Geração de Ratos Hipoparatireoides via Paratireoidectomia Assistida por Nanoparticle-Carbono

Resumo

Um modelo animal de hipoparatireoidismo adquirido (HypoPT) é crucial para entender como o HypoPT afeta a homeostase de íons minerais e para verificar a eficácia de novos tratamentos. Aqui, uma técnica é apresentada para gerar um modelo de hipoparatireoidismo adquirido (AHypoPT) em ratos por paratireoidectomia (PTX) usando nanopartículas de carbono.

Resumo

O hipoparatireoidismo (HypoPT) é uma doença rara que envolve as glândulas paratireoides, caracterizada por uma reduzida secreção ou potência do paratormônio (PTH), o que leva a níveis elevados de fósforo sérico e baixos níveis de cálcio sérico. O hipoTP resulta mais comumente de danos acidentais às glândulas ou sua remoção durante a cirurgia da tireoide ou outra cirurgia do pescoço anterior. A cirurgia de paratireoide/tireoide tornou-se mais comum nos últimos anos, com um aumento correspondente na ocorrência de HipoTP como complicação pós-operatória. Há uma necessidade crítica de um modelo animal de HypoPT para entender melhor os mecanismos subjacentes aos efeitos do HypoPT na homeostase de íons minerais e verificar a eficácia terapêutica de novos tratamentos. Aqui, uma técnica é relatada para criar HypoPT adquirido em ratos machos realizando paratireoidectomia (PTX) usando nanopartículas de carbono. O modelo de rato mostra-se muito promissor em relação aos modelos de camundongos de hipoparatireoidismo. É importante ressaltar que a região de ligação do receptor PTH humano tem uma similaridade de sequência de 84,2% com a do rato, que é maior do que a similaridade de 73,7% compartilhada com camundongos. Além disso, os efeitos do estrogênio, que podem afetar a via de sinalização do receptor PTH/PTHrP, não foram totalmente investigados em ratos machos. As nanopartículas de carbono são traçadores linfáticos que mancham os linfonodos da tireoide de preto sem afetar sua função, mas não mancham as glândulas paratireoides, o que as torna fáceis de identificar e remover. Neste estudo, os níveis séricos de PTH foram indetectáveis após PTX, o que resultou em hipocalcemia e hiperfosfatemia significativas. Assim, o estado clínico do HypoTP pós-operatório pode ser notavelmente representado no modelo de ratos. A PTX assistida por nanopartículas de carbono pode, portanto, servir como um modelo extraordinariamente eficaz e prontamente implementável para estudar a patogênese, o tratamento e o prognóstico da HypoPT.

Introdução

O paratormônio (PTH) é secretado pelas glândulas paratireoides. É um importante modulador do balanço de cálcio, mantém o metabolismo do fosfato e participa da remodelação^óssea1,2. O hipoparatireoidismo (HypoTP) manifesta-se como diminuição da secreção ou perda funcional do PTH. É uma desordem endócrina rara, com prevalência de aproximadamente 9-37 por 100.000 pessoas-ano ^3,4,5. O hipoTP é caracterizado pela diminuição dos níveis séricos de PTH e cálcio acompanhada de aumento do fósforo sérico ^6,7. A hipoTP é classificada com base em sua causa: hipoparatireoidismo adquirido (AHypoPT) ou hipoparatireoidismo idiopático (IHypoPT)⁸. A TPH é mais comumente encontrada na prática clínica; cerca de 75% dos casos de AHypoPT são causados por ressecção ou lesão acidental das glândulas paratireoides durante cirurgia de tireoide ou outras cirurgias de cabeça e pescoço. Outras causas incluem radioterapia e quimioterapia para tumores de cabeça e pescoço e toxicidade de drogas ^1,8. Métodos diagnósticos aprimorados e um aumento no rastreamento de doenças associadas à glândula tireoide aumentaram o número de operações cirúrgicas da glândula tireoide. Isso levou a um aumento correspondente nas complicações relacionadas à glândula paratireoide ^9,10.

Modelos animais facilmente estabelecidos e com características estáveis são necessários para melhor investigar a AHypoPT e verificar a eficácia terapêutica de novos tratamentos. A paratireoidectomia (PTX) realizada em ratos e camundongos foi relatada em estudos anteriores ^6,11; no entanto, devido ao tamanho extremamente pequeno das glândulas paratireoides e à variabilidade em sua distribuição anatômica, a taxa de sucesso é relativamente baixa na prática. Assim, a tireoparatireoidectomia (TPTX) (ou seja, a remoção total das glândulas tireoide e paratireoides) é geralmente realizada para garantir a ressecção das glândulas paratireoides12. No entanto, os baixos níveis de tiroxina resultantes podem complicar os estudos com esse modelo animal¹³. Modelos de hipoPT estabelecidos por outros métodos, como estimulação de drogas e edição gênica, não podem representar adequadamente a patogênese mais comum da AHypoPT. Nosso grupo utilizou previamente modelos knockout em camundongos para marcar as glândulas paratireoides e permitir a remoção das glândulas paratireoides sem danificar as glândulas tireoides e estruturas anatômicas adjacentes^14,15. No entanto, este método utiliza modelos de camundongos transgênicos, que requerem um tempo de desenvolvimento maior devido às exigências de acasalamento e reprodução.

