Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يعد النموذج الحيواني لقصور جارات الدرق المكتسب (HypoPT) أمرا بالغ الأهمية لفهم كيفية تأثير HypoPT على توازن الأيونات المعدنية والتحقق من فعالية العلاجات الجديدة. هنا ، يتم تقديم تقنية لتوليد نموذج الفئران المكتسب لقصور جارات الدرق (AHypoPT) عن طريق استئصال الغدة الدرقية (PTX) باستخدام جسيمات الكربون النانوية.

Abstract

قصور جارات الدرق (HypoPT) هو مرض نادر يصيب الغدد الجار درقية ويتميز بانخفاض إفراز أو فعالية هرمون الغدة الدرقية (PTH) ، مما يؤدي إلى ارتفاع مستويات الفوسفور في الدم وانخفاض مستويات الكالسيوم في الدم. ينتج HypoPT بشكل شائع عن التلف العرضي للغدد أو إزالتها أثناء جراحة الغدة الدرقية أو غيرها من جراحة الرقبة الأمامية. أصبحت جراحة الغدة الدرقية / الغدة الدرقية أكثر شيوعا في السنوات الأخيرة ، مع ارتفاع مماثل في حدوث HypoPT كمضاعفات ما بعد الجراحة. هناك حاجة ماسة لنموذج حيواني HypoPT لفهم الآليات الكامنة وراء تأثيرات HypoPT على توازن الأيونات المعدنية بشكل أفضل والتحقق من الفعالية العلاجية للعلاجات الجديدة. هنا ، تم الإبلاغ عن تقنية لإنشاء HypoPT المكتسبة في ذكور الفئران عن طريق إجراء استئصال الغدة الدرقية (PTX) باستخدام جزيئات الكربون النانوية. يظهر نموذج الفئران وعدا كبيرا على نماذج الفئران من قصور الدريقات. الأهم من ذلك ، أن منطقة ربط مستقبلات PTH البشرية لديها تشابه تسلسلي بنسبة 84.2٪ مع الفئران ، وهو أعلى من التشابه بنسبة 73.7٪ المشتركة مع الفئران. علاوة على ذلك ، لم يتم التحقيق بشكل كامل في آثار هرمون الاستروجين ، والتي يمكن أن تؤثر على مسار إشارات مستقبلات PTH / PTHrP ، في ذكور الفئران. جسيمات الكربون النانوية هي مقتفيات لمفاوية تلطخ الغدد الليمفاوية الدرقية باللون الأسود دون التأثير على وظيفتها ، لكنها لا تلطخ الغدد الجار درقية ، مما يجعل من السهل التعرف عليها وإزالتها. في هذه الدراسة ، كانت مستويات PTH في الدم غير قابلة للكشف بعد PTX ، مما أدى إلى نقص كبير في كلس الدم وفرط فوسفات الدم. وبالتالي ، يمكن تمثيل الحالة السريرية ل HypoPT بعد العملية الجراحية بشكل ملحوظ في نموذج الفئران. وبالتالي ، يمكن أن يكون PTX بمساعدة جسيمات الكربون النانوية بمثابة نموذج فعال للغاية وقابل للتنفيذ بسهولة لدراسة التسبب في HypoPT وعلاجه وتشخيصه.

