Expressão de Transgenes no Urotélio da Bexiga Nativa utilizando Transdução Mediada por Adenovírus

Resumo

São descritos métodos para a geração de grandes quantidades de adenovírus recombinantes, que podem então ser usados para transduzir o urotélio nativo de roedores, permitindo a expressão de transgenes ou downregulation de produtos gênicos endógenos.

Resumo

Além de formar uma barreira de alta resistência, o urotélio que reveste a pelve renal, ureteres, bexiga e uretra proximal é hipotetizado para detectar e transmitir informações sobre seu ambiente aos tecidos subjacentes, promovendo a função e o comportamento miccional. A ruptura da barreira urotelial, ou sua função sensorial/transdutor, pode levar à doença. O estudo desses eventos complexos é dificultado pela falta de estratégias simples para alterar a expressão gênica e proteica no urotélio. São descritos métodos que permitem aos investigadores gerar grandes quantidades de adenovírus de alto título, que podem então ser usados para transduzir urotélio de roedores com alta eficiência e de maneira relativamente simples. Tanto cDNAs quanto pequenos RNAs interferentes podem ser expressos usando transdução adenoviral, e o impacto da expressão de transgênicos na função urotelial pode ser avaliado 12 h a vários dias depois. Estes métodos têm ampla aplicabilidade em estudos de biologia urotelial normal e anormal utilizando modelos animais de camundongos ou ratos.

Introdução

O urotélio é o epitélio especializado que reveste a pelve renal, ureteres, bexiga e uretra proximal¹. É composto por três estratos: uma camada de células guarda-chuva altamente diferenciadas e polarizadas, muitas vezes binucleadas, cujas superfícies apicais são banhadas por urina; uma camada celular intermediária com uma população de células binucleadas de amplificação de trânsito que pode dar origem a células guarda-chuva superficiais em resposta à sua perda aguda; e uma única camada de células basais, cujo subconjunto funciona como células-tronco que podem regenerar a totalidade do urotélio em resposta à lesão crônica. As células-guarda-chuva são as principais responsáveis pela formação da barreira urotelial de alta resistência, cujos componentes incluem uma membrana apical (rica em colesterol e cerebrosídeos) com baixa permeabilidade à água e solutos, e um complexo juncional apical de alta resistência (composto por tight junctions, junções aderentes, desmossomos e um anel de actomiosina associado)¹ . Tanto a superfície apical da célula guarda-chuva quanto seu anel juncional expandem-se durante o enchimento vesical e retornam ao seu estado pré-preenchido rapidamente após a micção 1,2,3,4,5. Além de seu papel na função de barreira, o urotélio também tem funções sensoriais e transdutores que lhe permitem detectar mudanças no meio extracelular (por exemplo, estiramento) e transmitir essa informação por meio da liberação de mediadores (incluindo ATP, adenosina e acetilcolina) para os tecidos subjacentes, incluindo processos nervosos aferentes suburoteliais ^6,7,8 . Evidências recentes desse papel são encontradas em camundongos sem expressão urotelial de Piezo1 e Piezo2, o que resulta em alteração da função miccional⁹. Além disso, ratos superexpressando a proteína formadora de poros de tight-junction CLDN2 na camada de células guarda-chuva desenvolvem inflamação e dor análogas àquelas observadas em pacientes com cistite intersticial¹⁰. Hipotetiza-se que a interrupção da função sensorial/transdutor ou barreira urotelial possa contribuir para vários distúrbios vesicais ^6,11.

