bulunmaktadır. Bununla birlikte, bu protokolün odak noktası, geniş bir hücre yelpazesine gen iletiminde etkili olan, çok sayıda klinik çalışmada test edilmiş ve en son COVID-19 kapsid proteinini kodlayan cDNA'yı COVID-19 aşısının bir varyantının alıcılarına iletmek için kullanılan iyi çalışılmış bir metodoloji olan adenoviral aracılı transdüksiyonun kullanılmasıdır^{16, 17}. Adenovirüs yaşam döngüsünün, adenoviral vektörlerin ve adenovirüslerin klinik uygulamalarının daha kapsamlı bir açıklaması için, okuyucu referans^17'ye yönlendirilir.

Ürotelyumu dönüştürmek için adenovirüslerin kullanımında önemli bir kilometre taşı, Ramesh ve ark. tarafından hazırlanan ve N-dodecyl-β-D-maltoside (DDM) dahil olmak üzere deterjanlarla yapılan kısa ön işlemlerin, β-galaktosidaz^18'i kodlayan bir adenovirüs tarafından ürotelyumun transdüksiyonunu önemli ölçüde artırdığını gösteren bir rapordu. Bu prensip kanıtı çalışmasını bir rehber olarak kullanarak, ürotelyumun adenoviral aracılı transdüksiyonu, Rab ailesi GTPazları, guanin-nükleotid değişim faktörleri, miyozin motor fragmanları, gözenek oluşturan sıkı bağlantı ile ilişkili klodinler ve ADAM17 10,19,20,21,22 dahil olmak üzere çeşitli proteinleri ifade etmek için kullanılmıştır . Aynı yaklaşım, etkileri transgen^22'nin siRNA'ya dirençli varyantlarının birlikte eksprese edilmesiyle kurtarılan küçük müdahale eden RNA'ları (siRNA) ifade etmek için uyarlandı. Burada açıklanan protokol, bu teknikler için bir gereklilik olan büyük miktarlarda yüksek konsantrasyonlu adenovirüs üretmek için genel yöntemlerin yanı sıra, ürotelyumdaki transgenleri yüksek verimlilikle ifade etmek için Ramesh ve ^ark.18 yöntemlerinin uyarlanmasını içerir.

Protokol

BSL2 sertifikası gerektiren adenovirüslerin üretimini içeren deneyler, Pittsburgh Üniversitesi Çevre Sağlığı ve Güvenliği ofisleri ve Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi'nin onayı altında gerçekleştirildi. Adenoviral transdüksiyon (ABSL2 sertifikası gerektiren) dahil olmak üzere gerçekleştirilen tüm hayvan deneyleri, İnsancıl Bakım ve Laboratuvar Hayvanlarının Kullanımına İlişkin Halk Sağlığı Hizmeti Politikası ve Hayvan Refahı Yasası'nın ilgili yönergelerine / düzenlemelerine uygun olarak ve Pittsburgh Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'nin onayı altında yapılmıştır. Rekombinant virüsleri içeren tüm prosedürler için eldiven, göz koruması ve uygun giysi giyilir. Herhangi bir sıvı veya katı atık aşağıda açıklandığı gibi bertaraf edilmelidir. Transdüksiyon sonrası hayvanların yatakları ve ortaya çıkan hayvan karkasları, biyolojik tehlikeli maddeler olarak ele alınmalı ve kurumsal politikalara göre bertaraf edilmelidir.