Introduction

تفرز الغدد الجار درقية هرمون الغدة الجار درقية (PTH). وهو معدل رئيسي لتوازن الكالسيوم ، ويحافظ على استقلاب الفوسفات ، ويشارك في دوران العظام 1,2. يظهر قصور جارات الدرق (HypoPT) على أنه انخفاض إفراز أو فقدان وظيفي ل PTH. إنه اضطراب نادر في الغدد الصماء ، حيث يبلغ معدل انتشاره حوالي 9-37 لكل 100,000 شخص في السنة 3,4,5. يتميز HypoPT بانخفاض مستويات PTH والكالسيوم في الدم مصحوبا بزيادة الفوسفور في الدم 6,7. يصنف HypoPT بناء على سببه: قصور جارات الدرق المكتسب (AHypoPT) أو قصور جارات الدرق مجهول السبب (IHypoPT)8. أتصادف HypoPT بشكل أكثر شيوعا في الممارسة السريرية. حوالي 75٪ من حالات AHypoPT ناتجة عن استئصال أو إصابة عرضية للغدد الجار درقية أثناء جراحة الغدة الدرقية أو غيرها من جراحات الرأس والرقبة. تشمل الأسباب الأخرى العلاج الإشعاعي والعلاج الكيميائي لأورام الرأس والرقبة وسمية الدواء 1,8. أدت طرق التشخيص المحسنة وزيادة فحص الأمراض المرتبطة بالغدة الدرقية إلى زيادة عدد العمليات الجراحية للغدة الدرقية. وقد أدى ذلك إلى زيادة مقابلة في مضاعفات الغدة الدرقية ذات الصلة 9,10.

هناك حاجة إلى نماذج حيوانية سهلة التأسيس ذات خصائص مستقرة للتحقيق بشكل أفضل في AHypoPT والتحقق من الفعالية العلاجية للعلاجات الجديدة. تم الإبلاغ عن استئصال الغدة الدرقية (PTX) الذي تم إجراؤه على الجرذان والفئران في الدراسات السابقة6،11 ؛ ومع ذلك ، نظرا للحجم الصغير للغاية للغدد الدرقية والتباين في توزيعها التشريحي ، فإن معدل النجاح منخفض نسبيا في الممارسة العملية. وهكذا ، عادة ما يتم إجراء استئصال الغدة الدرقية (TPTX) (أي الإزالة الكاملة للغدد الدرقية والغدة الدرقية) لضمان استئصال الغدد الجار درقية12. ومع ذلك ، فإن مستويات هرمون الغدة الدرقية المنخفضة الناتجة قد تعقد الدراسات مع هذا النموذج الحيواني13. لا يمكن لنماذج HypoPT التي تم إنشاؤها بواسطة طرق أخرى ، مثل تحفيز الأدوية وتحرير الجينات ، أن تمثل بشكل صحيح التسبب في AHypoPT الأكثر شيوعا. استخدمت مجموعتنا سابقا نماذج الفئران بالضربة القاضية لتسمية الغدد الجار درقية والسماح بإزالة الغدد الجار درقية دون الإضرار بالغدد الدرقية والهياكل التشريحية المحيطةبها 14,15. ومع ذلك ، تستخدم هذه الطريقة نماذج الفئران المعدلة وراثيا ، والتي تتطلب وقتا أطول للتطوير بسبب متطلبات التزاوج والتكاثر.

لذلك ، كنا نهدف إلى إنشاء نموذج سهل الإنشاء ل AHypoPT. تصف هذه الدراسة نموذج الفئران ل PTX باستخدام وسم الجسيمات النانوية الكربونية. معلق الجسيمات النانوية الكربونية من 50 ملغ / مل ، والذي يشيع استخدامه في جراحة الغدة الدرقية ، يوزع بالتساوي في الغدد الدرقية بعد الحقن الموضعي16. تتحول الغدد الدرقية إلى اللون الأسود ، لكن الغدد الجار درقية تترك غير ملوثة17 ، وبالتالي تميز بوضوح الغدد الجار درقية عن الغدد الدرقية وتسمح بإجراء PTX دون التأثير على الغدد الدرقية. هذه الطريقة مناسبة للفئران من مختلف الأعمار. حقن معلق الجسيمات النانوية الكربونية آمن وله تأثير ضئيل على وظيفة الغدة الدرقية18. أظهر نموذج الفئران PTX المسمى بالجسيمات النانوية الكربونية الذي تم إنشاؤه في هذه الدراسة نقصا كبيرا في كلس الدم والأنماط الظاهرية لفرط فوسفات الدم خلال فترة المراقبة التي استمرت 4 أسابيع. وبالتالي ، فإن نموذج AHypoPT هذا سهل الإنشاء وله نمط ظاهري قابل للتكرار.