Portanto, nosso objetivo foi estabelecer um modelo de AHypoPT de fácil geração. Este estudo descreve um modelo de PTX em ratos usando marcação de nanopartículas de carbono. Uma suspensão de nanopartículas de carbono de 50 mg/mL, comumente utilizada em cirurgia de tireoide, distribui-se uniformemente nas glândulas tireoides após injeção local¹⁶. As glândulas tireoides ficam pretas, mas as paratireoides não são coradas¹⁷, distinguindo claramente as glândulas paratireoides das tireoides e permitindo que a PTX seja realizada sem afetar as glândulas tireoides. Este método é adequado para ratos de diferentes idades. A injeção da suspensão de nanopartículas de carbono é segura e tem efeito desprezível sobre a função tireoidiana¹⁸. O modelo de PTX marcado com nanopartículas de carbono em ratos gerado neste estudo mostrou fenótipos significativos de hipocalcemia e hiperfosfatemia durante o período de observação de 4 semanas. Assim, este modelo AHypoPT é fácil de estabelecer e tem um fenótipo reprodutível.

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Protocolo

Este estudo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Laboratório Estadual de Doenças Bucais da Universidade de Sichuan. A permissão foi obtida de agências locais relevantes antes do experimento. Oito ratos machos da raça Sprague-Dawley (SD), com 8-10 semanas de idade, com peso médio de 200-250 g, foram utilizados para o presente estudo. Os animais foram obtidos de fonte comercial (ver Tabela de Materiais). Água e ração foram fornecidas ad libitum durante todo o período experimental.

1. Preparação pré-operatória para a geração de ratos PTX assistidos por nanopartículas de carbono

1. Anestesiar os ratos de 8-10 semanas de idade usando inalação de isoflurano a 2,0%-2,5%, seguida de uma injeção intraperitoneal (i.p.) de tribromoetanol a 10 mL/kg de peso corporal. Garanta uma profundidade suficiente de anestesia testando a ausência do reflexo de luz pupilar. Use pomada veterinária nos olhos para evitar o ressecamento durante a anestesia.
   NOTA: Ratos com 8-10 semanas de idade são reconhecidos como ratos adultos. No entanto, este método de modelagem pode ser usado em ratos a partir de 7 dias de idade.
2. Preparar os ratos SD anestesiados para a cirurgia raspando a pele da região ventral do pescoço na posição supina. Desinfetar a área operatória com bolas de algodão de iodopovidona (ver Tabela de Materiais).
3. Cobrir o animal com campos cirúrgicos (ver Tabela de Materiais) e expor a região cirúrgica, visando minimizar a contaminação microbiana.

2. Paratireoidectomia (PTX)

1. Iniciar no ponto médio entre as duas orelhas e cortar uma incisão de 2 cm longitudinalmente em direção à cauda com bisturi cirúrgico. Dissecar a fáscia e a camada de gordura sucessivamente com pinças afiadas, curvas e serrilhadas.
2. Separe os músculos paratraqueais e exponha a traqueia usando pinças relativamente rombas sob um microscópio estéreo em aumento de 4x-5x.
3. Localize os lobos esquerdo e direito das glândulas tireoides em forma de borboleta ao lado da traqueia.
4. Injectar 1 μL da suspensão de nanopartículas de carbono (ver Tabela de Materiais) sob a membrana das glândulas tiroide utilizando uma seringa de 10 μL com uma agulha chanfrada de 30 G. Após 5 min, irrigar a região operatória com soro fisiológico para limpar a suspensão extra de nanopartículas de carbono que cobre a membrana da glândula tireoide.
   NOTA: O ponto de injeção recomendado é a porção mesial do lobo da glândula tireoide, que tem menos vasos sanguíneos. Uma suspensão de nanopartículas de carbono é comumente usada em cirurgia da tireoide devido à sua capacidade de detectar os gânglios linfáticos. Colorir as glândulas tireoides e deixar as glândulas paratireoides sem coloração facilita a identificação das últimas.
5. Verifique para garantir que as glândulas tireoides ficam pretas enquanto as glândulas paratireoides permanecem sem manchas em ~5 min. Observe as glândulas paratireoides destacadas sob luz comum usando a luz de um microscópio estéreo ou uma lâmpada de mesa.
   NOTA: Normalmente, os roedores têm duas glândulas paratireoides em forma de gota localizadas nas superfícies esquerda e direita das glândulas tireoides. Ocasionalmente, glândulas paratireoides adicionais podem estar localizadas mais longe.
6. Corte precisamente as glândulas paratireoides não manchadas com pinça e tesoura de microcirurgia. Use bolas de algodão estéreis para hemostasia ou uma esponja de gelatina se houver mais sangramento.
7. Fechar os músculos, as camadas de gordura e a pele, camada por camada, com uma sutura horizontal interrompida do colchão usando pontos de poliglactina 910 6-0 (ver Tabela de Materiais).
8. Para o grupo sham, realizar todas as etapas do preparo pré-operatório e PTX, exceto o passo 2.6. Anestesiar os ratos e separar os tecidos acima da traqueia. Localize as glândulas paratireoides, mas não removê-las. Realizar recuperação e observação pós-operatória em conjunto com os ratos do grupo PTX.