1. Yüksek titreli adenovirüs stoklarının hazırlanması

NOT: Kemirgen mesanelerinin etkili transdüksiyonu, saflaştırılmış ve konsantre viral stokların, tipik olarak μL başına 1 x 10⁷ ila 1 x 10⁸ enfeksiyöz viral partiküllerin (IVP) kullanımına bağlıdır. Protokolün bu kısmı, mevcut virüs preparatlarından yüksek titreli adenovirüs stokları üretmeye odaklanmıştır. Tüm adımlar, steril reaktifler ve aletler kullanılarak bir hücre kültürü davlumbazında gerçekleştirilmelidir. Günümüzde kullanılan mevcut adenovirüs suşları replikasyon kusurlu olsa da, çoğu kurum adenovirüsleri ve rekombinant DNA'yı kullanmak için onay gerektirir. Bu genellikle adenovirüsleri üretmek ve büyütmek için BSL2 onaylı bir tesis olarak bir hücre kültürü odasının belirlenmesini içerir. Bazı genel hususlar, virüs üretimi ve saflaştırmasının her aşamasında maske, göz koruması, eldiven ve uygun giysi kullanımını içerir. Santrifüjleme yaparken, santrifüj tüplerinde sıkı oturan kapaklar yoksa güvenlik kapakları önerilir. Potansiyel olarak kontamine olmuş santrifüj güvenlik kapakları, şişeler ve rotorlar dahil olmak üzere tek kullanımlık olmayan tüm malzemeler antiviral bir çözelti ile muamele edilir ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve daha sonra su veya% 70 etanol ile durulanır. Sıvı atıklar, %10'luk (v/v) nihai konsantrasyona çamaşır suyu ilave edilerek arıtılır. Bu sıvı atıkların bertarafı kurumsal politikalara bağlı olacaktır. Katı atıklar tipik olarak biyolojik tehlikeli atıklarda bertaraf edilir.

1. Kültür HEK293T hücreleri
   1. Dondurulmuş bir HEK293T hücresi şişesini 37 °C'de bir su banyosunda çözün ve hücreleri 15 cm çapında bir hücre kültürü kabına aktarmak için 5 mL'lik bir pipet kullanın. 25 mL'lik bir pipet kullanarak, yemeğe yavaşça %10 (v/v) fetal sığır serumu ve penisilin/streptomisin antibiyotik (DMEM-FBS-PS) içeren 20 mL Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamını (DMEM) ekleyin. Hücreleri, %80-%90 birleşim oranına (~2 x 10⁷ hücre) ulaşana kadar %5 (v/v) CO₂ ile gazlanmış 37 °C'lik bir hücre kültürü inkübatöründe inkübe edin.
   2. Bir vakum kaynağına bağlı bir cam pipet kullanarak, ortamı aspire edin ve ardından 25 mL'lik bir pipet kullanarak kaba 20 mL steril PBS (2,7 mM KCl, 1,5 mM KH 2 PO 4, 136,9 mM NaCl ve 8,9 mM Na₂HPO₄) aktararak hücreleri durulayın. Harcanan PBS'yi aspire edin ve daha sonra 3 mL ılık (37 ° C) proteinaz çözeltisini (Malzeme Tablosuna bakınız) tabağa aktarmak için 5 mL'lik bir pipet kullanın, çanak hücreler ayrılana kadar (~ 3-4 dakika) hücre kültürü inkübatöründe inkübe edin.
      NOT: Etkili proteoliz, çanağın tüm kısımlarından hücrelerin hareketli sıvıya salınmasını aramak için çanağı yavaşça ileri geri eğerek en iyi şekilde değerlendirilebilir. HEK293T hücreleri genişletilmiş proteinaz tedavisine duyarlıdır ve proteinaz çözeltisinde birkaç dakikadan fazla bırakılırsa ölürler.
   3. 7 mL DMEM-FBS-PS'yi ayrılmış hücrelerin kabına aktarmak için 10 mL'lik bir pipet kullanın ve ardından hücreleri ve ortamı aspire etmek için aynı pipeti kullanın. Asılı hücreleri 50 mL'lik bir konik tüpe aktarın ve daha sonra süspansiyonu 5 dakika boyunca 200 x g'de düşük hızlı bir klinik santrifüjde santrifüj ederek hücreleri pelet haline getirin. Bir vakum kaynağına bağlı bir cam pipet kullanarak süpernatantı aspire edin. Hücre peletini 15 mL DMEM-FBS-PS cinsinden yeniden askıya almak için 25 mL'lik bir pipet kullanın.
   4. 19 mL DMEM-FBS-PS içeren on beş adet 15 cm'lik kabın her birine 1 mL hücre süspansiyonu ekleyin.