Protocol

تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان في مختبر الدولة الرئيسي لأمراض الفم ، جامعة سيتشوان. تم الحصول على إذن من الوكالات المحلية ذات الصلة قبل التجربة. تم استخدام ثمانية ذكور من الفئران Sprague-Dawley (SD) البالغة من العمر 8-10 أسابيع ، بمتوسط وزن 200-250 جم ، في هذه الدراسة. تم الحصول على الحيوانات من مصدر تجاري (انظر جدول المواد). تم توفير الطعام والماء حسب الطلب طوال الفترة التجريبية.

1. التحضير قبل الجراحة لتوليد فئران PTX بمساعدة جسيمات الكربون النانوية

  1. تخدير الفئران البالغة من العمر 8-10 أسابيع باستخدام استنشاق إيزوفلوران 2.0٪ -2.5٪ ، يليه حقن ثلاثي البرومو إيثانول داخل الصفاق (i.p) عند 10 مل / كجم من وزن الجسم. ضمان عمق كاف للتخدير عن طريق اختبار عدم وجود منعكس ضوء الحدقة الحدقة . استخدم مرهم الطبيب البيطري على العينين لمنع الجفاف أثناء التخدير.
    ملاحظة: يتم التعرف على الفئران التي يبلغ عمرها 8-10 أسابيع على أنها فئران بالغة. ومع ذلك ، يمكن استخدام طريقة النمذجة هذه على الفئران التي لا يتجاوز عمرها 7 أيام.
  2. تحضير الفئران SD مخدر لعملية جراحية عن طريق حلق الفراء من منطقة الرقبة البطنية في موقف ضعيف. تطهير منطقة المنطوق باستخدام كرات القطن البوفيدون اليود (انظر جدول المواد).
  3. قم بتغطية الحيوان بالستائر الجراحية (انظر جدول المواد) ، وكشف المنطقة الجراحية ، بهدف تقليل التلوث الميكروبي.

2. استئصال الغدة الدرقية (PTX)

  1. ابدأ من نقطة المنتصف بين الأذنين ، واقطع شقا طوله 2 سم طوليا باتجاه الذيل باستخدام مشرط جراحي. تشريح طبقة اللفافة والدهون على التوالي باستخدام ملقط حاد ومنحني ومسننة.
  2. افصل عضلات القصبة الهوائية ، وفضح القصبة الهوائية باستخدام ملقط غير حاد نسبيا تحت مجهر ستيريو بتكبير 4x-5x.
  3. حدد موقع الفصين الأيسر والأيمن من الغدد الدرقية على شكل فراشة بجانب القصبة الهوائية.
  4. حقن 1 ميكرولتر من معلق الجسيمات النانوية الكربونية (انظر جدول المواد) تحت غشاء الغدد الدرقية باستخدام حقنة 10 ميكرولتر بإبرة مشطوفة 30 جرام. بعد 5 دقائق ، قم بري منطقة المنطوق بمحلول ملحي لتنظيف معلق الجسيمات النانوية الكربونية الإضافية التي تغطي غشاء الغدة الدرقية.
    ملاحظة: نقطة الحقن الموصى بها هي الجزء المتوسط من فص الغدة الدرقية ، والذي يحتوي على عدد أقل من الأوعية الدموية. يشيع استخدام معلق الجسيمات النانوية الكربونية في جراحة الغدة الدرقية نظرا لقدرته على اكتشاف الغدد الليمفاوية. تلطيخ الغدد الدرقية وترك الغدد الجار درقية غير ملوثة يسهل التعرف على الأخيرة.
  5. تحقق للتأكد من أن الغدد الدرقية تتحول إلى اللون الأسود بينما تبقى الغدد الجار درقية غير ملوثة في ~ 5 دقائق. راقب الغدد الجار درقية المميزة تحت الضوء العادي باستخدام ضوء مجهر ستيريو أو مصباح طاولة.
    ملاحظة: عادة ما يكون للقوارض غدتان جارات درقية على شكل قطرة تقع على السطحين الأيسر والأيمن للغدد الدرقية. في بعض الأحيان، قد توجد غدد جارات درقية إضافية بعيدا.
  6. قطع بدقة الغدد الدرقية غير ملوثة مع ملقط ومقص الجراحة المجهرية. استخدم كرات قطنية معقمة للإرقاء أو إسفنجة جيلاتينية إذا كان هناك المزيد من النزيف.
  7. أغلق العضلات وطبقات الدهون والجلد ، طبقة تلو الأخرى ، بخياطة مرتبة أفقية متقطعة باستخدام خيوط 6-0 polyglactin 910 (انظر جدول المواد).
  8. بالنسبة للمجموعة الوهمية ، قم بتنفيذ جميع خطوات التحضير قبل الجراحة و PTX باستثناء الخطوة 2.6. تخدير الفئران ، وفصل الأنسجة فوق القصبة الهوائية. حدد موقع الغدد الجار درقية ولكن لا تقم بإزالتها. إجراء الانتعاش والمراقبة بعد العملية الجراحية جنبا إلى جنب مع الفئران من مجموعة PTX.