Uma melhor compreensão da biologia do urotélio em estados normais e patológicos depende da disponibilidade de ferramentas que permitam aos investigadores prontamente desregular a expressão gênica endógena ou permitir a expressão de transgenes no tecido nativo. Enquanto uma abordagem para downregulate da expressão gênica é gerar camundongos knockout uroteliais condicionais, essa abordagem depende da disponibilidade de camundongos com alelos floxed, é trabalhosa e pode levar meses a anos para completar¹². Não surpreendentemente, então, os pesquisadores desenvolveram técnicas para transfectar ou transduzir o urotélio, o que pode levar a resultados em uma escala de tempo mais curta. Os métodos publicados para transfecção incluem o uso de lipídios catiônicos¹³, oligodesoxinucleotídeos fosforotiotados anti-senso 14 ou ácidos nucleicos antisenso ligados à proteína TAT do HIV penetrando no peptídeo 11-mer¹⁵. No entanto, o foco deste protocolo é no uso da transdução mediada por adenovírus, uma metodologia bem estudada que é eficiente na entrega do gene a uma ampla gama de pilhas, foi testada em numerosos ensaios clínicos, e mais recentemente foi usada para entregar o cDNA que codifica a proteína do capsídeo COVID-19 aos receptores de uma variante da vacina COVID-19^{16, 17º}. Para uma descrição mais completa do ciclo de vida dos adenovírus, vetores adenovirais e aplicações clínicas dos adenovírus, o leitor é direcionado para a referência¹⁷.

Um marco importante no uso de adenovírus para transduzir o urotélio foi o relato de Ramesh e col. que mostrou pré-tratamentos curtos com detergentes, incluindo N-dodecil-β-D-maltosídeo (DDM) que aumentaram drasticamente a transdução do urotélio por um adenovírus que codifica a β-galactosidase¹⁸. Usando este estudo de prova de princípio como guia, a transdução mediada por adenovírus do urotélio tem sido agora usada para expressar uma variedade de proteínas, incluindo GTPases da família Rab, fatores de troca de guanina-nucleotídeos, fragmentos motores de miosina, claudinas associadas à junção apertada formadora de poros e ADAM17 10,19,20,21,22 . A mesma abordagem foi adaptada para expressar pequenos RNAs interferentes (siRNA), cujos efeitos foram resgatados pela co-expressão de variantes resistentes a siRNA do transgene²². O protocolo aqui descrito inclui métodos gerais para gerar grandes quantidades de adenovírus altamente concentrados, uma exigência para essas técnicas, bem como adaptações dos métodos de Ramesh et ^al.18 para expressar transgenes no urotélio com alta eficiência.

Protocolo

Experimentos envolvendo a geração de adenovírus, que requer certificação BSL2, foram realizados sob aprovação dos escritórios de Saúde e Segurança Ambiental da Universidade de Pittsburgh e do Comitê Institucional de Biossegurança. Todos os experimentos com animais realizados, incluindo a transdução adenoviral (que requer a certificação ABSL2), foram feitos de acordo com as diretrizes/regulamentos relevantes da Política de Serviço de Saúde Pública sobre Cuidados Humanos e Uso de Animais de Laboratório e da Lei de Bem-Estar Animal, e sob a aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Pittsburgh. Luvas, proteção ocular e vestuário apropriado são usados para todos os procedimentos que envolvem vírus recombinantes. Qualquer resíduo líquido ou sólido deve ser descartado conforme descrito abaixo. A cama dos animais após a transdução, e quaisquer carcaças de animais resultantes, devem ser tratadas como materiais bioperigosos e descartadas de acordo com as políticas institucionais.

1. Preparação de estoques de adenovírus de alto título

NOTA: A transdução eficaz de bexigas de roedores depende do uso de estoques virais purificados e concentrados, tipicamente 1 x 10⁷ a 1 x 10⁸ partículas virais infecciosas (PIV) por μL. Esta parte do protocolo é focada na geração de estoques de adenovírus de alto título a partir de preparações de vírus existentes. Todas as etapas devem ser realizadas em capela de cultura celular utilizando reagentes e ferramentas estéreis. Embora as cepas disponíveis de adenovírus usadas hoje sejam defeituosas de replicação, a maioria das instituições exige aprovação para usar adenovírus e DNA recombinante. Isso geralmente inclui a designação de uma sala de cultura de células como uma instalação aprovada pela BSL2 para produzir e amplificar adenovírus. Algumas considerações gerais incluem o uso de máscaras, proteção ocular, luvas e roupas apropriadas em todos os estágios de produção e purificação do vírus. Ao realizar a centrifugação, as tampas de segurança são recomendadas se os tubos da centrífuga não tiverem tampas de encaixe apertadas. Todos os materiais não descartáveis, incluindo tampas de segurança de centrífugas potencialmente contaminadas, garrafas e rotores são tratados com uma solução antiviral (consulte a Tabela de Materiais) e, em seguida, enxaguados com água ou etanol 70%. Os resíduos líquidos são tratados pela adição de água sanitária a uma concentração final de 10% (v/v). A destinação desses resíduos líquidos dependerá de políticas institucionais. Os resíduos sólidos são normalmente dispostos em resíduos bioperigosos.