   5. Hücreleri bir doku kültürü inkübatöründe% 85-90 birleşmeye (~ 3-4 gün) ulaşana kadar büyütün.
2. Seyreltilmiş bir virüs çözeltisi hazırlayın
   1. FBS veya antibiyotik içermeyen 45 mL DMEM ile doldurulmuş 50 mL'lik bir konik tüpe mevcut bir virüs stoğunun (5-10 IVP / hücre) ~ 1.5 x 10⁹ ila 3 x 10⁹ IVP'sini ekleyin.
      NOT: Virüsün daha düşük bir konsantrasyonunu (1-5 IVP / hücre) kullanmak mümkündür; ancak, virüs üretiminin ortaya çıkması daha uzun sürecektir.
3. Kültürlenmiş hücreleri virüsle enfekte edin.
   1. Bir vakum kaynağına bağlı bir cam pipet kullanarak, adım 1.1.5'te ortamı neredeyse birleşen hücrelerden aspire edin.
   2. Her bir hücre kültürü kabına 3,0 mL seyreltilmiş virüs çözeltisini (adım 1.2.1'de hazırlanan) aktarmak için 25 mL'lik bir pipet kullanın. Ardından, her bir yemeğe 7,0 mL DMEM ortamı (FBS veya antibiyotik içermeyen) eklemek için 10 mL'lik bir pipet kullanın. Bir hücre kültürü inkübatöründe 60 dakika boyunca inkübe edin ve ardından her bir yemeğe %20 (v / v) FBS ve 2x PS içeren 10 mL DMEM ekleyin.
      NOT: 15 çanaktan birini kontrol plakası olarak kullanmak (virüsün eklenmediği), bir sonraki adımda enfekte hücrelerde virüs kaynaklı hücre yuvarlamasını ve ölümünü tanımlamayı kolaylaştırır.
   3. Hücre kültürü inkübatöründeki hücreleri, çoğunluğu yuvarlanmaya başlayana ve hücrelerin% >60'ı ayrılana kadar 2-4 gün boyunca inkübe edin.
      NOT: Virüsün daha düşük bir titresi kullanılıyorsa, hücre ölümünün gerçekleşmesi bir hafta kadar sürebilir. Hücre ölümü bir hafta içinde gerçekleşmezse, işlemin virüsün daha yüksek bir titresi kullanılarak tekrarlanması gerekecektir.
4. Hücre lizatlarından virüsü kurtarın
   1. Her çanağın tabanını kazımak için bir hücre kazıyıcı kullanın ve bağlı hücreleri ortama bırakın.
   2. 25 mL'lik bir pipet kullanarak, her hücre kültürü kabındaki ortamı, hücreleri ve hücre kalıntılarını toplayın ve 50 mL'lik bir konik hücre kültürü tüpünde toplayın.
      NOT: Kaynaklardan tasarruf etmek için, iki çanaktan gelen ortam bir 50 mL tüpte birleştirilebilir.
   3. Düşük hızlı bir masa üstü santrifüj kullanarak santrifüjleme yoluyla hücresel malzemeyi peletleyin: 3.000 x g'de oda sıcaklığında 5 dakika. Süpernatanı aspire etmek için vakum cihazına bağlı bir cam pipet kullanın.
   4. Elde edilen tüm peletlenmiş malzemeyi, 10 mM EDTA (Tris-EDTA çözeltisi) içeren toplam 7 mL steril filtrelenmiş 100 mM Tris-HCl pH 7,4 içinde birleştirmek için tritürasyonla birlikte 10 mL'lik bir pipet kullanın. Toplanan malzemeyi steril bir 15 mL hücre kültürü konik tüpüne aktarın ve buzun üzerine yerleştirin.
      NOT: Bu noktada, virüs hazırlığı -80 °C'de süresiz olarak dondurulabilir.
5. Hücre lizatlarını hazırlayın
   1. Kalan hücreleri bozmak için üç donma-çözülme döngüsü gerçekleştirin ve böylece oluşan virüs parçacıklarını daha da serbest bırakın. Havuzlanmış malzemeyi adım 1.4.4'te, tüpü sıvı azota (~ 30-60 s) batırarak dondurun. Tüpü 37 °C'lik bir inkübatöre yerleştirerek numuneyi hızla çözün. Numuneyi 15 saniye boyunca vorteks edin ve ardından hızlı dondurma ve çözme prosedürünü 2 kat daha tekrarlayın.
