Espressione di transgeni nell'urotelio vescicale nativo mediante trasduzione mediata da adenovirus

Riepilogo

Vengono descritti metodi per la generazione di grandi quantità di adenovirus ricombinanti, che possono quindi essere utilizzati per trasdurre l'urotelio nativo dei roditori consentendo l'espressione di transgeni o la downregulation di prodotti genici endogeni.

Abstract

Oltre a formare una barriera ad alta resistenza, si ipotizza che l'urotelio che riveste la pelvi renale, gli ureteri, la vescica e l'uretra prossimale percepisca e trasmetta informazioni sul suo ambiente ai tessuti sottostanti, promuovendo la funzione e il comportamento minzionale. La rottura della barriera uroteliale, o della sua funzione sensoriale / trasduttore, può portare a malattie. Lo studio di questi eventi complessi è ostacolato dalla mancanza di strategie semplici per alterare l'espressione genica e proteica nell'urotelio. Qui sono descritti metodi che consentono ai ricercatori di generare grandi quantità di adenovirus ad alto titolo, che può quindi essere utilizzato per trasdurre l'urotelio dei roditori con alta efficienza e in modo relativamente semplice. Sia i cDNA che i piccoli RNA interferenti possono essere espressi utilizzando la trasduzione adenovirale e l'impatto dell'espressione del transgene sulla funzione uroteliale può essere valutato da 12 ore a diversi giorni dopo. Questi metodi hanno un'ampia applicabilità agli studi di biologia uroteliale normale e anormale utilizzando modelli animali murini o ratti.

Introduzione

L'urotelio è l'epitelio specializzato che riveste la pelvi renale, gli ureteri, la vescica e l'uretra prossimale¹. Comprende tre strati: uno strato di cellule ombrello altamente differenziate e polarizzate spesso bi-nucleate, le cui superfici apicali sono immerse nelle urine; uno strato cellulare intermedio con una popolazione di cellule binucleate che amplificano il transito che possono dare origine a cellule ombrello superficiali in risposta alla loro perdita acuta; e un singolo strato di cellule basali, un sottoinsieme delle quali funziona come cellule staminali in grado di rigenerare l'intero urotelio in risposta a lesioni croniche. Le cellule ombrello sono principalmente responsabili della formazione della barriera uroteliale ad alta resistenza, i cui componenti includono una membrana apicale (ricca di colesterolo e cerebrosidi) con bassa permeabilità all'acqua e ai soluti e un complesso giunzionale apicale ad alta resistenza (composto da giunzioni strette, giunzioni aderenti, desmosomi e un anello di actomiosina associato)¹ . Sia la superficie apicale della cellula ombrello che il suo anello giunzionale si espandono durante il riempimento della vescica e ritornano rapidamente al loro stato pre-riempito dopo aver annullato 1,2,3,4,5. Oltre al suo ruolo nella funzione di barriera, si ipotizza che l'urotelio abbia anche funzioni sensoriali e trasduttrici che gli consentono di percepire i cambiamenti nell'ambiente extracellulare (ad esempio, allungare) e trasmettere queste informazioni attraverso il rilascio di mediatori (tra cui ATP, adenosina e acetilcolina) ai tessuti sottostanti, compresi i processi nervosi afferenti suburoteliali 6,7,8 . Recenti prove di questo ruolo si trovano in topi privi di espressione uroteliale sia di Piezo1 che di Piezo2, che si traduce in un'alterata funzione minzionale⁹. Inoltre, i ratti che sovraesprimono la proteina CLDN2 che forma i pori stretti nello strato cellulare dell'ombrello sviluppano infiammazione e dolore analoghi a quelli osservati nei pazienti con cistite interstiziale¹⁰. Si ipotizza che l'interruzione della funzione sensoriale/trasduttore uroteliale o della barriera possa contribuire a diversi disturbi della vescica ^6,11.

