Generazione di ratti ipoparatiroidei tramite paratiroidectomia assistita da nanoparticelle di carbonio

Riepilogo

Un modello animale di ipoparatiroidismo acquisito (HypoPT) è fondamentale per comprendere come l'HypoPT influisce sull'omeostasi degli ioni minerali e per verificare l'efficacia di nuovi trattamenti. Qui, viene presentata una tecnica per generare un modello di ratto di ipoparatiroidismo acquisito (AHypoPT) mediante paratiroidectomia (PTX) utilizzando nanoparticelle di carbonio.

Abstract

L'ipoparatiroidismo (HypoPT) è una malattia rara che coinvolge le ghiandole paratiroidi ed è caratterizzata da una ridotta secrezione o potenza dell'ormone paratiroideo (PTH), che porta ad alti livelli sierici di fosforo e bassi livelli sierici di calcio. HypoPT più comunemente deriva da danni accidentali alle ghiandole o la loro rimozione durante la tiroide o altri interventi chirurgici del collo anteriore. La chirurgia paratiroidea/tiroidea è diventata più comune negli ultimi anni, con un corrispondente aumento dell'insorgenza di HypoPT come complicanza postoperatoria. C'è una necessità critica di un modello animale HypoPT per comprendere meglio i meccanismi alla base degli effetti di HypoPT sull'omeostasi degli ioni minerali e per verificare l'efficacia terapeutica di nuovi trattamenti. Qui, viene riportata una tecnica per creare HypoPT acquisita nei ratti maschi eseguendo la paratiroidectomia (PTX) utilizzando nanoparticelle di carbonio. Il modello di ratto mostra grandi promesse rispetto ai modelli murini di ipoparatiroidismo. È importante sottolineare che la regione di legame del recettore PTH umano ha una somiglianza di sequenza dell'84,2% con quella del ratto, che è superiore alla somiglianza del 73,7% condivisa con i topi. Inoltre, gli effetti degli estrogeni, che possono influenzare la via di segnalazione del recettore PTH/PTHrP, non sono stati completamente studiati nei ratti maschi. Le nanoparticelle di carbonio sono traccianti linfatici che colorano i linfonodi tiroidei neri senza influire sulla loro funzione, ma non macchiano le ghiandole paratiroidi, il che le rende facili da identificare e rimuovere. In questo studio, i livelli sierici di PTH non erano rilevabili dopo PTX e ciò ha provocato ipocalcemia e iperfosfatemia significative. Pertanto, lo stato clinico dell'HypoPT postoperatorio può essere notevolmente rappresentato nel modello di ratto. Il PTX assistito da nanoparticelle di carbonio può quindi servire come modello straordinariamente efficace e facilmente implementabile per studiare la patogenesi, il trattamento e la prognosi dell'HypoPT.

Introduzione

L'ormone paratiroideo (PTH) è secreto dalle ghiandole paratiroidi. È un importante modulatore dell'equilibrio del calcio, mantiene il metabolismo del fosfato e partecipa al turnover osseo ^1,2. L'ipoparatiroidismo (HypoPT) si manifesta come una diminuzione della secrezione o perdita funzionale di PTH. È una malattia endocrina rara, con una prevalenza di circa 9-37 per 100.000 anni-persona ^3,4,5. L'ipoPT è caratterizzata da una diminuzione dei livelli sierici di PTH e calcio accompagnata da un aumento del fosforo sierico ^6,7. L'ipoPT è classificata in base alla sua causa: ipoparatiroidismo acquisito (AHypoPT) o ipoparatiroidismo idiopatico (IHypoPT)⁸. AHypoPT si riscontra più comunemente nella pratica clinica; circa il 75% dei casi di AHypoPT sono causati da resezione o lesioni accidentali delle ghiandole paratiroidi durante la chirurgia della tiroide o altri interventi chirurgici alla testa e al collo. Altre cause includono la radioterapia e la chemioterapia per i tumori della testa e del collo e la tossicità dei farmaci ^1,8. I metodi diagnostici aggiornati e un aumento dello screening per le malattie associate alla ghiandola tiroidea hanno aumentato il numero di operazioni chirurgiche della ghiandola tiroidea. Ciò ha portato ad un corrispondente aumento delle complicanze della ghiandola paratiroidea correlate ^9,10.

Sono necessari modelli animali facilmente stabiliti con caratteristiche stabili per studiare meglio AHypoPT e verificare l'efficacia terapeutica di nuovi trattamenti. La paratiroidectomia (PTX) eseguita su ratti e topi è stata riportata in studi precedenti ^6,11; Tuttavia, a causa delle dimensioni estremamente ridotte delle ghiandole paratiroidi e della variabilità nella loro distribuzione anatomica, il tasso di successo è relativamente basso nella pratica. Pertanto, la tiro-paratiroidectomia (TPTX) (cioè la rimozione totale della tiroide e delle ghiandole paratiroidi) viene solitamente eseguita per garantire la resezione delle ghiandole paratiroidi¹². Tuttavia, i bassi livelli di tiroxina risultanti possono complicare gli studi con questo modello animale¹³. I modelli HypoPT stabiliti con altri metodi, come la stimolazione dei farmaci e l'editing genico, non possono rappresentare correttamente la patogenesi AHypoPT più comune. Il nostro gruppo ha precedentemente utilizzato modelli murini knockout per etichettare le ghiandole paratiroidi e consentire la rimozione delle ghiandole paratiroidi senza danneggiare le ghiandole tiroidee e le strutture anatomiche circostanti^14,15. Tuttavia, questo metodo utilizza modelli murini transgenici, che richiedono un tempo di sviluppo più lungo a causa dei requisiti di accoppiamento e riproduzione.

Pertanto, abbiamo mirato a stabilire un modello facilmente generabile di AHypoPT. Questo studio descrive un modello di ratto per PTX utilizzando l'etichettatura delle nanoparticelle di carbonio. Una sospensione di nanoparticelle di carbonio di 50 mg / ml, che è comunemente usata nella chirurgia della tiroide, si distribuisce uniformemente nelle ghiandole tiroidee dopo l'iniezione locale¹⁶. Le ghiandole tiroidee diventano nere, ma le ghiandole paratiroidi sono lasciate senza macchia¹⁷, distinguendo così chiaramente le ghiandole paratiroidi dalle ghiandole tiroidee e consentendo l'esecuzione del PTX senza influenzare le ghiandole tiroidee. Questo metodo è adatto a ratti di diverse età. L'iniezione della sospensione di nanoparticelle di carbonio è sicura e ha un effetto trascurabile sulla funzione tiroidea¹⁸. Il modello di ratto PTX marcato con nanoparticelle di carbonio generato in questo studio ha mostrato fenotipi significativi di ipocalcemia e iperfosfatemia durante il periodo di osservazione di 4 settimane. Pertanto, questo modello AHypoPT è facile da stabilire e ha un fenotipo riproducibile.

Protocollo

Questo studio è stato approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso lo State Key Laboratory of Oral Diseases, Sichuan University. Il permesso è stato ottenuto dalle agenzie locali competenti prima dell'esperimento. Per il presente studio sono stati utilizzati otto ratti maschi di Sprague-Dawley (SD) di 8-10 settimane, con un peso medio di 200-250 g. Gli animali sono stati ottenuti da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali). Cibo e acqua sono stati forniti ad libitum durante tutto il periodo sperimentale.