      NOT: Virüs çözeltisi bir su banyosunda 37 ° C'de hızla çözülebilir, ancak sıcaklık dalgalanmaları tüpün çatlamasına ve virüs çözeltisinin su banyosuna salınmasına neden olabileceğinden dikkatli olunması gerekir. Bunun oluşmasını önlemek için, viral süpernatant içeren tüpü, daha sonra su banyosuna yerleştirilen daha büyük bir tüpe yerleştirin.
   2. Üç kez dondurularak çözülmüş hücresel malzemeyi süper hızlı bir santrifüj tüpüne aktarmak için 10 mL'lik bir pipet kullanın. Tüpteki malzemeyi ~ 18.500 x g'de 4 ° C süper hızlı santrifüjde 30 dakika boyunca santrifüjleyin.
   3. ~7 mL virüs bakımından zengin süpernatantı 10 mL'lik bir pipetle kurtarın ve 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın. Numuneyi bir sonraki adıma kadar buz üzerinde tutun.
      NOT: Bu noktada, saflaştırılmamış viral süpernatantın bir alikotunu yeni bir virüs preparatı başlatmak için bir giriş olarak (veya yedek olarak) tutmayı düşünün. Bu aliquot -80 °C'de saklayın.
6. Yoğunluk gradyanı santrifüjleme kullanarak virüsü izole edin ve saflaştırın.
   1. 12 mL PET ince duvarlı, şeffaf ultra santrifüj tüpünde ( Malzeme Tablosuna bakınız) veya eşdeğerinde süreksiz bir CsCl gradyanı hazırlayın. Tüpün dibine 2,5 mL 1,4 g/mL CsCl çözeltisini dikkatlice sokmak için 18 G iğne ile donatılmış 3 mL'lik bir şırınga kullanın ve ardından 2,5 mL 1,25 g / mL CsCl çözeltisi ile katmanlamak için yeni bir şırınga / iğne kullanın.
      NOT: Çözeltileri doğrudan önceden var olan bir katmanın üzerine bırakmak, önemli ve istenmeyen karıştırmalara neden olur. Bunun yerine, iğnenin eğimli kısmını tüpün kenarına yerleştirin ve ardından şırınga pistonuna çok yavaşça bastırın, çözelti tüpü doldururken iğnenin konumunu yükseltin.
   2. 10 mL'lik bir şırınga kullanarak ~ 7 mL viral süpernatantı gradyanın üzerine benzer şekilde yükleyin. Viral süpernatant ile tüpün üst kısmı arasında 2-3 mm'den fazla boşluk varsa, tüpü sadece 2-3 mm boşluk kalana kadar doldurmak için ek Tris-EDTA çözeltisi ekleyin.
   3. CsCl katmanları içeren, ancak viral süpernatan için Tris-EDTA çözeltisinin yerini alan benzer şekilde hazırlanmış bir denge tüpü yapın.
      NOT: İki tüp, ultra santrifüjde potansiyel olarak tehlikeli bir dengesiz yük durumunu önlemek için aynı ağırlıklara (ve benzer yoğunluklara) sahip olmalıdır.
7. Hızı zonal ultrasantrifüjleme kullanarak virüsü izole edin.
   1. 1.6.2-1.6.3 adımlarında oluşturulan gradyanları SW41 rotorunun veya eşdeğerinin kovalarına yükleyin. Kova kapaklarına vidalayın, rotoru bir ultra santrifüje yerleştirin (4 ° C'ye kadar önceden soğutulmuş) ve ~ 150.000 x g'de 1 saat boyunca santrifüj.
   2. Santrifüjleme sırasında, aşağıdaki adım 1.9.1'de açıklanan sütunu dengeleyin.
8. İzole virüs parçacıklarını kurtarın
   1. Santrifüjleme adımının sonunda, kovaları rotordan dikkatlice ayırın ve bir hücre kültürü başlığında, kova kapaklarını çıkarın ve ardından tüpleri çıkarın ve bir rafa yerleştirin.