Una migliore comprensione della biologia dell'urotelio negli stati normali e patologici dipende dalla disponibilità di strumenti che consentiranno ai ricercatori di sottoregolare prontamente l'espressione genica endogena o consentire l'espressione di transgeni nel tessuto nativo. Mentre un approccio per sottoregolare l'espressione genica è quello di generare topi knockout uroteliali condizionali, questo approccio dipende dalla disponibilità di topi con alleli floxati, è laborioso e può richiedere mesi o anni per completarne¹². Non sorprende quindi che i ricercatori abbiano sviluppato tecniche per trasfettare o trasdurre l'urotelio, che possono portare a risultati su una scala temporale più breve. I metodi pubblicati per la trasfezione includono l'uso di lipidi cationici¹³, oligodeossinucleotidi fosforotioati antisenso¹⁴ o acidi nucleici antisenso legati alla proteina TAT dell'HIV che penetra il peptide 11-mer¹⁵. Tuttavia, il focus di questo protocollo è sull'uso della trasduzione adenovirale-mediata, una metodologia ben studiata che è efficiente nella consegna genica a una vasta gamma di cellule, è stata testata in numerosi studi clinici e più recentemente è stata utilizzata per fornire il cDNA che codifica la proteina del capside COVID-19 ai destinatari di una variante del vaccino COVID-19^{16, 17}. Per una descrizione più approfondita del ciclo di vita dell'adenovirus, dei vettori adenovirali e delle applicazioni cliniche degli adenovirus, il lettore è indirizzato al riferimento¹⁷.

Un'importante pietra miliare nell'uso di adenovirus per trasdurre l'urotelio, è stato un rapporto di Ramesh et al. che ha mostrato brevi pretrattamenti con detergenti, tra cui N-dodecil-β-D-maltoside (DDM) drammaticamente aumentato la trasduzione dell'urotelio da parte di un adenovirus che codifica β-galattosidasi¹⁸. Utilizzando questo studio proof-of-principle come guida, la trasduzione adenovirale-mediata dell'urotelio è stata ora utilizzata per esprimere una varietà di proteine, tra cui GTPasi della famiglia Rab, fattori di scambio guanina-nucleotide, frammenti motori di miosina, claudine associate alla giunzione stretta che formano pori e ADAM17 10,19,20,21,22 . Lo stesso approccio è stato adattato per esprimere piccoli RNA interferenti (siRNA), i cui effetti sono stati salvati da varianti co-esprimenti resistenti ai siRNA del transgene²². Il protocollo qui descritto include metodi generali per generare grandi quantità di adenovirus altamente concentrato, un requisito per queste tecniche, nonché adattamenti dei metodi di Ramesh et ^al.18 per esprimere transgeni nell'urotelio con alta efficienza.

Protocollo

Gli esperimenti che coinvolgono la generazione di adenovirus, che richiede la certificazione BSL2, sono stati eseguiti sotto l'approvazione degli uffici di salute e sicurezza ambientale dell'Università di Pittsburgh e del Comitato istituzionale per la biosicurezza. Tutti gli esperimenti sugli animali eseguiti, compresa la trasduzione adenovirale (che richiede la certificazione ABSL2), sono stati condotti in conformità con le linee guida / regolamenti pertinenti della politica del servizio sanitario pubblico sulla cura umana e l'uso degli animali da laboratorio e della legge sul benessere degli animali e sotto l'approvazione del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Pittsburgh. Guanti, protezione per gli occhi e abbigliamento appropriato sono indossati per tutte le procedure che coinvolgono virus ricombinanti. Tutti i rifiuti liquidi o solidi devono essere smaltiti come descritto di seguito. La lettiera degli animali dopo la trasduzione e le carcasse di animali risultanti devono essere trattate come materiali biopericolosi e smaltite secondo le politiche istituzionali.

1. Preparazione di stock di adenovirus ad alto titolo

NOTA: L'efficace trasduzione delle vesciche dei roditori dipende dall'uso di scorte virali purificate e concentrate, tipicamente da 1 x 10⁷ a 1 x 10⁸ particelle virali infettive (IVP) per μL. Questa parte del protocollo è focalizzata sulla generazione di stock di adenovirus ad alto titolo da preparazioni di virus esistenti. Tutti i passaggi devono essere eseguiti in una cappa di coltura cellulare utilizzando reagenti e strumenti sterili. Mentre i ceppi disponibili di adenovirus utilizzati oggi sono difettosi di replicazione, la maggior parte delle istituzioni richiede l'approvazione per utilizzare adenovirus e DNA ricombinante. Ciò include spesso la designazione di una sala di coltura cellulare come struttura approvata BSL2 per produrre e amplificare adenovirus. Alcune considerazioni generali includono l'uso di maschere, protezione per gli occhi, guanti e abbigliamento appropriato in tutte le fasi della produzione e della purificazione del virus. Quando si esegue la centrifugazione, si raccomandano tappi di sicurezza se i tubi della centrifuga non hanno tappi aderenti. Tutti i materiali non usa e getta, compresi i tappi di sicurezza delle centrifughe potenzialmente contaminati, le bottiglie e i rotori vengono trattati con una soluzione antivirale (vedere la tabella dei materiali) e quindi risciacquati con acqua o etanolo al 70%. I rifiuti liquidi vengono trattati aggiungendo candeggina ad una concentrazione finale del 10% (v/v). Lo smaltimento di questi rifiuti liquidi dipenderà dalle politiche istituzionali. I rifiuti solidi vengono generalmente smaltiti in rifiuti biopericolosi.