3. الانتعاش بعد العملية الجراحية والمراقبة

  1. بعد الجراحة ، ضع الفئران على بطانية كهربائية ثرموستاتية (37 درجة مئوية) للحفاظ على درجة حرارة الجسم. حقن البوبرينورفين هيدروكلوريد 0.01 ملغ/كغ تحت الجلد (s.c) كل 12 ساعة كتسكين بعد الجراحة. نقل الفئران إلى قفص معقم عندما تبدأ في التحرك ومحاولة الزحف.
  2. مراقبة عن كثب الفئران بعد العملية الجراحية لمدة 2 ساعة. أعد الفئران إلى غرفة التربية ، وراقبها بشكل روتيني ، وسجل حالتها.
  3. سحب 10 ميكرولتر من الدم من الوريد الذيل بعد 7 أيام من الجراحة. قم بقياس مصل Ca2+ و Serum Pi و PTH في المصل باستخدام مجموعات تجارية مناسبة (انظر جدول المواد). ينتج عن استئصال الغدة الدرقية الناجح انخفاض مصل Ca2+ المستوى 2 SD أقل من الفئران التي تعمل وهمية (9.00 مليمول / لتر ، ن = 16).
    ملاحظة: تم استخدام برنامج للإحصاء والرسوم البيانية (انظر جدول المواد) للتحليل الإحصائي. تم استخدام اختبار t للطالب لمقارنة معلمات المصل والبول بين المجموعتين الوهمية و PTX. P < 0.05 اعتبرت ذات دلالة إحصائية. تم قياس المصل والبول Ca2+ و Pi واليوريا في الدم والكرياتينين باستخدام مجموعات تجارية وفقا لتعليمات الشركات المصنعة (انظر جدول المواد). تم قياس مصل C-telopeptide من الكولاجين من النوع الأول وأوستيوكالسين باستخدام مجموعات ELISA المتاحة تجاريا (انظر جدول المواد).

النتائج

لوحظت مواقع وعدد الغدد الجار درقية في البداية في الفئران تحت مجهر التشريح. قبل حقن الجسيمات النانوية الكربونية ، كانت الغدد الدرقية ذات لون أحمر شفاف ، وكانت الغدد جارات الدرقية بالكاد يمكن تمييزها تحت المجهر (الشكل 1 أ). بعد حقن الجسيمات النانوية ، كانت الغدد الدرقية ملطخة...

