יצירת חולדות היפופאראתירואידיום באמצעות כריתת בלוטת התריס בסיוע פחמן ננו-חלקיקים

Summary

מודל בבעלי חיים של היפופאראתירואידיזם נרכש (HypoPT) חיוני להבנת האופן שבו HypoPT משפיע על הומאוסטזיס של יונים מינרליים ולאימות היעילות של טיפולים חדשניים. כאן, מוצגת טכניקה ליצירת מודל חולדה היפופאראתירואידיזם נרכש (AHypoPT) על ידי כריתת בלוטת התריס (PTX) באמצעות ננו-חלקיקי פחמן.

Abstract

היפופאראתירואידיזם (HypoPT) היא מחלה נדירה המערבת את בלוטות יותרת התריס המאופיינת בהפרשה או עוצמה מופחתת של הורמון יותרת התריס (PTH), מה שמוביל לרמות זרחן גבוהות בסרום ולרמות סידן נמוכות בסרום. היפופט נובע לרוב מנזק מקרי לבלוטות או הסרתן במהלך בלוטת התריס או ניתוח צוואר קדמי אחר. ניתוחי בלוטת התריס הפכו נפוצים יותר בשנים האחרונות, עם עלייה מקבילה בהופעת היפופט כסיבוך לאחר הניתוח. יש צורך קריטי במודל בעלי חיים של HypoPT כדי להבין טוב יותר את המנגנונים העומדים בבסיס ההשפעות של HypoPT על הומאוסטזיס יונים מינרליים ולאמת את היעילות הטיפולית של טיפולים חדשניים. כאן, דווח על טכניקה ליצירת HypoPT נרכש בחולדות זכרים על ידי ביצוע כריתת בלוטת התריס (PTX) באמצעות ננו-חלקיקי פחמן. מודל החולדות מראה הבטחה גדולה על פני מודלים עכבריים של היפופאראתירואידיזם. חשוב לציין שלאזור הקישור של קולטן PTH האנושי יש דמיון של 84.2% ברצף עם זה של החולדה, שהוא גבוה יותר מהדמיון של 73.7% המשותף לעכברים. יתר על כן, ההשפעות של אסטרוגן, אשר יכול להשפיע על מסלול איתות קולטן PTH/PTHrP, לא נחקרו במלואן בחולדות זכרים. ננו-חלקיקי פחמן הם נותבי לימפה המכתימים את בלוטות הלימפה של בלוטת התריס בשחור מבלי להשפיע על תפקודן, אך הם אינם מכתימים את בלוטות יותרת התריס, מה שמקל על זיהויים והסרתם. במחקר זה, רמות PTH בסרום היו בלתי ניתנות לגילוי לאחר PTX, וזה הביא היפוקלצמיה משמעותית היפרפוספטמיה. לפיכך, המצב הקליני של HypoPT לאחר הניתוח יכול להיות מיוצג להפליא במודל חולדה. PTX בסיוע פחמן ננו-חלקיקים יכול, אם כן, לשמש כמודל יעיל במיוחד וקל ליישום לחקר הפתוגנזה, הטיפול והפרוגנוזה של HypoPT.

Introduction

הורמון יותרת התריס (PTH) מופרש על ידי בלוטות יותרת התריס. זהו אפנן עיקרי של מאזן הסידן, שומר על מטבוליזם פוספט, ומשתתף בתחלופת עצם ^1,2. היפופאראתירואידיזם (HypoPT) מתבטא בירידה בהפרשה או אובדן תפקודי של PTH. זוהי הפרעה אנדוקרינית נדירה, עם שכיחות של כ 9-37 לכל 100,000 שנות אדם ^3,4,5. HypoPT מאופיין בירידה ברמות PTH בסרום ובסידן המלווה בעלייה בזרחן בסרום ^6,7. HypoPT מסווג על פי הגורם לו: היפופאראתירואידיזם נרכש (AHypoPT) או היפופאראתירואידיזם אידיופתי (IHypoPT)⁸. AHypoPT נפוץ יותר בפרקטיקה הקלינית; כ-75% ממקרי AHypoPT נגרמים כתוצאה מכריתה או פציעה בשוגג של בלוטות יותרת התריס במהלך ניתוחי בלוטת התריס או ניתוחי ראש וצוואר אחרים. סיבות אחרות כוללות הקרנות וכימותרפיה לגידולי ראש וצוואר ורעילות תרופות ^1,8. שיטות אבחון משודרגות ועלייה בבדיקות סקר למחלות הקשורות לבלוטת התריס הגדילו את מספר הפעולות הכירורגיות של בלוטת התריס. זה הוביל לעלייה מקבילה בסיבוכים הקשורים בלוטת יותרת התריס ^9,10.