1. Coltura cellule HEK293T
   1. Scongelare un flaconcino congelato di cellule HEK293T a bagnomaria a 37 °C e utilizzare una pipetta da 5 ml per trasferire le cellule in un piatto di coltura cellulare di 15 cm di diametro. Utilizzando una pipetta da 25 ml, aggiungere lentamente 20 ml di Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco contenente il 10% (v/v) di siero fetale bovino e l'antibiotico penicillina/streptomicina (DMEM-FBS-PS) al piatto. Incubare le cellule in un incubatore di coltura cellulare a 37 °C gassato con 5% (v/v) di CO₂ fino a raggiungere l'80%-90% di confluenza (~2 x 10⁷ cellule).
   2. Utilizzando una pipetta di vetro collegata a una sorgente di vuoto, aspirare il fluido, quindi risciacquare le celle trasferendo 20 mL di PBS sterile (2,7 mM KCl, 1,5 mM KH 2 PO4, 136,9 mM NaCl e 8,9 mM Na₂HPO₄) al piatto utilizzando una pipetta da 25 ml. Aspirare il PBS esaurito, quindi utilizzare una pipetta da 5 mL per trasferire 3 mL di soluzione calda (37 °C) di proteinasi (vedere Tabella dei materiali) al piatto, incubando il piatto nell'incubatore di coltura cellulare fino a quando le cellule non si staccano (~3-4 min).
      NOTA: La proteolisi efficace può essere valutata al meglio inclinando lentamente il piatto avanti e indietro cercando il rilascio di cellule da tutte le parti del piatto nel fluido in movimento. Le cellule HEK293T sono sensibili al trattamento prolungato con proteinasi e moriranno se lasciate più di pochi minuti in soluzione di proteinasi.
   3. Utilizzare una pipetta da 10 mL per trasferire 7 mL di DMEM-FBS-PS al piatto delle celle staccate, quindi utilizzare la stessa pipetta per aspirare le cellule e il mezzo. Trasferire le cellule sospese in un tubo conico da 50 ml, quindi pellettare le cellule centrifugando la sospensione in una centrifuga clinica a bassa velocità a 200 x g per 5 minuti. Aspirare il surnatante usando una pipetta di vetro collegata a una sorgente di vuoto. Utilizzare una pipetta da 25 mL per risospendere il pellet cellulare in 15 mL di DMEM-FBS-PS.
   4. Aggiungere 1 mL di sospensione cellulare a ciascuno dei quindici piatti da 15 cm contenenti 19 mL di DMEM-FBS-PS.
   5. Far crescere le cellule in un incubatore di coltura tissutale fino a raggiungere l'85% -90% di confluenza (~ 3-4 giorni).
2. Preparare una soluzione virale diluita
   1. Aggiungere ~ 1,5 x 10 9 a 3 x 10⁹ IVP di uno stock virale esistente (5-10 IVP / cellula) a un tubo conico da 50 ml riempito con 45 ml di DMEM privo di FBS o antibiotici.
      NOTA: È possibile utilizzare una concentrazione inferiore del virus (1-5 IVP/cellula); Tuttavia, ci vorrà più tempo per la produzione di virus.
3. Infettare le cellule coltivate con il virus.
   1. Utilizzando una pipetta di vetro collegata ad una sorgente di vuoto, aspirare il mezzo dalle celle quasi confluenti al punto 1.1.5.
   2. Utilizzare una pipetta da 25 mL per trasferire 3,0 mL di soluzione virale diluita (preparata al punto 1.2.1) in ciascuna capsula di coltura cellulare. Quindi, utilizzare una pipetta da 10 ml per aggiungere 7,0 ml di terreno DMEM (privo di FBS o antibiotici) a ciascun piatto. Incubare per 60 minuti in un incubatore di colture cellulari, quindi aggiungere 10 ml di DMEM contenente il 20% (v/v) di FBS e 2x PS a ciascun piatto.
      NOTA: L'utilizzo di uno dei 15 piatti come piastra di controllo (in cui il virus non viene aggiunto) rende più facile identificare l'arrotondamento delle cellule indotto dal virus e la morte nelle cellule infette nella fase successiva.
   3. Incubare le cellule nell'incubatore di coltura cellulare per 2-4 giorni fino a quando la maggior parte di esse inizia ad arrotondare e >60% delle cellule si è staccato.
      NOTA: se si utilizza un titolo inferiore del virus, potrebbe essere necessaria fino a una settimana prima che si verifichi la morte cellulare. Se la morte cellulare non si verifica entro una settimana, è probabile che il processo debba essere ripetuto utilizzando un titolo più alto del virus.
4. Recuperare il virus dai lisati cellulari
   1. Utilizzare un raschietto per raschiare il fondo di ogni piatto, rilasciando le cellule attaccate nel mezzo.
   2. Utilizzando una pipetta da 25 ml, raccogliere e raggruppare il terreno, le cellule e i detriti cellulari da ciascun piatto di coltura cellulare in una provetta conica di coltura cellulare da 50 ml.
      NOTA: Per risparmiare risorse, il mezzo di due piatti può essere combinato in un tubo da 50 ml.
   3. Pellet il materiale cellulare mediante centrifugazione utilizzando una centrifuga da tavolo a bassa velocità: 5 minuti a temperatura ambiente a 3.000 x g. Utilizzare una pipetta di vetro collegata a un dispositivo a vuoto per aspirare il surnatante.
   4. Utilizzare una pipetta da 10 ml, combinata con la triturazione, per consolidare tutto il materiale pellettato risultante in un totale di 7 ml di Tris-HCl 100 mM filtrato sterile pH 7,4 contenente 10 mM EDTA (soluzione Tris-EDTA). Trasferire il materiale aggregato in un tubo conico di coltura cellulare sterile da 15 mL e metterlo su ghiaccio.
      NOTA: A questo punto, la preparazione del virus può essere congelata a -80 °C a tempo indeterminato.
5. Preparare lisati cellulari
   1. Eseguire tre cicli di congelamento-disgelo per interrompere le cellule rimanenti e quindi liberare ulteriormente le particelle virali formate. Congelare il materiale raggruppato nella fase 1.4.4 immergendo il tubo in azoto liquido (~30-60 s). Scongelare rapidamente il campione collocando il tubo in un incubatore a 37 °C. Vortice il campione per 15 s, quindi ripetere la procedura di congelamento e scongelamento rapido di altre 2 volte.
      NOTA: La soluzione virale può essere rapidamente scongelata a 37 °C a bagnomaria, ma è necessaria cautela poiché le oscillazioni di temperatura possono causare la rottura del tubo, rilasciando la soluzione virale nel bagno d'acqua. Per evitare che ciò accada, posizionare il tubo contenente il surnatante virale in un tubo più grande, che viene quindi impostato nel bagno d'acqua.
   2. Utilizzare una pipetta da 10 ml per trasferire il materiale cellulare congelato tre volte in una provetta da centrifuga superspeed. Centrifugare il materiale nel tubo per 30 minuti a 4 °C di centrifuga super-velocità a ~18.500 x g.
   3. Recuperare ~7 mL di surnatante ricco di virus con una pipetta da 10 mL e trasferirlo in un tubo conico da 15 mL. Conservare il campione su ghiaccio fino alla fase successiva.
      NOTA: A questo punto, considerare di mantenere un'aliquota del surnatante virale non purificato come preambolo per iniziare una nuova preparazione del virus (o come backup). Conservare questa aliquota a -80 °C.
6. Isolare e purificare il virus utilizzando la centrifugazione a gradiente di densità.
   1. Preparare un gradiente discontinuo di CsCl in un tubo di ultracentrifuga trasparente a parete sottile da 12 mL di PET (vedere la tabella dei materiali) o equivalente. Utilizzare una siringa da 3 mL dotata di un ago da 18 G per introdurre con cautela 2,5 mL di soluzione di CsCl da 1,4 g/mL sul fondo del tubo, quindi utilizzare una nuova siringa/ago per sovrapporlo con 2,5 mL di soluzione di CsCl da 1,25 g/mL.
      NOTA: la caduta di soluzioni direttamente sopra uno strato preesistente causerà una miscelazione significativa e indesiderata. Posizionare invece la parte smussata dell'ago contro il bordo del tubo, quindi premere molto lentamente lo stantuffo della siringa, sollevando la posizione dell'ago mentre la soluzione riempie il tubo.
   2. Caricare ~ 7 ml di surnatante virale sopra il gradiente in modo simile usando una siringa da 10 ml. Se c'è più di 2-3 mm di spazio tra il surnatante virale e la parte superiore del tubo, aggiungere ulteriore soluzione Tris-EDTA per riempire il tubo fino a quando rimangono solo 2-3 mm di spazio.
   3. Crea un tubo di equilibrio preparato in modo simile, contenente strati di CsCl, ma sostituendo la soluzione Tris-EDTA per il surnatante virale.
      NOTA: I due tubi devono avere pesi identici (e densità simili) per evitare una situazione di carico sbilanciato potenzialmente pericolosa nell'ultracentrifuga.
7. Isolare il virus usando l'ultracentrifugazione zonale.
   1. Caricare le pendenze formate nei passi 1.6.2-1.6.3 nelle benne di un rotore SW41 o equivalente. Avvitare i tappi a secchio, inserire il rotore in un'ultracentrifuga (preraffreddata a 4 °C) e centrifugare per 1 ora a ~150.000 x g.
   2. Durante la centrifugazione, equilibrare la colonna descritta al punto 1.9.1 di seguito.
8. Recupera particelle virali isolate
   1. Alla fine della fase di centrifugazione, staccare con cura i secchi dal rotore e, in una cappa di coltura cellulare, rimuovere i tappi del secchio, quindi rimuovere i tubi e posizionarli in un rack.
   2. Raccogliere il materiale fasciato, ricco di particelle virali, che galleggia all'interfaccia tra la soluzione CsCl da 1,25 g/mL e 1,4 g/mL. Tenendo il tubo contenente il gradiente sopra la metà inferiore di un piatto di coltura cellulare (che catturerà eventuali materiali versati), utilizzare un ago da 1 pollice da 18 G collegato a una siringa da 3 ml per perforare accuratamente il tubo, appena sotto il virus a bande. Aspirare lentamente il virus, che viene tipicamente recuperato in ~ 1 ml.
   3. Rimuovere l'ago dal tubo, in modo che il materiale rimanente nel gradiente fuoriesca dal tubo nella metà inferiore del piatto di coltura cellulare (qualsiasi liquido deve essere trattato come rifiuto pericoloso).
   4. Trasferire la soluzione virale nella siringa in una provetta sterile per microcentrifuga su ghiaccio.
      NOTA: quando si recupera il virus in questo passaggio, posizionare l'ago in modo che il lume dell'ago sia rivolto verso l'alto con l'ago che si apre alcuni mm sotto la banda ricca di virus. Evitare la contaminazione da parte della banda sottile del virus assemblato in modo improprio che a volte si osserva 2-3 mm sopra il virus a bande (vedere la sottile freccia nera nella figura 1A).
9. Rimuovere CsCl dal campione mediante filtrazione su gel.
   1. Equilibrare una colonna PD-10 (preconfezionata con Sephadex G-25M), bloccata a un supporto di supporto, con 50 ml di PBS filtrato sterile da 0,2 μm contenente glicerolo al 10% (v/v).
      NOTA: La fase iniziale di equilibrio richiede 2-3 ore per essere completata ed è necessaria per garantire il completo lavaggio dei conservanti utilizzati dal produttore per stabilizzare la colonna.
   2. Lasciare che la soluzione di lavaggio si ritiri al di sotto della fritta (un disco protettivo di materiale bianco nella parte superiore del mezzo della colonna), quindi trasferire con attenzione la soluzione virale purificata raccolta nel passaggio 1.8 nella parte superiore della colonna. Lasciare che la soluzione ricca di virus si ritiri sotto la fritta, quindi iniziare a riempire la colonna con PBS-glicerolo.
      NOTA: una funzione della fritta è quella di impedire che la colonna si asciughi. Di conseguenza, vengono tollerati brevi ritardi prima che venga aggiunto più eluente alla colonna.
   3. Raccogliere l'eluato in 12 provette sterili per microcentrifuga, 0,5 mL per frazione.
10. Determinare la resa virale.
    1. Determinare le frazioni virali di picco utilizzando la spettrofotometria. Preparare una diluizione 1:100 di ogni frazione in PBS e misurare l'OD₂₆₀ in uno spettrofotometro, usando una diluizione 1:100 del solo buffer come bianco. Le particelle virali dovrebbero eluire nel volume del vuoto, iniziando intorno alla frazione 6. Raggruppare le frazioni contenenti le letture OD₂₆₀ più elevate.
    2. Effettuare una diluizione 1:100 delle frazioni virali aggregate e rimisurare l'OD₂₆₀. Calcolare la concentrazione finale di particelle virali e il numero di IVP nelle frazioni aggregate utilizzando la seguente formula: particelle virali per mL = OD₂₆₀ × 100 (questo corregge il fattore di diluizione) × 10¹². Una stima generale è che l'1% delle particelle virali sono IVP, in quanto tali: IVP / mL = OD 260 × 100 × 10 10 o IVP / μL = OD₂₆₀ × 100 ×^{10 7}.
11. Aliquot le frazioni virali aggregate (contenenti 5 x 10^{da 7} a 1 x 10⁸ IVP) in provette sterili per microcentrifuga o crioviali. Conservare i campioni a -80 °C.

2. Trasduzione della vescica dei roditori

NOTA: Se non si ha familiarità con questa tecnica, si raccomanda di limitare a 2-4 il numero di animali trasdotti contemporaneamente. Ciò può essere ottenuto scaglionando gli orari di inizio per ciascun animale, in particolare durante il trattamento detergente nella fase 2.2, e quindi l'incubazione del virus nella fase 2.3. I ricercatori esperti possono trasdurre fino a sei animali alla volta.

1. Cateterizzare la vescica
   1. Anestetizzare topi femmina C57Bl/6J (tipicamente 8-10 settimane, ~20-25 g) o femmine di ratti Sprague Dawley (tipicamente 2-3 mesi, ~250 g) usando un vaporizzatore con un cono nasale attaccato. Calibrare il vaporizzatore per produrre il 3,0% (v/v) di isoflurano, il 97% (v/v) di O 2 per i topi o il 4,0% (v/v) di isoflurano, il 96% (v/v) di O₂ per i ratti. Confermare che gli animali siano anestetizzati assicurandosi che non rispondano al pizzicamento delle dita dei piedi (in genere dopo 1-2 minuti).
   2. Mantenere la temperatura corporea dell'animale posizionando gli animali su un pad riscaldato. Monitorare l'animale durante tutto il protocollo di trasduzione per assicurarsi che gli animali siano anestetizzati e non provino alcun dolore durante questa procedura.
   3. Ridurre l'isoflurano all'1,5% (v/v) per i topi o al 2,0% (v/v) per i ratti e mantenere gli animali sotto anestesia per tutta la durata del protocollo.
   4. Per evitare l'introduzione di aria nella vescica, riempire la porzione di catetere di plastica di un catetere IV (vedere la tabella dei materiali) e l'hub associato con PBS sterile utilizzando una pipetta di trasferimento.
   5. Con l'animale in posizione supina, tamponare il meato esterno con alcol al 70% e inserire il catetere sterile nel meato esterno, poi nell'uretra e poi nella vescica.
      1. Per eseguire questo compito, utilizzare una pinza fine per afferrare delicatamente il tessuto che forma il meato esterno ed estenderlo verticalmente, lontano dall'animale. Usando l'altra mano, inserire con attenzione il catetere verticalmente di circa 3-4 mm nel meato uretrale (un tumulo di carne appena sopra l'apertura della vagina). Quindi, a causa di una curva nell'uretra, abbassare il catetere, inserito nel meato esterno, verso la coda dell'animale, che facilita il suo ingresso nella porzione dell'uretra che passa sotto l'osso pubico e infine nella vescica.
         . NOTA: Soprattutto nel caso del topo, il catetere potrebbe essere troppo lungo e non più di 1,0-1,1 cm di esso deve essere inserito nell'animale. Altrimenti, ne deriveranno danni alla mucosa della vescica. Per evitare ciò, contrassegnare il catetere ~ 1 cm sotto la sua punta, quindi non inserire il catetere oltre questo segno.
   6. Lasciare che l'urina nella vescica fuoriesca. Rimuovere l'eventuale residuo di urina eseguendo la manovra di Credé: massaggiare e premere delicatamente sulla protuberanza della vescica nella zona addominale inferiore.
2. Rendere l'urotelio ricettivo alla trasduzione trattandolo con una soluzione detergente.
   1. Lavare la vescica del topo o del ratto attaccando una siringa sterile da 1 mL piena di PBS all'hub del catetere. Iniettare 100 μL di PBS sterile nella vescica del topo (o 450 μL nel caso della vescica di ratto). Staccare la siringa dal catetere e lasciare drenare il PBS. Se necessario, eseguire la manovra di Crede per rimuovere il liquido vescicale in eccesso.
   2. Instillare 100 μL di N-dodecil-β-D-maltoside (DDM) allo 0,1% (p/v) (disciolto in PBS e 0,2 μm filtrato-sterilizzato) nella vescica del topo utilizzando una siringa sterile da 1 ml. Trattenere il DDM nella vescica per 10 minuti lasciando la siringa in posizione. Nei ratti, il volume di DDM è aumentato a 450 μL.
   3. Rimuovere il DDM dalla vescica staccando la siringa e lasciandola fuoriuscire. Eseguire la manovra di Crede se necessario.
3. Introdurre il virus nella vescica.
   1. Collegare una siringa sterile da 1 mL all'hub del catetere e instillare nella vescica 0,5 x 10^{da 7} a 1 x 10⁸ IVP di adenovirus (preparato nella fase 1), diluito in 100 μL di PBS sterile per i topi o 450 μL per i ratti. Lasciare la siringa attaccata al catetere per evitare che la soluzione virale fuoriesca.
   2. Dopo 30 minuti, staccare la siringa e lasciare che la soluzione virale evacui la vescica su un tampone monouso. Tamponare qualsiasi soluzione virale residua con una salvietta assorbente, eliminare il tampone e pulire i rifiuti biopericolosi.
      NOTA: Il glicerolo è citotossico. Pertanto, il volume massimo di soluzione virale instillata nei topi è limitato a 5 μL (che se diluito in 100 μL di PBS comporterebbe una concentrazione finale di glicerolo di ~ 0,5% [v / v]). Inoltre, è possibile migliorare l'efficienza della trasduzione aumentando il numero di IVP instillati ed estendendo l'incubazione del virus a 45 minuti.
   3. Passaggio facoltativo: la vescica può essere risciacquata con PBS come descritto al precedente punto 2.2.1; tuttavia, questo non è obbligatorio.
4. Lascia che l'animale si riprenda.
   1. Cessare il flusso di isoflurano e consentire all'animale di riprendersi ed essere completamente mobile prima di riportarlo nella sua gabbia, in particolare se gli animali sono alloggiati in gruppo.
      NOTA: Poiché la trasduzione del virus di per sé non causa sintomi osservabili del tratto urinario inferiore o dolore, di solito non è necessario un trattamento post-chirurgico. Tuttavia, se il transgene codificato è tossico, possono essere necessari analgesici post-procedura o antibiotici come richiesto dall'istituzione.
5. Analizzare gli effetti dell'espressione transgenica 12-72 ore dopo il trattamento utilizzando metodi come l'ibridazione mRNA in situ, western blot o immunofluorescenza ^9,10,23 (vedere i risultati rappresentativi).

Risultati

Preparazione del virus
Un esempio di purificazione del virus mediante centrifugazione a gradiente di densità è mostrato nella Figura 1A. La banda rosa chiaro, che si trova all'interfaccia tra il materiale cellulare caricato e lo strato di CsCl da 1,25 g/ml, è composta principalmente da cellule disgregate e dai loro detriti (vedi freccia magenta in Figura 1A). Deriva il suo colore rosato dalla piccola quantità di terreno di coltura che vie...