Discussion

تشير التقارير الوبائية إلى أن الكشف عن أمراض الغدة الدرقية قد زاد بشكل كبير ، وزاد عدد العمليات الجراحية ذات الصلة التي أجريت وفقا لذلك 19,20. يبلغ معدل الإصابة بقصور جارات الدرق بعد الجراحة حوالي 7.6٪ 8,21 ، في حين أن زيادة المراض?...

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس لهما مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من خلال منحة NSFC 81800928 ، وتمويل الأبحاث من مدرسة / مستشفى غرب الصين لطب الأسنان بجامعة سيتشوان (رقم RCDWJS2021-1) ، ومنحة التمويل المفتوح لمختبر الدولة الرئيسي لأمراض الفم SKLOD-R013.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.9% Sodium Chloride SolutionKelun Co. Sichuan, China
10 µL 30G NanoFil SyringeWPI
6-0 polyglactin 910 suture with needleEthicon, IncJ510G
Calcium LiquiColor testEKF0155-225For Ca2+ analysis
Carbon Nanoparticles Suspension InjectionLummy, Chongqing, ChinaH200732461 mL : 50 mg
Creatinine (Cr) Assay kit ( sarcosine oxidase )Jiancheng, Nanjing, ChinaC011-2-1For creatinine analysis
Disposable ScalpelShinva, China
Dumstar Biology forcepsShinva, China
Micro Dissecting Spring ScissorsShinva, China
MicroVue Rat intact PTH ELISAImmunotopics30-2531For the measurement of PTH in rat serum
Needle HolderShinva, China
Phosphorus Liqui-UV testEKF0830-125For Pi analysis
Ply gauzeWeian Co. Henan, China
Povidone-IodineYongan pharmaceutical Co.Ltd. Chengdu, China
Prism 9.0 (statistics and graphing software)GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USAhttps://www.graphpad.com/scientific-software/prism/
Rat C-telopeptide of type I collagen (CTX-I) ELISA KitCUSABIO, Wuhan, ChinaCSB-E12776rFor CTX-I analysis
Rat Osteocalcin/Bone Gla Protein (OT/BGP) ELISA KitCUSABIO, Wuhan, ChinaCSB-E05129rFor osteocalcin analysis
Safety Single Edge Razor BladesAmerican Safety Razor Company66-0089
Sprague-Dawley Rats8 to 10 weeks old
Surgical Incise DrapesLiangyou Co. Sichuan, China
Urea Assay KitJiancheng, Nanjing, ChinaC013-2-1For urea analysis