יש צורך במודלים בעלי חיים מבוססים בקלות עם מאפיינים יציבים כדי לחקור טוב יותר את AHypoPT ולאמת את היעילות הטיפולית של טיפולים חדשניים. כריתת בלוטת התריס (PTX) המבוצעת על חולדות ועכברים דווחה במחקרים קודמים ^6,11; עם זאת, בשל גודלן הקטן מאוד של בלוטות יותרת התריס והשונות בפיזורן האנטומי, אחוזי ההצלחה נמוכים יחסית בפועל. לכן, thyro-parathyroidectomy (TPTX) (כלומר, הסרה מוחלטת של בלוטת התריס ואת בלוטות יותרת התריס) מבוצעת בדרך כלל כדי להבטיח את כריתה של בלוטות יותרת התריס¹². עם זאת, רמות התירוקסין הנמוכות כתוצאה מכך עלולות לסבך מחקרים עם מודל בעלי חיים זה¹³. מודלים של HypoPT שהוקמו בשיטות אחרות, כגון גירוי תרופות ועריכת גנים, אינם יכולים לייצג כראוי את הפתוגנזה הנפוצה ביותר של AHypoPT. הקבוצה שלנו השתמשה בעבר במודלים של עכברי נוקאאוט כדי לתייג את בלוטות יותרת התריס ולאפשר הסרה של בלוטות יותרת התריס מבלי לפגוע בבלוטות התריס ובמבנים האנטומיים שמסביב^14,15. עם זאת, שיטה זו משתמשת במודלים של עכברים טרנסגניים, הדורשים זמן התפתחות ארוך יותר בשל דרישות ההזדווגות והרבייה.

לכן, שאפנו להקים מודל שנוצר בקלות של AHypoPT. מחקר זה מתאר מודל חולדות עבור PTX באמצעות תיוג ננו-חלקיקי פחמן. תרחיף ננו-חלקיקי פחמן של 50 מ"ג/מ"ל, המשמש בדרך כלל בניתוחי בלוטת התריס, מתחלק באופן שווה בבלוטות התריס לאחר הזרקה מקומית¹⁶. בלוטות התריס הופכות שחורות, אך בלוטות יותרת התריס נותרות ללא כתמים¹⁷, ובכך מבדילות בבירור את בלוטות יותרת התריס מבלוטות התריס ומאפשרות לבצע את PTX מבלי להשפיע על בלוטות התריס. שיטה זו מתאימה לחולדות בגילאים שונים. הזרקת תרחיף ננו-חלקיקי הפחמן בטוחה ויש לה השפעה זניחה על תפקוד בלוטת התריס¹⁸. מודל החולדות PTX עם תווית ננו-חלקיקי פחמן שנוצר במחקר זה הראה פנוטיפים משמעותיים של היפוקלצמיה והיפרפוספטמיה במהלך תקופת התצפית בת 4 השבועות. לפיכך, מודל AHypoPT זה קל להקים ויש לו פנוטיפ לשחזור.

Protocol

מחקר זה אושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדת המפתח הממלכתית למחלות אוראליות, אוניברסיטת סצ'ואן. התקבל אישור מסוכנויות מקומיות רלוונטיות לפני הניסוי. במחקר הנוכחי נעשה שימוש בשמונה חולדות Sprague-Dawley (SD) זכרים בני 8-10 שבועות, במשקל ממוצע של 200-250 גרם. בעלי החיים התקבלו ממקור מסחרי (ראו טבלת חומרים). מזון ומים סופקו עד לליביטום , לאורך כל תקופת הניסוי.

1. הכנה טרום ניתוחית ליצירת חולדות PTX בסיוע פחמן ננו-חלקיקי

1. הרדימו חולדות בנות 8-10 שבועות באמצעות שאיפת איזופלורן של 2.0%-2.5%, ולאחר מכן הזרקה תוך-צפקית (כלומר של טריברומואתנול) במשקל גוף של 10 מ"ל/ק"ג. להבטיח עומק מספיק של הרדמה על ידי בדיקת היעדר רפלקס האור אישונים. יש להשתמש במשחה וטרינרית על העיניים כדי למנוע יובש בזמן הרדמה.
   הערה: חולדות בנות 8-10 שבועות מוכרות כחולדות בוגרות. עם זאת, שיטת דוגמנות זו יכולה לשמש על חולדות צעירות כמו 7 ימים.
2. הכינו את חולדות SD המורדמות לניתוח על ידי גילוח הפרווה של אזור הצוואר הגחוני במצב שכיבה. יש לחטא את אזור הניתוח באמצעות כדורי צמר גפן פובידון-יוד (ראו טבלת חומרים).
3. כסו את בעל החיים בווילונות כירורגיים (ראו טבלת חומרים), וחשפו את אזור הניתוח, במטרה למזער זיהום מיקרוביאלי.

2. כריתת בלוטת התריס (PTX)

1. מתחילים בנקודת האמצע בין שתי האוזניים, וחותכים חתך אורכי של 2 ס"מ לכיוון הזנב באמצעות אזמל כירורגי. נתחו את הפאשיה ואת שכבת השומן ברצף בעזרת מלקחיים חדים, מעוקלים ומשוננים.
2. הפרידו את השרירים הפארא-טרכאליים, וחשפו את קנה הנשימה באמצעות מלקחיים קהים יחסית תחת מיקרוסקופ סטריאופוני בהגדלה של פי 4-5.
3. אתר את האונות השמאלית והימנית של בלוטות התריס בצורת פרפר לצד קנה הנשימה.
4. יש להזריק 1 μL של תרחיף ננו-חלקיקי פחמן (ראה טבלת חומרים) מתחת לקרום בלוטות התריס באמצעות מזרק 10 μL עם מחט משופעת 30 גרם. לאחר 5 דקות, השקו את האזור הניתוחי במי מלח כדי לנקות את תרחיף ננו-חלקיקי הפחמן הנוסף המכסה את קרום בלוטת התריס.
   הערה: נקודת ההזרקה המומלצת היא החלק המזיאלי של אונת בלוטת התריס, שבו יש פחות כלי דם. תרחיף ננו-חלקיקי פחמן נפוץ בניתוחי בלוטת התריס בשל יכולתו לזהות את בלוטות הלימפה. צביעת בלוטות התריס והשארת בלוטות יותרת התריס ללא כתמים מקלה על זיהויים של האחרונים.
5. בדוק כדי לוודא כי בלוטות התריס להפוך שחור בעוד בלוטות יותרת התריס להישאר מוכתמים ~ 5 דקות. התבונן בבלוטות יותרת התריס המודגשות תחת אור רגיל באמצעות אור של מיקרוסקופ סטריאו או מנורת שולחן.
   הערה: בדרך כלל, למכרסמים יש שתי בלוטות יותרת התריס בצורת טיפה הממוקמות על פני השטח השמאלי והימני של בלוטות התריס. לעיתים, בלוטות יותרת התריס נוספות עשויות להיות ממוקמות רחוק יותר.
6. חותכים במדויק את בלוטות יותרת התריס לא מוכתמות עם מלקחיים מיקרו-כירורגיים ומספריים. השתמש כדורי צמר גפן סטרילי עבור hemostasis או ספוג ג 'לטין אם יש יותר דימום.
7. סגרו את השרירים, שכבות השומן והעור, שכבה אחר שכבה, בתפר מזרן אופקי קטוע באמצעות 6-0 תפרים פוליגלקטין 910 (ראו טבלת חומרים).
8. עבור קבוצת דמה, בצע את כל השלבים של ההכנה הטרום ניתוחית ו- PTX למעט שלב 2.6. מרדימים את החולדות, ומפרידים את הרקמות מעל קנה הנשימה. אתר את בלוטות יותרת התריס אך אל תסיר אותן. לבצע התאוששות לאחר הניתוח ותצפית יחד עם חולדות של קבוצת PTX.