   2. 1,25 g/mL ile 1,4 g/mL CsCl çözeltisi arasındaki arayüzde yüzen virüs parçacıkları bakımından zengin bantlı malzemeyi toplayın. Degradeyi içeren tüpü bir hücre kültürü kabının alt yarısı üzerinde tutarak (dökülen herhangi bir malzemeyi yakalayacak), tüpü bantlı virüsün hemen altında dikkatlice delmek için 3 mL'lik bir şırıngaya bağlı 1 inç 18 G iğne kullanın. Tipik olarak ~ 1 mL'de iyileşen virüsü yavaşça aspire edin.
   3. İğneyi tüpten çıkarın, bu da gradyanda kalan malzemenin tüpten hücre kültürü kabının alt yarısına akmasına neden olur (herhangi bir sıvı tehlikeli atık olarak muamele edilmelidir).
   4. Şırıngadaki virüs çözeltisini buz üzerindeki steril bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
      NOT: Bu adımda virüsü kurtarırken, iğneyi, iğnenin lümeni yukarı bakacak ve iğne virüs bakımından zengin bandın birkaç mm altında açılacak şekilde konumlandırın. Bazen bantlı virüsün 2-3 mm yukarısında gözlenen, yanlış monte edilmiş virüsün ince bandı tarafından kontaminasyondan kaçının ( bkz. Şekil 1A'daki ince siyah ok).
9. CsCl'yi jel filtrasyonu ile numuneden çıkarın.
   1. Bir destek standına tutturulmuş bir PD-10 sütununu (Sephadex G-25M ile önceden paketlenmiş), %10 (v/v) gliserol içeren 50 mL'lik 0,2 μm steril filtreli PBS ile dengeleyin.
      NOT: İlk dengeleme adımının tamamlanması 2-3 saat sürer ve üretici tarafından kolonu stabilize etmek için kullanılan koruyucuların tamamen yıkanmasını sağlamak için gereklidir.
   2. Yıkama çözeltisinin fritin altına çekilmesine izin verin (sütun ortamının üstündeki koruyucu bir beyaz malzeme diski) ve ardından adım 1.8'de toplanan saflaştırılmış virüs çözeltisini sütunun üstüne dikkatlice aktarın. Virüs bakımından zengin çözeltinin fritin altına çekilmesine izin verin ve ardından sütunu PBS-gliserol ile doldurmaya başlayın.
      NOT: Fritin bir işlevi, kolonun kurumasını önlemektir. Sonuç olarak, sütuna daha fazla elüant eklenmeden önce kısa gecikmeler tolere edilir.
   3. Elüatı 12 steril mikrosantrifüj tüpünde, fraksiyon başına 0,5 mL'de toplayın.
10. Viral verimi belirleyin.
    1. Spektrofotometri kullanarak tepe virüs fraksiyonlarını belirleyin. PBS'de her fraksiyonun 1:100 seyreltmesini hazırlayın ve OD_260'ı bir spektrofotometrede tek başına 1:100 tampon seyreltme kullanarak boş olarak ölçün. Virüs parçacıkları, fraksiyon 6 civarında başlayarak boşluk hacminde serbest bırakılmalıdır. En yüksek OD₂₆₀ okumalarını içeren kesirleri bir araya getirin.
    2. Havuzlanmış viral fraksiyonların 1:100 seyreltilmesini yapın ve OD_260'ı yeniden ölçün. Aşağıdaki formülü kullanarak virüs parçacıklarının nihai konsantrasyonunu ve havuzlanmış fraksiyonlardaki IVP sayısını hesaplayın: mL başına virüs parçacıkları = OD₂₆₀ × 100 (bu, seyreltme faktörü için düzeltir) × 10¹². Genel bir tahmin, virüs parçacıklarının% 1'inin IVP olduğudur, şu şekilde: IVP / mL = OD 260 × 100 × 10 10 veya IVP / μL = OD₂₆₀ × 100 × ^{10 7}.
11. Havuzlanmış virüs fraksiyonlarını (5 x 10⁷ ila 1 x 10⁸ IVP içeren) steril mikrosantrifüj tüplerine veya kriyovyal maddelere ayırın. Numuneleri -80 °C'de saklayın.