1. Cultura de células HEK293T
   1. Descongelar um frasco congelado de células HEK293T em banho-maria a 37 °C e usar uma pipeta de 5 mL para transferir as células para uma placa de cultura celular de 15 cm de diâmetro. Com uma pipeta de 25 mL, adicione lentamente 20 mL de Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) contendo 10% (v/v) de soro fetal bovino e antibiótico penicilina/estreptomicina (DMEM-FBS-PS) ao prato. Incubar as células em uma incubadora de cultura celular a 37 °C gaseificado com 5% (v/v) de CO₂ até que atinjam 80%-90% de confluência (~2 x 10⁷ células).
   2. Usando uma pipeta de vidro conectada a uma fonte de vácuo, aspirar o meio e, em seguida, enxaguar as células transferindo 20 mL de PBS estéril (2,7 mM KCl, 1,5 mM KH2 PO 4, 136,9 mM NaCl e 8,9 mM Na₂HPO₄) para a placa usando uma pipeta de 25 mL. Aspirar o PBS gasto e, em seguida, usar uma pipeta de 5 mL para transferir 3 mL de solução de proteinase morna (37 °C) (ver Tabela de Materiais) para o prato, incubando o prato na incubadora de cultura celular até que as células se desprenda (~3-4 min).
      NOTA: A proteólise eficaz pode ser melhor avaliada inclinando lentamente o prato para frente e para trás procurando a liberação de células de todas as porções do prato no fluido em movimento. As células HEK293T são sensíveis ao tratamento prolongado com proteinases e morrerão se deixadas mais do que alguns minutos em solução de proteinase.
   3. Use uma pipeta de 10 mL para transferir 7 mL de DMEM-FBS-PS para a placa de células destacadas e, em seguida, use a mesma pipeta para aspirar as células e o meio. Transfira as células suspensas para um tubo cônico de 50 mL e, em seguida, peletize as células centrifugando a suspensão em uma centrífuga clínica de baixa velocidade a 200 x g por 5 min. Aspirar o sobrenadante usando uma pipeta de vidro conectada a uma fonte de vácuo. Use uma pipeta de 25 mL para ressuspender o pellet de células em 15 mL de DMEM-FBS-PS.
   4. Adicionar 1 mL da suspensão celular a cada uma das quinze placas de 15 cm contendo 19 mL de DMEM-FBS-PS.
   5. Cultivar as células em uma incubadora de cultura de tecidos até que atinjam 85%-90% de confluência (~3-4 dias).
2. Preparar uma solução de vírus diluída
   1. Adicione ~1,5 x 10 9 a 3 x 10⁹ IVP de um estoque de vírus existente (5-10 IVP/célula) a um tubo cônico de 50 mL preenchido com 45 mL de DMEM sem SFB ou antibióticos.
      NOTA: É possível usar uma concentração mais baixa do vírus (1-5 IVP/célula); no entanto, levará mais tempo para que a produção do vírus ocorra.
3. Infectar as células cultivadas com o vírus.
   1. Usando uma pipeta de vidro ligada a uma fonte de vácuo, aspirar o meio das células quase confluentes na etapa 1.1.5.
   2. Utilizar uma pipeta de 25 ml para transferir 3,0 ml de solução viral diluída (preparada no passo 1.2.1) para cada placa de cultura celular. Em seguida, use uma pipeta de 10 mL para adicionar 7,0 mL de meio DMEM (sem FBS ou antibióticos) a cada prato. Incubar por 60 min em uma incubadora de cultura celular e, em seguida, adicionar 10 mL de DMEM contendo 20% (v/v) de SFB e 2x PS a cada prato.
      NOTA: Usar uma das 15 placas como placa de controle (na qual o vírus não é adicionado) facilita a identificação de arredondamento celular induzido pelo vírus e morte em células infectadas na próxima etapa.
   3. Incubar as células na incubadora de cultura celular por 2-4 dias até que a maioria delas comece a arredondar e >60% das células tenham se destacado.
      NOTA: Se usar um título mais baixo do vírus, pode levar até uma semana para que a morte celular ocorra. Se a morte celular não ocorrer dentro de uma semana, é provável que o processo precise ser repetido usando um título mais alto do vírus.
4. Recuperar vírus de lisados celulares