3. התאוששות לאחר הניתוח ותצפית

1. לאחר הניתוח, הניחו את החולדות על שמיכה חשמלית תרמוסטטית (37°C) כדי לשמור על חום גופם. להזריק buprenorphine hydrochloride 0.01 מ"ג / ק"ג תת עורית (s.c) כל 12 שעות כמו שיכוך כאבים לאחר הניתוח. מעבירים את החולדות לכלוב סטרילי כשהן מתחילות לזוז ומנסות לזחול.
2. התבוננו מקרוב בחולדות לאחר הניתוח במשך שעתיים. החזירו את החולדות לחדר הגידול, צפו בהן באופן שגרתי ותיעדו את מצבן.
3. יש לשאוב 10 מיקרוליטר דם מווריד הזנב 7 ימים לאחר הניתוח. מדדו את הסרום Ca+^2, סרום Pi וסרום PTH באמצעות ערכות מסחריות מתאימות (ראו טבלת חומרים). כריתת בלוטת התריס מוצלחת מייצרת נסיוב מופחת Ca²⁺ מיונן רמה 2 SD נמוך מזה של חולדות המופעלות על ידי דמה (9.00 mmol / L, n = 16).
   הערה: תוכנת סטטיסטיקה וגרפים (ראה טבלת חומרים) שימשה לניתוח סטטיסטי. מבחן t של סטודנט שימש להשוואת הפרמטרים של הסרום והשתן בין קבוצות הדמה וה- PTX. P < 0.05 נחשב מובהק סטטיסטית. בסרום ובשתן Ca²⁺ ו-Pi וסרום אוריאה וקריאטינין נמדדו בערכות מסחריות בהתאם להוראות היצרן (ראו טבלת חומרים). סרום C-telopeptide של קולגן מסוג I ואוסטיאוקלצין נמדדו עם ערכות ELISA זמינות מסחרית (ראה טבלת חומרים).

תוצאות

המיקום והמספר של בלוטות יותרת התריס נצפו בתחילה בחולדות תחת מיקרוסקופ דיסקציה. לפני הזרקת ננו-חלקיקי הפחמן, בלוטות התריס היו בצבע אדום שקוף, ובלוטות יותרת התריס כמעט ולא ניתן היה להבחין במיקרוסקופ (איור 1A). לאחר הזרקת הננו-חלקיקים, בלוטות התריס היו מוכתמות בשחור, בעוד שבלוט...

Discussion

דוחות אפידמיולוגיים מצביעים על כך שאיתור מחלות בלוטת התריס גדל באופן משמעותי, ומספר הניתוחים הקשורים שבוצעו גדל בהתאם^19,20. שיעור ההיארעות של היפופאראתירואידיזם לאחר ניתוח הוא כ 7.6%^8,21, בעוד התחלואה המוגברת של היפופאראתירואידיזם נרכש גרמה ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium Chloride Solution	Kelun Co. Sichuan, China
10 µL 30G NanoFil Syringe	WPI
6-0 polyglactin 910 suture with needle	Ethicon, Inc	J510G
Calcium LiquiColor test	EKF	0155-225	For Ca2+ analysis
Carbon Nanoparticles Suspension Injection	Lummy, Chongqing, China	H20073246	1 mL : 50 mg
Creatinine (Cr) Assay kit ( sarcosine oxidase )	Jiancheng, Nanjing, China	C011-2-1	For creatinine analysis
Disposable Scalpel	Shinva, China
Dumstar Biology forceps	Shinva, China
Micro Dissecting Spring Scissors	Shinva, China
MicroVue Rat intact PTH ELISA	Immunotopics	30-2531	For the measurement of PTH in rat serum
Needle Holder	Shinva, China
Phosphorus Liqui-UV test	EKF	0830-125	For Pi analysis
Ply gauze	Weian Co. Henan, China
Povidone-Iodine	Yongan pharmaceutical Co.Ltd. Chengdu, China
Prism 9.0 (statistics and graphing software)	GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA		https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/
Rat C-telopeptide of type I collagen (CTX-I) ELISA Kit	CUSABIO, Wuhan, China	CSB-E12776r	For CTX-I analysis
Rat Osteocalcin/Bone Gla Protein (OT/BGP) ELISA Kit	CUSABIO, Wuhan, China	CSB-E05129r	For osteocalcin analysis
Safety Single Edge Razor Blades	American Safety Razor Company	66-0089
Sprague-Dawley Rats			8 to 10 weeks old
Surgical Incise Drapes	Liangyou Co. Sichuan, China
Urea Assay Kit	Jiancheng, Nanjing, China	C013-2-1	For urea analysis