2. Kemirgen mesanesinin iletimi

NOT: Bu teknikte yeniyseniz, bir seferde transdübe edilen hayvan sayısının 2-4 ile sınırlandırılması önerilir. Bu, özellikle adım 2.2'deki deterjan tedavisi sırasında ve daha sonra adım 2.3'te virüs inkübasyonu sırasında her hayvan için başlangıç zamanlarını şaşırtarak gerçekleştirilebilir. Deneyimli araştırmacılar bir seferde altı hayvana kadar transdübe yapabilirler.

1. Mesaneyi kateterize edin
   1. Dişi C57Bl / 6J fareleri (tipik olarak 8-10 haftalık, ~ 20-25 g) veya dişi Sprague Dawley sıçanlarını (tipik olarak 2-3 aylık, ~ 250 g) ekli bir burun konisi ile bir buharlaştırıcı kullanarak anestezi yapın. Buharlaştırıcıyı, fareler için %3,0 (v/v) izofluran, %97 (v/v) O2 veya sıçanlar için %4,0 (v/v) izofluran, %96 (v/v)_O2 üretecek şekilde kalibre edin. Ayak parmaklarının sıkışmasına tepki vermediklerinden emin olarak hayvanların uyuşturulduğunu doğrulayın (tipik olarak 1-2 dakika sonra).
   2. Hayvanları ısıtılmış bir ped üzerine yerleştirerek hayvanın vücut ısısını koruyun. Hayvanların anestezi altına alındığından ve bu işlem sırasında herhangi bir acı yaşamadığından emin olmak için transdüksiyon protokolü boyunca hayvanı izleyin.
   3. İzofluran'ı fareler için% 1.5'e (v / v) veya sıçanlar için% 2.0'a (v / v) düşürün ve hayvanları protokol süresince anestezi altında tutun.
   4. Mesaneye hava girmesini önlemek için, bir IV kateterinin plastik kateter kısmını ( bakınız Malzeme Tablosu) ve ilişkili göbeği bir transfer pipeti kullanarak steril PBS ile doldurun.
   5. Hayvan sırtüstü pozisyondayken, dış meatusu% 70 alkolle sürün ve steril kateteri dış meatusa, sonra üretraya ve daha sonra mesaneye yerleştirin.
      1. Bu görevi yerine getirmek için, dış meatusu oluşturan dokuyu nazikçe tutmak ve hayvandan uzağa dikey olarak uzatmak için ince forseps kullanın. Diğer elinizi kullanarak, kateteri üretral meatusa (vajinanın açıklığının hemen üstünde bir et höyüğü) dikey olarak yaklaşık 3-4 mm dikey olarak dikkatlice yerleştirin. Daha sonra, üretradaki bir bükülme nedeniyle, dış meatusa yerleştirilen kateteri, hayvanın kuyruğuna doğru indirin, bu da üretranın kasık kemiğinin altından geçen kısmına ve nihayetinde mesaneye girişini kolaylaştırır
         . NOT: Özellikle fare söz konusu olduğunda, kateter çok uzun olabilir ve hayvanın içine 1.0-1.1 cm'den fazla yerleştirilmemelidir. Aksi takdirde, mesane mukozasında hasar meydana gelecektir. Bunu önlemek için, kateteri ucunun ~ 1 cm altında işaretleyin ve ardından kateteri bu işaretin ötesine yerleştirmeyin.
   6. Mesanedeki idrarın dışarı sızmasına izin verin. Credé'nin manevrasını yaparak kalan idrarı çıkarın: masaj yapın ve alt karın bölgesindeki mesane yumruğuna hafifçe bastırın.
2. Ürotelyumu bir deterjan çözeltisi ile muamele ederek transdüksiyona açık hale getirin.
   1. Kateter göbeğine PBS ile doldurulmuş steril bir 1 mL şırınga takarak fare veya sıçan mesanesini yıkayın. Fare kesesine 100 μL steril PBS enjekte edin (veya sıçan mesanesi durumunda 450 μL). Şırıngayı kateter bağlantısından ayırın ve PBS'nin boşalmasına izin verin. Gerekirse, fazla mesane sıvısını çıkarmak için Crede'nin manevrasını yapın.