1. Preparazione preoperatoria per la generazione di ratti PTX assistiti da nanoparticelle di carbonio

1. Anestetizzare i ratti di 8-10 settimane usando un'inalazione di isoflurano al 2,0%-2,5%, seguita da un'iniezione intraperitoneale (i.p.) di tribromoetanolo a 10 ml/kg di peso corporeo. Garantire una sufficiente profondità dell'anestesia testando l'assenza del riflesso luminoso pupillare. Utilizzare unguento veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza durante l'anestesia.
   NOTA: I ratti che hanno 8-10 settimane sono riconosciuti come ratti adulti. Tuttavia, questo metodo di modellazione può essere utilizzato su ratti di 7 giorni.
2. Preparare i ratti SD anestetizzati per un intervento chirurgico radendo la pelliccia della regione ventrale del collo in posizione supina. Disinfettare l'area operatoria con batuffoli di cotone povidone-iodio (vedi Tabella dei materiali).
3. Coprire l'animale con teli chirurgici (vedi Tabella dei materiali) ed esporre la regione chirurgica, con l'obiettivo di ridurre al minimo la contaminazione microbica.

2. Paratiroidectomia (PTX)

1. Inizia dal punto medio tra le due orecchie e taglia un'incisione di 2 cm longitudinalmente verso la coda usando un bisturi chirurgico. Sezionare successivamente la fascia e lo strato di grasso con una pinza affilata, curva e seghettata.
2. Separare i muscoli paratracheali ed esporre la trachea usando una pinza relativamente smussata al microscopio stereo con un ingrandimento 4x-5x.
3. Individuare i lobi sinistro e destro delle ghiandole tiroidee a forma di farfalla sul lato della trachea.
4. Iniettare 1 μL della sospensione di nanoparticelle di carbonio (vedere Tabella dei materiali) sotto la membrana delle ghiandole tiroidee usando una siringa da 10 μL con un ago smussato da 30 G. Dopo 5 minuti, irrigare la regione operativa con soluzione salina per pulire la sospensione di nanoparticelle di carbonio extra che copre la membrana della ghiandola tiroidea.
   NOTA: Il punto di iniezione raccomandato è la porzione mesiale del lobo della ghiandola tiroidea, che ha meno vasi sanguigni. Una sospensione di nanoparticelle di carbonio è comunemente usata nella chirurgia della tiroide grazie alla sua capacità di rilevare i linfonodi. Colorare le ghiandole tiroidee e lasciare le ghiandole paratiroidi non colorate facilita l'identificazione di quest'ultimo.
5. Controllare per assicurarsi che le ghiandole tiroidee diventino nere mentre le ghiandole paratiroidi rimangono non colorate in ~ 5 min. Osservare le ghiandole paratiroidi evidenziate sotto la luce ordinaria usando la luce di un microscopio stereo o una lampada da tavolo.
   NOTA: Tipicamente, i roditori hanno due ghiandole paratiroidi a forma di goccia situate sulle superfici sinistra e destra delle ghiandole tiroidee. Occasionalmente, ulteriori ghiandole paratiroidi possono essere situate più lontano.
6. Tagliare con precisione le ghiandole paratiroidi non macchiate con pinze e forbici da microchirurgia. Utilizzare batuffoli di cotone sterili per l'emostasi o una spugna di gelatina se c'è più sanguinamento.
7. Chiudere i muscoli, gli strati di grasso e la pelle, strato per strato, con una sutura orizzontale del materasso interrotta utilizzando 6-0 punti di sutura poliglactina 910 (vedi Tabella dei materiali).
8. Per il gruppo fittizio, eseguire tutte le fasi della preparazione preoperatoria e PTX tranne il passaggio 2.6. Anestetizzare i ratti e separare i tessuti sopra la trachea. Individuare le ghiandole paratiroidi ma non rimuoverle. Condurre il recupero postoperatorio e l'osservazione insieme ai ratti del gruppo PTX.

3. Recupero postoperatorio e osservazione

1. Dopo l'intervento chirurgico, posizionare i ratti su una coperta elettrica termostatica (37 ° C) per mantenere la temperatura corporea. Iniettare buprenorfina cloridrato 0,01 mg/kg per via sottocutanea (s.c) ogni 12 ore come analgesia postoperatoria. Trasferisci i ratti in una gabbia sterile quando iniziano a muoversi e cercano di gattonare.
2. Osservare attentamente i ratti postoperatoriamente per 2 ore. Riportare i ratti nella stanza di allevamento, osservarli regolarmente e registrare il loro stato.
3. Prelevare 10 μL di sangue dalla vena della coda 7 giorni dopo l'intervento. Misurare il siero Ca²⁺, il Pi sierico e il PTH sierico utilizzando kit commerciali appropriati (vedere la tabella dei materiali). Una paratiroidectomia riuscita produce una riduzione della SD sierica ionizzata Ca²⁺ livello 2 inferiore a quella dei ratti operati (9,00 mmol/L, n = 16).
   NOTA: Per l'analisi statistica è stato utilizzato un software di statistica e grafici (vedi Tabella dei materiali). Il t-test di uno studente è stato utilizzato per confrontare i parametri sierici e urinari tra i gruppi sham e PTX. p < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo. Il siero e urinario Ca²⁺ e Pi e l'urea sierica e la creatinina sono stati misurati con kit commerciali secondo le istruzioni dei produttori (vedi Tabella dei materiali). Il C-telopeptide sierico di collagene di tipo I e osteocalcina è stato misurato con kit ELISA disponibili in commercio (vedi Tabella dei materiali).

Risultati

Le posizioni e il numero di ghiandole paratiroidi sono stati inizialmente osservati nei ratti al microscopio a dissezione. Prima dell'iniezione di nanoparticelle di carbonio, le ghiandole tiroidee erano di un colore rosso traslucido e le ghiandole paratiroidi erano difficilmente distinguibili al microscopio (Figura 1A). Dopo l'iniezione di nanoparticelle, le ghiandole tiroidee sono state colorate di nero, mentre le ghiandole paratiroidi sono rimaste non colorate (Figura ...

Discussione

I rapporti epidemiologici indicano che l'individuazione di malattie della tiroide è aumentata in modo significativo e il numero di interventi chirurgici correlati eseguiti è aumentato di conseguenza^19,20. Il tasso di incidenza dell'ipoparatiroidismo postchirurgico è di circa il 7,6%^8,21, mentre l'aumentata morbilità dell'ipoparatiroidismo acquisito ha fatto sì che questa rara malattia ottenesse una maggiore attenzione da pa...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium Chloride Solution	Kelun Co. Sichuan, China
10 µL 30G NanoFil Syringe	WPI
6-0 polyglactin 910 suture with needle	Ethicon, Inc	J510G
Calcium LiquiColor test	EKF	0155-225	For Ca2+ analysis
Carbon Nanoparticles Suspension Injection	Lummy, Chongqing, China	H20073246	1 mL : 50 mg
Creatinine (Cr) Assay kit ( sarcosine oxidase )	Jiancheng, Nanjing, China	C011-2-1	For creatinine analysis
Disposable Scalpel	Shinva, China
Dumstar Biology forceps	Shinva, China
Micro Dissecting Spring Scissors	Shinva, China
MicroVue Rat intact PTH ELISA	Immunotopics	30-2531	For the measurement of PTH in rat serum
Needle Holder	Shinva, China
Phosphorus Liqui-UV test	EKF	0830-125	For Pi analysis
Ply gauze	Weian Co. Henan, China
Povidone-Iodine	Yongan pharmaceutical Co.Ltd. Chengdu, China
Prism 9.0 (statistics and graphing software)	GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA		https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/
Rat C-telopeptide of type I collagen (CTX-I) ELISA Kit	CUSABIO, Wuhan, China	CSB-E12776r	For CTX-I analysis
Rat Osteocalcin/Bone Gla Protein (OT/BGP) ELISA Kit	CUSABIO, Wuhan, China	CSB-E05129r	For osteocalcin analysis
Safety Single Edge Razor Blades	American Safety Razor Company	66-0089
Sprague-Dawley Rats			8 to 10 weeks old
Surgical Incise Drapes	Liangyou Co. Sichuan, China
Urea Assay Kit	Jiancheng, Nanjing, China	C013-2-1	For urea analysis