Discussione

Mentre Ramesh et al. si sono concentrati sullo sviluppo di strategie per utilizzare la trasduzione adenovirale nel trattamento del cancro della vescica 18, rapporti più recenti hanno dimostrato l'utilità di queste tecniche nello studio della normale biologia uroteliale / fisiologia e fisiopatologia 10,18,19,20,21 . Le caratteristiche ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL pipette	Corning Costar (Millipore Sigma)	CLS4488	sterile, serological pipette, individually wrapped
12 mL ultracentrifuge tube	ThermoFisher	06-752	PET thinwall ultracentrifuge tube
15 mL conical centrifuge tube	Falcon (Corning)	352097	sterile
18 G needle	BD	305196	18 G x 1.5 in needle
20 mL pipette	Corning Costar (Millipore Sigma)	CLS4489	sterile, serological pipette, individually wrapped
50 mL conical centrifuge tube	Falcon (Corning)	352098	sterile
5 mL pipette	Corning Costar (Millipore Sigma)	CLS4487	sterile, serological pipette, individually wrapped
Cavicide	Henry Schein	6400012	Anti-viral solution
Cell culture dish - 15 cm	Falcon (Corning)	353025	sterile, tissue-culture treated  (150 mm x 25 mm dish)
Cell scraper	Sarstedt	893.1832	handle length 24 cm, blade length 1.7 cm
CsCl	Millipore Sigma	C-4306	Molecular Biology grade ≥ 98%
DMEM culture medium (high glucose)	Gibco (ThermoFisher)	11965092	with 4.5 g/L glucose + L-glutamine + phenol red
EDTA	Millipore Sigma	EDS	Bioiultra grade ≥ 99%
Fetal bovine serum	Hyclone (Cytiva)	SH30070.03	defined serum
Glass pipette	Fisher Scientific	13-678-20A	5.75 in glass pipette, autoclaved
Glycerol	Millipore Sigma	G-5516	Molecular Biology grade ≥ 99%
HEK293 cells	ATCC	CRL-3216	HEK293T cells are a variant of HEK293 cells that express the SV40 large T-antigen
Isoflurane	Covetrus	29405
IV catheter - mouse	Smith Medical Jelco	3063	24 G x 3/4 in Safety IV catheter  radiopaque
IV catheter - rat	Smith Medical Jelco	3060	22 G x 1 in Safety IV catheter radiopaque
KCl	Millipore Sigma	P-9541	Molecular Biology grade ≥ 99%
KH2PO4	Millipore Sigma	P5655	Cell culture grade  ≥ 99%
Na2HPO4•7 H2O	Millipore Sigma	431478	≥ 99.99%
NaCl	Millipore Sigma	S3014	Molecular Biology grade ≥ 99%
N-dodecyl-β-D-maltoside	Millipore Sigma	D4641	≥ 98%
Nose cone for multiple animals	custom designed		commercial options include one from Parkland Scientific (RES3200)
PD-10 column	GE Healthcare	17-085-01	Prepacked columns filled ith Sephadex G-25M
Penicillin/streptomycin antibiotic (100x)	Gibco (ThermoFisher)	15070063	100x concentrated solution
Spectrophotometer	Eppendorf	BioPhotometer
Stand and clamp	Fisher Scientific	14-679Q and 05-769-8FQ	available from numerous suppliers
Sterile filter unit	Fisher Scientific (Nalgene)	09-740-65B	0.2 µm rapid-flow filter unit (150 mL)
Sterile filter unit 0.2 µm (syringe)	Fisher Scientific	SLGV004SL	Millipore Sigma Milex 0.22 µm filter unit that attaches to syringe
Super speed centrifuge	Eppendorf	5810R	with Eppendorf F34-6-38 fixed angle rotor (12,000 rpm)
Syringe (1 mL)	BD	309628	1-mL syringe Luer-lok tip - sterile
Syringe (3 mL)	BD	309656	3-mL syringe slip tip - sterile
Table-top centrifuge (low speed)	Eppendorf	5702	with swinging bucket rotor
Transfer pipettes	Fisher Scientific	13-711-9AM	polyethylene 3.4 mL transfer pipette
Tris-base	Millipore Sigma	648310-M	Molecular Biology grade
TrypLE select protease solution	Gibco (ThermoFisher)	12604013	TrypLE express enzyme (1x), no phenol red
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima L-80 XP	with Beckman SW41 rotor (41,000 rpm)
Vaporizer	General Anesthetic Services, Inc.	Tec 3	Isoflurane vaporizer
Vortex Mixer	VWR	10153-838	analog vortex mixer