References

  1. Bilezikian, J. P., et al. Hypoparathyroidism in the adult: Epidemiology, diagnosis, pathophysiology, target-organ involvement, treatment, and challenges for future research. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (10), 2317-2337 (2011).
  2. Bilezikian, J. P. Hypoparathyroidism. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 105 (6), 1722-1736 (2020).
  3. Underbjerg, L., Sikjaer, T., Mosekilde, L., Rejnmark, L. Postsurgical hypoparathyroidism-Risk of fractures, psychiatric diseases, cancer, cataract, and infections. Journal of Bone and Mineral Research. 29 (11), 2504-2510 (2014).
  4. Underbjerg, L., Sikjaer, T., Mosekilde, L., Rejnmark, L. The epidemiology of nonsurgical hypoparathyroidism in Denmark: A nationwide case finding study. Journal of Bone and Mineral Research. 30 (9), 1738-1744 (2015).
  5. Astor, M. C., et al. Epidemiology and health-related quality of life in hypoparathyroidism in Norway. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 101 (8), 3045-3053 (2016).
  6. Rodriguez-Ortiz, M. E., et al. Calcium deficiency reduces circulating levels of FGF23. Journal of the American Society of Nephrology. 23 (7), 1190-1197 (2012).
  7. Davies, B. M., Gordon, A. H., Mussett, M. V. A plasma calcium assay for parathyroid hormone, using parathyroidectomized rats. The Journal of Physiology. 125 (2), 383-395 (1954).
  8. Clarke, B. L., et al. Epidemiology and diagnosis of hypoparathyroidism. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 101 (6), 2284-2299 (2016).
  9. Liu, Y., Shan, Z. Expert consensus on diagnosis and treatment for elderly with thyroid diseases in China. Aging Medicine. 4 (2), 70-92 (2021).
  10. Sulejmanovic, M., Cickusic, A. J., Salkic, S., Bousbija, F. M. Annual incidence of thyroid disease in patients who first time visit department for thyroid diseases in Tuzla Canton. Materia Socio-Medica. 31 (2), 130-134 (2019).
  11. Liao, H. W., et al. Relationship between fibroblast growth factor 23 and biochemical and bone histomorphometric alterations in a chronic kidney disease rat model undergoing parathyroidectomy. PloS One. 10 (7), 0133278 (2015).
  12. Russell, P. S., Gittes, R. F. Parathyroid transplants in rats: A comparison of their survival time with that of skin grafts. The Journal of Experimental Medicine. 109 (6), 571-588 (1959).
  13. Sakai, A., et al. Osteoclast development in immobilized bone is suppressed by parathyroidectomy in mice. Journal of Bone and Mineral Metabolism. 23 (1), 8-14 (2005).
  14. Bi, R., Fan, Y., Luo, E., Yuan, Q., Mannstadt, M. Two techniques to create hypoparathyroid mice: parathyroidectomy using GFP glands and diphtheria-toxin-mediated parathyroid ablation. Journal of Visualized Experiments. (121), e55010 (2017).
  15. Bi, R., et al. Diphtheria toxin- and GFP-based mouse models of acquired hypoparathyroidism and treatment with a long-acting parathyroid hormone analog. Journal of Bone and Mineral Research. 31 (5), 975-984 (2016).
  16. Huang, Y., et al. Carbon nanoparticles suspension injection for photothermal therapy of xenografted human thyroid carcinoma in vivo. MedComm. 1 (2), 202-210 (2020).
  17. Zhang, R. J., Chen, Y. L., Deng, X., Yang, H. Carbon nanoparticles for thyroidectomy and central lymph node dissection for thyroid cancer. The American Surgeon. , (2022).
  18. Long, M., et al. A carbon nanoparticle lymphatic tracer protected parathyroid glands during radical thyroidectomy for papillary thyroid non-microcarcinoma. Surgical Innovation. 24 (1), 29-34 (2017).
  19. Li, Y., et al. Efficacy and safety of long-term universal salt iodization on thyroid disorders: Epidemiological evidence from 31 provinces of mainland China. Thyroid. 30 (4), 568-579 (2020).
  20. Powers, J., Joy, K., Ruscio, A., Lagast, H. Prevalence and incidence of hypoparathyroidism in the United States using a large claims database. Journal of Bone and Mineral Research. 28 (12), 2570-2576 (2013).
  21. Zihao, N., et al. Promotion of allogeneic parathyroid cell transplantation in rats with hypoparathyroidism. Gland Surgery. 10 (12), 3403-3414 (2021).
  22. Goncu, B., et al. Xenotransplantation of microencapsulated parathyroid cells as a potential treatment for autoimmune-related hypoparathyroidism. Experimental and Clinical Transplantation. , (2021).
  23. Jung, S. Y., et al. Standardization of a physiologic hypoparathyroidism animal model. PLoS One. 11 (10), 0163911 (2016).
  24. Chen, W., Lv, Y., Xie, R., Xu, D., Yu, J. Application of lymphatic mapping to recognize and protect parathyroid in thyroid carcinoma surgery by using carbon nanoparticles. Journal of Clinical Otorhinolaryngology, Head, and Neck Surgery. 28 (24), 1918-1920 (1924).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

197

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved