탄소 나노입자 보조 부갑상선 절제술을 통한 부갑상선 기능 저하증 쥐의 생성

요약

후천성 부갑상선 기능 저하증(HypoPT)의 동물 모델은 HypoPT가 미네랄 이온 항상성에 미치는 영향을 이해하고 새로운 치료법의 효과를 검증하는 데 중요합니다. 여기서, 탄소 나노입자를 이용하여 부갑상선 절제술(PTX)에 의해 후천성 부갑상선기능저하증(AHypoPT) 쥐 모델을 생성하는 기술이 제시된다.

초록

부갑상선 기능 저하증(HypoPT)은 부갑상선을 침범하는 희귀 질환으로 부갑상선 호르몬(PTH)의 분비 또는 효능이 감소하여 혈청 인 수치가 높고 혈청 칼슘 수치가 낮습니다. HypoPT는 가장 일반적으로 갑상선 또는 기타 전방 목 수술 중 땀샘의 우발적 손상 또는 제거로 인해 발생합니다. 부갑상선/갑상선 수술은 최근 몇 년 동안 더 보편화되었으며 이에 따라 수술 후 합병증으로 HypoPT의 발생이 증가했습니다. 미네랄 이온 항상성에 대한 HypoPT의 효과의 기본 메커니즘을 더 잘 이해하고 새로운 치료법의 치료 효과를 검증하기 위해 HypoPT 동물 모델이 매우 필요합니다. 여기서, 탄소나노입자를 이용하여 부갑상선 절제술(PTX)을 수행하여 수컷 쥐에서 후천성 HypoPT를 생성하는 기술이 보고되어 있다. 쥐 모델은 부갑상선 기능 저하증의 마우스 모델에 비해 큰 가능성을 보여줍니다. 중요하게도, 인간 PTH 수용체 결합 영역은 쥐의 서열 유사성과 84.2%의 서열 유사성을 가지며, 이는 마우스와 공유된 73.7%의 유사성보다 높습니다. 또한, PTH/PTHrP 수용체 신호 전달 경로에 영향을 미칠 수 있는 에스트로겐의 영향은 수컷 쥐에서 완전히 조사되지 않았습니다. 탄소 나노 입자는 기능에 영향을 미치지 않고 갑상선 림프절을 검게 염색하는 림프 추적자이지만 부갑상선을 염색하지 않아 쉽게 식별하고 제거 할 수 있습니다. 이 연구에서 혈청 PTH 수치는 PTX 후 감지할 수 없었고, 이로 인해 상당한 저칼슘혈증과 고인산혈증이 발생했습니다. 따라서 수술 후 HypoPT의 임상 상태는 쥐 모델에서 현저하게 나타낼 수 있습니다. 따라서 탄소 나노입자 보조 PTX는 HypoPT의 발병기전, 치료 및 예후를 연구하기 위한 매우 효과적이고 쉽게 구현할 수 있는 모델 역할을 할 수 있습니다.

서문

부갑상선 호르몬(PTH)은 부갑상선에서 분비됩니다. 칼슘 균형의 주요 조절제이며 인산염 대사를 유지하며 뼈 회전율 ^1,2에 참여합니다. 부갑상선 기능 저하증(HypoPT)은 PTH의 분비 감소 또는 기능 상실로 나타납니다. 희귀 내분비 질환으로 유병률은 100,000인년당 약 9-37명입니다 ^3,4,5. HypoPT는 혈청 인 ^6,7의 증가와 함께 혈청 PTH 및 칼슘 수치가 감소하는 것이 특징입니다. HypoPT는 원인에 따라 후천성 부갑상선 기능 저하증(AHypoPT) 또는 특발성 부갑상선 기능 저하증(IHypoPT)^으로 분류됩니다8. AHypoPT는 임상 실습에서 더 일반적으로 접하게 됩니다. AHypoPT 사례의 약 75%는 갑상선 수술 또는 기타 두경부 수술 중 부갑상선의 절제 또는 우발적 손상으로 인해 발생합니다. 다른 원인으로는 두경부 종양에 대한 방사선 요법 및 화학 요법 및 약물 독성이 있습니다 ^1,8. 진단 방법이 업그레이드되고 갑상선 관련 질환에 대한 선별 검사가 증가함에 따라 갑상선 수술 횟수가 증가했습니다. 이로 인해 관련 부갑상선 합병증이 증가했습니다 ^9,10.

AHypoPT를 더 잘 조사하고 새로운 치료법의 치료 효과를 검증하기 위해서는 안정적인 특성을 가진 쉽게 확립된 동물 모델이 필요합니다. 쥐와 생쥐에서 수행된 부갑상선 절제술(PTX)은 이전 연구에서 보고되었습니다 ^6,11; 그러나 부갑상선의 크기가 극히 작고 해부학 적 분포의 다양성으로 인해 성공률은 실제로 상대적으로 낮습니다. 따라서, 부갑상선 절제술(thyro-parathyroidectomy, TPTX)(즉, 갑상선과 부갑상선의 완전한 제거)은 일반적으로 부갑상선의 절제를 보장하기 위해 시행된다¹². 그러나 그 결과 티록신 수치가 낮아지면 이 동물 모델에 대한 연구가 복잡해질 수 있다¹³. 약물 자극 및 유전자 편집과 같은 다른 방법으로 확립된 HypoPT 모델은 가장 일반적인 AHypoPT 발병기전을 적절하게 나타낼 수 없습니다. 우리 그룹은 이전에 녹아웃 마우스 모델을 사용하여 부갑상선에 라벨을 붙이고 갑상선과 주변 해부학적 구조를 손상시키지 않고 부갑상선을 제거할 수 있도록 했습니다^14,15. 그러나 이 방법은 짝짓기 및 번식 요구 사항으로 인해 더 긴 개발 시간이 필요한 형질전환 마우스 모델을 사용합니다.

따라서 우리는 AHypoPT의 쉽게 생성 할 수있는 모델을 확립하는 것을 목표로했습니다. 이 연구는 탄소 나노입자 라벨링을 사용하는 PTX에 대한 쥐 모델을 설명합니다. 갑상선 수술에 일반적으로 사용되는 50 mg/mL의 탄소나노입자 현탁액은 국소 주사 후 갑상선에 고르게 분포한다¹⁶. 갑상선은 검게 변하지만, 부갑상선은 염색되지 않은 채로 남아 있다¹⁷따라서 부갑상선과 갑상선을 명확하게 구별하고 갑상선에 영향을 주지 않고 PTX를 시행할 수 있다. 이 방법은 연령대가 다른 쥐에게 적합합니다. 탄소 나노 입자 현탁액의 주입은 안전하며 갑상선 기능에 무시할 수있는 영향을 미친다¹⁸. 본 연구에서 생성된 탄소나노입자 표지 PTX 쥐 모델은 4주간의 관찰 기간 동안 유의한 저칼슘혈증 및 고인산혈증 표현형을 보였다. 따라서 이 AHypoPT 모델은 확립하기 쉽고 재현 가능한 표현형을 가지고 있습니다.

프로토콜

이 연구는 쓰촨 대학교 구강 질환 국가 핵심 연구소의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다. 실험 전에 관련 지역 기관으로부터 허가를 받았습니다. 평균 체중이 200-250g인 8-10주령의 수컷 Sprague-Dawley(SD) 래트 8마리를 본 연구에 사용했습니다. 동물들은 상업적 공급원으로부터 입수하였다 ( 재료의 표 참조). 실험 기간 동안 음식과 물이 임의로 제공되었습니다.

1. 탄소 나노 입자 보조 PTX 쥐 생성을 위한 수술 전 준비

1. 2.0%-2.5% 이소플루란 흡입을 사용하여 8-10주령 쥐를 마취한 다음 10mL/kg 체중의 트리브로모에탄올을 복강내(i.p.) 주사합니다. 동공 광 반사의 부재를 테스트하여 충분한 마취 깊이를 보장합니다. 마취 상태에서 건조를 방지하기 위해 눈에 수의사 연고를 사용하십시오.
   참고: 생후 8-10주 된 쥐는 성체 쥐로 인식됩니다. 그러나 이 모델링 방법은 생후 7일 정도의 어린 쥐에게 사용할 수 있습니다.
2. 마취된 SD 랫을 앙와위 자세로 복부 목 부위의 털을 면도하여 수술을 준비합니다. 포비돈 요오드 면봉을 사용하여 수술 부위를 소독합니다( 재료 표 참조).
3. 동물을 수술용 커튼으로 덮고( 재료 표 참조) 미생물 오염을 최소화하기 위해 수술 부위를 노출시킵니다.

2. 부갑상선 절제술(PTX)

1. 두 귀 사이의 중간 지점에서 시작하여 수술용 메스를 사용하여 꼬리 쪽으로 세로로 2cm 절개를 자릅니다. 날카롭고 구부러진 톱니 모양의 집게로 근막과 지방층을 연속적으로 해부합니다.
2. 기관주위 근육을 분리하고 4x-5x 배율의 실체 현미경으로 비교적 뭉툭한 집게를 사용하여 기관을 노출시킵니다.
3. 기관 옆에 있는 나비 모양의 갑상선의 왼쪽과 오른쪽 엽을 찾습니다.
4. 30G 경사진 바늘이 있는 10μL 주사기를 사용하여 갑상선 막 아래에 1μL의 탄소 나노입자 현탁액( 재료 표 참조)을 주입합니다. 5분 후, 수술 부위를 식염수로 세척하여 갑상선 막을 덮고 있는 여분의 탄소 나노입자 현탁액을 세척합니다.
   참고: 권장되는 주사 지점은 혈관이 적은 갑상선 엽의 근심 부분입니다. 탄소 나노 입자 현탁액은 림프절을 감지하는 능력 때문에 갑상선 수술에 일반적으로 사용됩니다. 갑상선을 염색하고 부갑상선을 염색하지 않은 상태로 두면 후자를 쉽게 식별할 수 있습니다.
5. 부갑상선이 ~ 5 분 안에 염색되지 않은 채로 유지되는 동안 갑상선이 검게 변하는지 확인하십시오. 강조 표시된 부갑상선을 실체 현미경 또는 테이블 램프의 빛을 사용하여 일반 조명 아래에서 관찰하십시오.
   참고: 일반적으로 설치류에는 갑상선의 왼쪽과 오른쪽 표면에 두 개의 물방울 모양의 부갑상선이 있습니다. 때로는 추가 부갑상선이 더 멀리 위치할 수 있습니다.
6. 미세 수술 겸자와 가위로 염색되지 않은 부갑상선을 정확하게 자릅니다. 지혈을 위해 멸균 면봉을 사용하거나 출혈이 더 많으면 젤라틴 스폰지를 사용하십시오.
7. 6-0 polyglactin 910 봉합사를 사용하여 중단된 수평 매트리스 봉합사로 근육, 지방층 및 피부를 층별로 닫습니다( 재료 표 참조).
8. 가짜 그룹의 경우 2.6 단계를 제외한 수술 전 준비 및 PTX의 모든 단계를 수행하십시오. 쥐를 마취시키고 기관 위의 조직을 분리하십시오. 부갑상선을 찾되 제거하지는 마십시오. PTX 그룹의 쥐와 함께 수술 후 회복 및 관찰을 수행합니다.

3. 수술 후 회복 및 관찰

1. 수술 후 쥐를 온도 조절 전기 담요(37°C)에 올려 체온을 유지합니다. 수술 후 진통제로 부프레노르핀 염산염 0.01mg/kg을 12시간마다 피하(s.c) 주사합니다. 쥐가 움직이기 시작하고 기어 다니기 시작할 때 쥐를 멸균 케이지로 옮깁니다.
2. 수술 후 2 시간 동안 쥐를 면밀히 관찰하십시오. 쥐를 사육실로 돌려보내고 일상적으로 관찰하고 상태를 기록합니다.
3. 수술 7일 후 꼬리 정맥에서 10μL의 혈액을 채취합니다. 적절한 상용 키트를 사용하여 혈청 Ca²⁺, 혈청 Pi 및 혈청 PTH를 측정합니다( 재료 표 참조). 성공적인 부갑상선 절제술은 가짜 수술 쥐보다 감소된 혈청 이온화 Ca²⁺ 수준 2 SD를 생성합니다(9.00mmol/L, n = 16).
   참고: 통계 및 그래프 소프트웨어( 재료 표 참조)가 통계 분석에 사용되었습니다. Student's t-test를 사용하여 가짜 그룹과 PTX 그룹 간의 혈청 및 소변 매개변수를 비교했습니다. p < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. 혈청 및 소변^Ca2+ 및 Pi 및 혈청 요소 및 크레아티닌은 제조업체의 지침에 따라 상용 키트로 측정되었습니다( 재료 표 참조). 유형 I 콜라겐 및 오스테오칼신의 혈청 C-텔로펩티드를 시판되는 ELISA 키트로 측정하였다( 재료 표 참조).

결과

부갑상선의 위치와 수는 처음에 해부 현미경으로 쥐에서 관찰되었습니다. 탄소 나노 입자 주입 전에 갑상선은 반투명 한 붉은 색이었고 부갑상선은 현미경으로 거의 구별 할 수 없었습니다 (그림 1A). 나노 입자 주입 후, 갑상선은 검은 색으로 염색되었고, 부갑상선은 염색되지 않은 채로 남아있었습니다 (그림 1B). 밝은 색의 부갑상선을 조심스럽게 해?...

토론

역학 보고서에 따르면 갑상선 질환의 발견이 크게 증가했으며 그에 따라 수행 된 관련 수술 건수가^19,20 건으로 증가했습니다. 수술 후 부갑상선 기능 저하증의 발병률은 약 7.6%^8,21이며, 후천성 부갑상선 기능 저하증의 이환율 증가로 인해 이 희귀 질환이 더 많은 연구 관심을 받고 있습니다. 따라서 질병의 발?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium Chloride Solution	Kelun Co. Sichuan, China
10 µL 30G NanoFil Syringe	WPI
6-0 polyglactin 910 suture with needle	Ethicon, Inc	J510G
Calcium LiquiColor test	EKF	0155-225	For Ca2+ analysis
Carbon Nanoparticles Suspension Injection	Lummy, Chongqing, China	H20073246	1 mL : 50 mg
Creatinine (Cr) Assay kit ( sarcosine oxidase )	Jiancheng, Nanjing, China	C011-2-1	For creatinine analysis
Disposable Scalpel	Shinva, China
Dumstar Biology forceps	Shinva, China
Micro Dissecting Spring Scissors	Shinva, China
MicroVue Rat intact PTH ELISA	Immunotopics	30-2531	For the measurement of PTH in rat serum
Needle Holder	Shinva, China
Phosphorus Liqui-UV test	EKF	0830-125	For Pi analysis
Ply gauze	Weian Co. Henan, China
Povidone-Iodine	Yongan pharmaceutical Co.Ltd. Chengdu, China
Prism 9.0 (statistics and graphing software)	GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA		https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/
Rat C-telopeptide of type I collagen (CTX-I) ELISA Kit	CUSABIO, Wuhan, China	CSB-E12776r	For CTX-I analysis
Rat Osteocalcin/Bone Gla Protein (OT/BGP) ELISA Kit	CUSABIO, Wuhan, China	CSB-E05129r	For osteocalcin analysis
Safety Single Edge Razor Blades	American Safety Razor Company	66-0089
Sprague-Dawley Rats			8 to 10 weeks old
Surgical Incise Drapes	Liangyou Co. Sichuan, China
Urea Assay Kit	Jiancheng, Nanjing, China	C013-2-1	For urea analysis