   1. Use um raspador de células para raspar o fundo de cada prato, liberando células conectadas no meio.
   2. Usando uma pipeta de 25 mL, colete e agrupe o meio, as células e os restos celulares de cada placa de cultura celular em um tubo de cultura de células cônico de 50 mL.
      NOTA: Para economizar recursos, o meio de dois pratos pode ser combinado em um tubo de 50 mL.
   3. Pellet o material celular por centrifugação usando uma centrífuga de mesa de baixa velocidade: 5 min à temperatura ambiente a 3.000 x g. Use uma pipeta de vidro acoplada a um dispositivo de vácuo para aspirar o sobrenadante.
   4. Utilizar uma pipeta de 10 mL, combinada com trituração, para consolidar todo o material peletizado resultante em um total de 7 mL de Tris-HCl 100 mM filtrado estéril pH 7,4 contendo 10 mM EDTA (solução de Tris-EDTA). Transfira o material agrupado para um tubo cônico estéril de 15 mL de cultura celular e coloque no gelo.
      NOTA: Neste ponto, a preparação do vírus pode ser congelada a -80 °C indefinidamente.
5. Preparar lisados celulares
   1. Realizar três ciclos de congelamento-descongelamento para interromper as células restantes e, assim, liberar ainda mais as partículas virais formadas. Congelar o material agrupado na etapa 1.4.4 submergindo o tubo em nitrogênio líquido (~30-60 s). Descongelar rapidamente a amostra colocando o tubo numa incubadora a 37 °C. Vórtice a amostra por 15 s e, em seguida, repita o procedimento de congelamento e descongelamento rápido mais 2x.
      NOTA: A solução de vírus pode ser rapidamente descongelada em uma temperatura de 37 °C em banho-maria, mas é necessário cuidado, pois as oscilações de temperatura podem fazer com que o tubo rache, liberando a solução de vírus no banho-maria. Para evitar que isso ocorra, coloque o tubo que contém o sobrenadante viral em um tubo maior, que é então colocado no banho-maria.
   2. Use uma pipeta de 10 mL para transferir o material celular descongelado três vezes para um tubo de centrífuga de supervelocidade. Centrifugar o material no tubo por 30 min a 4 °C de centrífuga de supervelocidade a ~18.500 x g.
   3. Recupere o sobrenadante rico em vírus ~7 mL com uma pipeta de 10 mL e transfira-o para um tubo cônico de 15 mL. Retenha a amostra no gelo até a próxima etapa.
      NOTA: Neste ponto, considere manter uma alíquota do sobrenadante viral não purificado como um preâmbulo para iniciar uma nova preparação de vírus (ou como um backup). Conservar esta alíquota a -80 °C.
6. Isolar e purificar o vírus usando centrifugação por gradiente de densidade.
   1. Preparar um gradiente descontínuo de CsCl em um tubo de ultracentrífuga transparente de parede fina PET de 12 mL (ver Tabela de Materiais) ou equivalente. Use uma seringa de 3 mL equipada com uma agulha de 18 G para introduzir cuidadosamente 2,5 mL de solução de CsCl 1,4 g/mL no fundo do tubo e, em seguida, use uma nova seringa/agulha para cobri-la com 2,5 mL de solução de CsCl 1,25 g/mL.
      NOTA: Soltar soluções diretamente sobre uma camada pré-existente causará uma mistura significativa e indesejada. Em vez disso, coloque a porção chanfrada da agulha contra a borda do tubo e, em seguida, pressione muito lentamente o êmbolo da seringa, elevando a posição da agulha à medida que a solução enche o tubo.
   2. Coloque o ~7 mL de sobrenadante viral sobre o gradiente de maneira semelhante usando uma seringa de 10 mL. Se houver mais de 2-3 mm de espaço entre o sobrenadante viral e a parte superior do tubo, adicione solução adicional de Tris-EDTA para encher o tubo até que restem apenas 2-3 mm de espaço.
   3. Faça um tubo de equilíbrio preparado de forma semelhante, contendo camadas de CsCl, mas substituindo a solução de Tris-EDTA pelo sobrenadante viral.
      NOTA: Os dois tubos devem ter pesos idênticos (e densidades semelhantes) para evitar uma situação de carga desequilibrada potencialmente perigosa na ultracentrífuga.