   2. Steril 1 mL şırınga kullanarak fare kesesine 100 μL %0,1 (w/v) N-dodesyl-β-D-maltoside (DDM) (PBS'de çözünmüş ve 0,2 μm filtreyle sterilize edilmiş) damlatın. Şırıngayı yerinde bırakarak DDM'yi mesanede 10 dakika tutun. Sıçanlarda, DDM hacmi 450 μL'ye yükseltilir.
   3. Şırıngayı ayırarak ve boşalmasına izin vererek DDM'yi mesaneden çıkarın. Gerekirse Crede'nin manevrasını yapın.
3. Virüsü mesaneye sokun.
   1. Kateter göbeğine steril bir 1 mL şırınga takın ve 0.5 x 10⁷ ila 1 x 10⁸ IVP adenovirüs (1. adımda hazırlanan), fareler için 100 μL steril PBS veya sıçanlar için 450 μL ile seyreltilmiş mesaneye aşılayın. Virüs çözeltisinin kaçmasını önlemek için şırıngayı kateterin üzerine bağlı bırakın.
   2. 30 dakika sonra, şırıngayı ayırın ve virüs çözeltisinin mesaneyi tek kullanımlık bir ped üzerine boşaltmasına izin verin. Herhangi bir artık virüs çözeltisini emici bir mendille lekeleyin ve pedi atın ve biyolojik olarak tehlikeli atıkları silin.
      NOT: Gliserol sitotoksiktir. Bu nedenle, farelere aşılanan maksimum virüs çözeltisi hacmi 5 μL ile sınırlıdır (100 μL PBS'ye seyreltildiğinde, ~% 0.5'lik bir nihai gliserol konsantrasyonuna neden olur [v / v]). Ek olarak, aşılanan IVP sayısını artırarak ve virüs inkübasyonunu 45 dakikaya uzatarak iletim verimliliğini artırmak mümkündür.
   3. İsteğe bağlı adım: Mesane, yukarıdaki adım 2.2.1'de açıklandığı gibi PBS ile durulanabilir; ancak, bu gerekli değildir.
4. Hayvanın iyileşmesine izin verin.
   1. İzofluran akışını durdurun ve özellikle hayvanlar grup halinde barındırılıyorsa, hayvanın kafesine geri döndürmeden önce iyileşmesine ve tamamen hareketli olmasına izin verin.
      NOT: Virüs iletimi kendi başına gözlenebilir alt üriner sistem semptomlarına veya ağrıya neden olmadığından, genellikle cerrahi sonrası tedaviye gerek yoktur. Bununla birlikte, kodlanmış transgen toksik ise, kurumun gerektirdiği şekilde işlem sonrası analjezi veya antibiyotikler gerekli olabilir.
5. Transgen ekspresyonunun etkilerini tedavi sonrası 12-72 saat sonra mRNA in situ hibridizasyon, batı lekesi veya immünofloresan ^9,10,23 gibi yöntemleri kullanarak analiz edin (temsili sonuçlara bakınız).

Sonuçlar

Virüs hazırlığı
Yoğunluk gradyanı santrifüjleme ile virüs saflaştırmanın bir örneği Şekil 1A'da gösterilmiştir. Yüklenen hücresel malzemenin ve 1.25 g / mL CsCl tabakasının arayüzünde bulunan açık pembe bant, esas olarak bozulmuş hücrelerden ve kalıntılarından oluşur ( Şekil 1A'daki macenta okuna bakınız). Pembemsi rengini, protokoldeki adım 1.5'ten taşınan az miktarda kültür ortamından alır. Süt beya...

Tartışmalar

Ramesh ve ark. mesane kanseri tedavisinde adenoviral transdüksiyonu kullanmak için stratejiler geliştirmeye odaklanmış olsalar da 18, daha yeni raporlar bu tekniklerin normal ürotelyal biyoloji / fizyoloji ve patofizyoloji 10,18,19,20,21 çalışmalarında yararlılığını göstermiştir . Bu yaklaşımın önemli özellikleri ?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL pipette	Corning Costar (Millipore Sigma)	CLS4488	sterile, serological pipette, individually wrapped
12 mL ultracentrifuge tube	ThermoFisher	06-752	PET thinwall ultracentrifuge tube
15 mL conical centrifuge tube	Falcon (Corning)	352097	sterile
18 G needle	BD	305196	18 G x 1.5 in needle
20 mL pipette	Corning Costar (Millipore Sigma)	CLS4489	sterile, serological pipette, individually wrapped
50 mL conical centrifuge tube	Falcon (Corning)	352098	sterile
5 mL pipette	Corning Costar (Millipore Sigma)	CLS4487	sterile, serological pipette, individually wrapped
Cavicide	Henry Schein	6400012	Anti-viral solution
Cell culture dish - 15 cm	Falcon (Corning)	353025	sterile, tissue-culture treated  (150 mm x 25 mm dish)
Cell scraper	Sarstedt	893.1832	handle length 24 cm, blade length 1.7 cm
CsCl	Millipore Sigma	C-4306	Molecular Biology grade ≥ 98%
DMEM culture medium (high glucose)	Gibco (ThermoFisher)	11965092	with 4.5 g/L glucose + L-glutamine + phenol red
EDTA	Millipore Sigma	EDS	Bioiultra grade ≥ 99%
Fetal bovine serum	Hyclone (Cytiva)	SH30070.03	defined serum
Glass pipette	Fisher Scientific	13-678-20A	5.75 in glass pipette, autoclaved
Glycerol	Millipore Sigma	G-5516	Molecular Biology grade ≥ 99%
HEK293 cells	ATCC	CRL-3216	HEK293T cells are a variant of HEK293 cells that express the SV40 large T-antigen
Isoflurane	Covetrus	29405
IV catheter - mouse	Smith Medical Jelco	3063	24 G x 3/4 in Safety IV catheter  radiopaque
IV catheter - rat	Smith Medical Jelco	3060	22 G x 1 in Safety IV catheter radiopaque
KCl	Millipore Sigma	P-9541	Molecular Biology grade ≥ 99%
KH2PO4	Millipore Sigma	P5655	Cell culture grade  ≥ 99%
Na2HPO4•7 H2O	Millipore Sigma	431478	≥ 99.99%
NaCl	Millipore Sigma	S3014	Molecular Biology grade ≥ 99%
N-dodecyl-β-D-maltoside	Millipore Sigma	D4641	≥ 98%
Nose cone for multiple animals	custom designed		commercial options include one from Parkland Scientific (RES3200)
PD-10 column	GE Healthcare	17-085-01	Prepacked columns filled ith Sephadex G-25M
Penicillin/streptomycin antibiotic (100x)	Gibco (ThermoFisher)	15070063	100x concentrated solution
Spectrophotometer	Eppendorf	BioPhotometer
Stand and clamp	Fisher Scientific	14-679Q and 05-769-8FQ	available from numerous suppliers
Sterile filter unit	Fisher Scientific (Nalgene)	09-740-65B	0.2 µm rapid-flow filter unit (150 mL)
Sterile filter unit 0.2 µm (syringe)	Fisher Scientific	SLGV004SL	Millipore Sigma Milex 0.22 µm filter unit that attaches to syringe
Super speed centrifuge	Eppendorf	5810R	with Eppendorf F34-6-38 fixed angle rotor (12,000 rpm)
Syringe (1 mL)	BD	309628	1-mL syringe Luer-lok tip - sterile
Syringe (3 mL)	BD	309656	3-mL syringe slip tip - sterile
Table-top centrifuge (low speed)	Eppendorf	5702	with swinging bucket rotor
Transfer pipettes	Fisher Scientific	13-711-9AM	polyethylene 3.4 mL transfer pipette
Tris-base	Millipore Sigma	648310-M	Molecular Biology grade
TrypLE select protease solution	Gibco (ThermoFisher)	12604013	TrypLE express enzyme (1x), no phenol red
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima L-80 XP	with Beckman SW41 rotor (41,000 rpm)
Vaporizer	General Anesthetic Services, Inc.	Tec 3	Isoflurane vaporizer
Vortex Mixer	VWR	10153-838	analog vortex mixer