7. Isolar o vírus usando ultracentrifugação zonal de taxa.
   1. Carregue os gradientes formados nas etapas 1.6.2-1.6.3 nas caçambas de um rotor SW41 ou equivalente. Rosqueie em tampas de caçamba, coloque o rotor em uma ultracentrífuga (pré-resfriada a 4 °C) e centrífuga por 1 h a ~150.000 x g.
   2. Durante a centrifugação, equilibrar a coluna descrita no passo 1.9.1 infra.
8. Recuperar partículas virais isoladas
   1. No final da etapa de centrifugação, retire cuidadosamente as caçambas do rotor e, em uma coifa de cultura celular, remova as tampas da caçamba e, em seguida, remova os tubos e coloque-os em um rack.
   2. Coletar o material bandado, rico em partículas virais, que flutua na interface entre a solução de CsCl de 1,25 g/mL e 1,4 g/mL. Segurando o tubo que contém o gradiente sobre a metade inferior de uma placa de cultura celular (que irá capturar qualquer material derramado), use uma agulha de 1 polegada 18 G conectada a uma seringa de 3 mL para perfurar cuidadosamente o tubo, logo abaixo do vírus bandado. Aspirar lentamente o vírus, que normalmente é recuperado em ~1 mL.
   3. Remova a agulha do tubo, o que resultará no material restante no gradiente para fluir para fora do tubo para a metade inferior da placa de cultura celular (quaisquer líquidos devem ser tratados como resíduos perigosos).
   4. Transfira a solução de vírus na seringa para um tubo de microcentrífuga estéril sobre gelo.
      NOTA: Ao recuperar o vírus nesta etapa, posicione a agulha de modo que o lúmen da agulha esteja voltado para cima com a agulha abrindo alguns milímetros abaixo da faixa rica em vírus. Evite a contaminação pela fina faixa de vírus mal montada que às vezes é observada 2-3 mm acima do vírus em bandas (veja seta preta fina na Figura 1A).
9. Remover CsCl da amostra por filtração em gel.
   1. Equilibre uma coluna PD-10 (pré-embalada com Sephadex G-25M), presa a um suporte com 50 mL de PBS filtrado estéril a 0,2 μm contendo glicerol a 10% (v/v).
      NOTA: A etapa inicial de equilíbrio leva de 2 a 3 h para ser concluída e é necessária para garantir a lavagem completa dos conservantes que são usados pelo fabricante para estabilizar a coluna.
   2. Deixe a solução de lavagem recuar abaixo da frita (um disco protector de material branco na parte superior do meio da coluna) e, em seguida, transfira cuidadosamente a solução de vírus purificada recolhida no passo 1.8 para o topo da coluna. Deixe a solução rica em vírus recuar abaixo da frita e, em seguida, comece a encher a coluna com PBS-glicerol.
      NOTA: Uma função da frita é evitar que a coluna fique seca. Como resultado, pequenos atrasos são tolerados antes que mais eluente seja adicionado à coluna.
   3. Coletar o eluato em 12 tubos de microcentrífuga estéreis, 0,5 mL por fração.
10. Determine o rendimento viral.
    1. Determinar as frações de pico do vírus usando espectrofotometria. Preparar uma diluição de 1:100 de cada fracção em PBS e medir o OD₂₆₀ num espectrofotómetro, utilizando uma diluição de 1:100 de tampão isoladamente em branco. As partículas virais devem eluir no volume vazio, começando por volta da fração 6. Agrupe as frações que contêm as leituras OD₂₆₀ mais altas.
    2. Faça uma diluição de 1:100 das frações virais agrupadas e remeça o OD₂₆₀. Calcular a concentração final de partículas virais e o número de IVP nas fracções agrupadas utilizando a seguinte fórmula: Partículas virais por ml = OD₂₆₀ × 100 (isto corrige o factor de diluição) × 10¹². Uma estimativa geral é que 1% das partículas virais são PIV, como tal: PIV/mL = OD 260 × 100 × 10 10 ou IVP/μL = OD₂₆₀ ×^{100 × 10 7}.
11. Aliquot as frações de vírus agrupadas (contendo 5 x 10⁷ a 1 x 10⁸ IVP) em tubos de microcentrífuga estéreis ou criofrascos. Conservar as amostras a -80 °C.

2. Transdução da bexiga de roedores

NOTA: Se for novo nesta técnica, recomenda-se que o número de animais transduzidos de uma só vez seja limitado a 2-4. Isto pode ser conseguido escalonando os horários de início de cada animal, particularmente durante o tratamento com detergente na etapa 2.2 e, em seguida, a incubação do vírus na etapa 2.3. Investigadores experientes podem transduzir até seis animais por vez.

1. Cateterizar a bexiga
   1. Anestesiar camundongos fêmeas C57Bl/6J (tipicamente 8-10 semanas de idade, ~20-25 g) ou ratos fêmeas Sprague Dawley (tipicamente 2-3 meses de idade, ~250 g) usando um vaporizador com um cone nasal acoplado. Calibrar o vaporizador para produzir 3,0% (v/v) de isoflurano, 97% (v/v) O 2 para camundongos ou 4,0% (v/v) de isoflurano, 96% (v/v) de O₂ para ratos. Confirme se os animais estão anestesiados, garantindo que eles não respondam à pinça dos dedos dos pés (normalmente após 1-2 minutos).
   2. Mantenha a temperatura corporal do animal colocando-os em uma almofada aquecida. Monitorar o animal durante todo o protocolo de transdução para garantir que os animais estejam anestesiados e não sintam dor durante este procedimento.
   3. Reduzir o isoflurano para 1,5% (v/v) para camundongos ou 2,0% (v/v) para ratos e manter os animais sob anestesia durante todo o protocolo.
   4. Para evitar a introdução de ar na bexiga, preencha a porção plástica do cateter de um cateter IV (ver Tabela de Materiais) e o cubo associado com PBS estéril usando uma pipeta de transferência.
   5. Com o animal em decúbito dorsal, esfregue o meato externo com álcool a 70% e insira o cateter estéril no meato externo, depois na uretra e, em seguida, na bexiga.
      1. Para realizar essa tarefa, utilize pinças finas para agarrar suavemente o tecido que forma o meato externo e estendê-lo verticalmente, longe do animal. Usando a outra mão, insira cuidadosamente o cateter verticalmente cerca de 3-4 mm no meato uretral (um monte de carne logo acima da abertura da vagina). Então, por causa de uma curvatura na uretra, abaixe o cateter, inserido no meato externo, em direção à cauda do animal, o que facilita sua entrada na porção da uretra que passa abaixo do osso púbico e, finalmente, na bexiga
         . NOTA: Especialmente no caso do rato, o cateter pode ser muito longo, e não mais que 1,0-1,1 cm dele deve ser inserido no animal. Caso contrário, ocorrerão danos à mucosa da bexiga. Para evitar isso, marque o cateter ~1 cm abaixo de sua ponta e, em seguida, não insira o cateter além dessa marcação.
   6. Deixe a urina na bexiga vazar. Remova qualquer resíduo de urina realizando a manobra de Credé: massageie e pressione suavemente a bexiga na área abdominal inferior.
2. Tornar o urotélio receptivo à transdução, tratando-o com uma solução detergente.
   1. Lave a bexiga do rato ou do rato ligando uma seringa estéril de 1 ml preenchida com PBS ao cubo do cateter. Injetar 100 μL de PBS estéril na bexiga do rato (ou 450 μL no caso da bexiga do rato). Retire a seringa do encaixe do cateter e permita o dreno PBS. Se necessário, realize a manobra de Crede para remover o excesso de líquido vesical.
   2. Instilar 100 μL de N-dodecil-β-D-maltosídeo (DDM) a 0,1% (p/v) (dissolvido em PBS e 0,2 μm esterilizado por filtro) na bexiga de camundongo usando uma seringa estéril de 1 mL. Retenha o DDM na bexiga durante 10 minutos, deixando a seringa no lugar. Em ratos, o volume da DDM é aumentado para 450 μL.
   3. Retire o DDM da bexiga desprendendo a seringa e deixando-a escorrer. Realize a manobra de Crede, se necessário.
3. Introduzir o vírus na bexiga.
   1. Anexar uma seringa estéril de 1 mL ao cubo do cateter e instilar 0,5 x 10⁷ a 1 x 10⁸ IVP de adenovírus (preparado na etapa 1), diluído em 100 μL de PBS estéril para camundongos ou 450 μL para ratos, na bexiga. Deixe a seringa presa ao cateter para evitar que a solução de vírus escape.
   2. Após 30 minutos, retire a seringa e deixe a solução do vírus evacuar a bexiga para uma almofada descartável. Limpe qualquer solução de vírus residual com um lenço absorvente, descarte a almofada e limpe os resíduos bioperigosos.
      NOTA: O glicerol é citotóxico. Como tal, o volume máximo de solução viral instilada em camundongos é limitado a 5 μL (que quando diluído em 100 μL de PBS resultaria em uma concentração final de glicerol de ~0,5% [v/v]). Além disso, é possível aumentar a eficiência da transdução aumentando o número de PIV instiladas e estendendo a incubação do vírus para 45 min.
   3. Degrau opcional: A bexiga pode ser lavada com PBS conforme descrito no passo 2.2.1 acima; no entanto, isso não é necessário.
4. Permita que o animal se recupere.
   1. Cessar o fluxo de isoflurano e permitir que o animal se recupere e fique totalmente móvel antes de devolvê-lo à sua gaiola, especialmente se os animais estiverem alojados em grupo.
      NOTA: Como a transdução do vírus por si só não causa sintomas observáveis do trato urinário inferior ou dor, geralmente não há necessidade de tratamento pós-cirúrgico. No entanto, se o transgene codificado for tóxico, analgesia pós-procedimento ou antibióticos podem ser necessários, conforme exigido pela instituição.
5. Analisar os efeitos da expressão transgênica 12-72 h após o tratamento usando métodos como hibridização in situ de RNAm, western blot ou imunofluorescência ^9,10,23 (ver resultados representativos).

Resultados

Preparação do vírus
Um exemplo de purificação do vírus por centrifugação por gradiente de densidade é mostrado na Figura 1A. A faixa rosa claro, encontrada na interface do material celular carregado com a camada de CsCl de 1,25 g/mL, é composta principalmente por células rompidas e seus detritos (ver seta magenta na Figura 1A). Deriva sua cor rosada da pequena quantidade de meio de cultura que é transportada da etapa 1.5 do protoc...

Discussão

Enquanto Ramesh e col. estavam focados no desenvolvimento de estratégias para o uso da transdução adenoviral no tratamento do câncer de bexiga18, relatos mais recentes demonstraram a utilidade dessas técnicas no estudo da biologia/fisiologia e fisiopatologia urotelial normal 10,18,19,20,21 . As características importantes dessa ab...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL pipette	Corning Costar (Millipore Sigma)	CLS4488	sterile, serological pipette, individually wrapped
12 mL ultracentrifuge tube	ThermoFisher	06-752	PET thinwall ultracentrifuge tube
15 mL conical centrifuge tube	Falcon (Corning)	352097	sterile
18 G needle	BD	305196	18 G x 1.5 in needle
20 mL pipette	Corning Costar (Millipore Sigma)	CLS4489	sterile, serological pipette, individually wrapped
50 mL conical centrifuge tube	Falcon (Corning)	352098	sterile
5 mL pipette	Corning Costar (Millipore Sigma)	CLS4487	sterile, serological pipette, individually wrapped
Cavicide	Henry Schein	6400012	Anti-viral solution
Cell culture dish - 15 cm	Falcon (Corning)	353025	sterile, tissue-culture treated  (150 mm x 25 mm dish)
Cell scraper	Sarstedt	893.1832	handle length 24 cm, blade length 1.7 cm
CsCl	Millipore Sigma	C-4306	Molecular Biology grade ≥ 98%
DMEM culture medium (high glucose)	Gibco (ThermoFisher)	11965092	with 4.5 g/L glucose + L-glutamine + phenol red
EDTA	Millipore Sigma	EDS	Bioiultra grade ≥ 99%
Fetal bovine serum	Hyclone (Cytiva)	SH30070.03	defined serum
Glass pipette	Fisher Scientific	13-678-20A	5.75 in glass pipette, autoclaved
Glycerol	Millipore Sigma	G-5516	Molecular Biology grade ≥ 99%
HEK293 cells	ATCC	CRL-3216	HEK293T cells are a variant of HEK293 cells that express the SV40 large T-antigen
Isoflurane	Covetrus	29405
IV catheter - mouse	Smith Medical Jelco	3063	24 G x 3/4 in Safety IV catheter  radiopaque
IV catheter - rat	Smith Medical Jelco	3060	22 G x 1 in Safety IV catheter radiopaque
KCl	Millipore Sigma	P-9541	Molecular Biology grade ≥ 99%
KH2PO4	Millipore Sigma	P5655	Cell culture grade  ≥ 99%
Na2HPO4•7 H2O	Millipore Sigma	431478	≥ 99.99%
NaCl	Millipore Sigma	S3014	Molecular Biology grade ≥ 99%
N-dodecyl-β-D-maltoside	Millipore Sigma	D4641	≥ 98%
Nose cone for multiple animals	custom designed		commercial options include one from Parkland Scientific (RES3200)
PD-10 column	GE Healthcare	17-085-01	Prepacked columns filled ith Sephadex G-25M
Penicillin/streptomycin antibiotic (100x)	Gibco (ThermoFisher)	15070063	100x concentrated solution
Spectrophotometer	Eppendorf	BioPhotometer
Stand and clamp	Fisher Scientific	14-679Q and 05-769-8FQ	available from numerous suppliers
Sterile filter unit	Fisher Scientific (Nalgene)	09-740-65B	0.2 µm rapid-flow filter unit (150 mL)
Sterile filter unit 0.2 µm (syringe)	Fisher Scientific	SLGV004SL	Millipore Sigma Milex 0.22 µm filter unit that attaches to syringe
Super speed centrifuge	Eppendorf	5810R	with Eppendorf F34-6-38 fixed angle rotor (12,000 rpm)
Syringe (1 mL)	BD	309628	1-mL syringe Luer-lok tip - sterile
Syringe (3 mL)	BD	309656	3-mL syringe slip tip - sterile
Table-top centrifuge (low speed)	Eppendorf	5702	with swinging bucket rotor
Transfer pipettes	Fisher Scientific	13-711-9AM	polyethylene 3.4 mL transfer pipette
Tris-base	Millipore Sigma	648310-M	Molecular Biology grade
TrypLE select protease solution	Gibco (ThermoFisher)	12604013	TrypLE express enzyme (1x), no phenol red
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima L-80 XP	with Beckman SW41 rotor (41,000 rpm)
Vaporizer	General Anesthetic Services, Inc.	Tec 3	Isoflurane vaporizer
Vortex Mixer	VWR	10153-838	analog vortex mixer