3. Recuperação e observação pós-operatória

1. Após a cirurgia, colocar os ratos sobre uma manta elétrica termostática (37 °C) para manter a temperatura corporal. Injetar cloridrato de buprenorfina 0,01 mg/kg por via subcutânea (s.c.) a cada 12 h como analgesia pós-operatória. Transfira os ratos para uma gaiola estéril quando eles começarem a se mover e tentar rastejar.
2. Observar atentamente os ratos no pós-operatório por 2 h. Devolver os ratos à sala de criação, observá-los rotineiramente e registrar seu estado.
3. Retirar 10 μL de sangue da veia caudal 7 dias após a cirurgia. Medir o Ca²⁺ sérico, o Pi sérico e o PTH sérico usando kits comerciais apropriados (consulte a Tabela de Materiais). Uma paratireoidectomia bem-sucedida produz um nível 2 de SD de Ca²⁺ ionizado reduzido menor do que o de ratos sham-operados (9,00 mmol/L, n = 16).
   NOTA: Para a análise estatística foi utilizado um software estatístico e gráfico (ver Tabela de Materiais). O teste t de Student foi utilizado para comparar os parâmetros séricos e urinários entre os grupos sham e PTX. p < 0,05 foi considerado estatisticamente significante. Ca²⁺ e Pi séricos e urinários e ureia e creatinina séricas foram dosados com kits comerciais de acordo com as instruções do fabricante (ver Tabela de Materiais). O telopeptídeo C sérico do colágeno tipo I e osteocalcina foi medido com kits de ELISA disponíveis comercialmente (ver Tabela de Materiais).

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Resultados

A localização e o número de glândulas paratireoides foram inicialmente observados em ratos sob um microscópio de dissecção. Antes da injeção de nanopartículas de carbono, as glândulas tireoides eram de coloração vermelha translúcida e as paratireoides eram pouco distinguíveis ao microscópio (Figura 1A). Após a injeção das nanopartículas, as glândulas tireoides foram coradas de preto, enquanto as glândulas paratireoides permaneceram sem coloração (...

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Discussão

Relatórios epidemiológicos indicam que a detecção de doenças tireoidianas tem aumentado significativamente, e o número de cirurgias relacionadas realizadas tem aumentado em^{conformidade19,20}. A taxa de incidência de hipoparatireoidismo pós-cirúrgico é de aproximadamente 7,6%^8,21, enquanto o aumento da morbidade do hipoparatireoidismo adquirido fez com que essa doença rara ganhasse maior atenção da pesquisa.

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium Chloride Solution	Kelun Co. Sichuan, China
10 µL 30G NanoFil Syringe	WPI
6-0 polyglactin 910 suture with needle	Ethicon, Inc	J510G
Calcium LiquiColor test	EKF	0155-225	For Ca2+ analysis
Carbon Nanoparticles Suspension Injection	Lummy, Chongqing, China	H20073246	1 mL : 50 mg
Creatinine (Cr) Assay kit ( sarcosine oxidase )	Jiancheng, Nanjing, China	C011-2-1	For creatinine analysis
Disposable Scalpel	Shinva, China
Dumstar Biology forceps	Shinva, China
Micro Dissecting Spring Scissors	Shinva, China
MicroVue Rat intact PTH ELISA	Immunotopics	30-2531	For the measurement of PTH in rat serum
Needle Holder	Shinva, China
Phosphorus Liqui-UV test	EKF	0830-125	For Pi analysis
Ply gauze	Weian Co. Henan, China
Povidone-Iodine	Yongan pharmaceutical Co.Ltd. Chengdu, China
Prism 9.0 (statistics and graphing software)	GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA		https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/
Rat C-telopeptide of type I collagen (CTX-I) ELISA Kit	CUSABIO, Wuhan, China	CSB-E12776r	For CTX-I analysis
Rat Osteocalcin/Bone Gla Protein (OT/BGP) ELISA Kit	CUSABIO, Wuhan, China	CSB-E05129r	For osteocalcin analysis
Safety Single Edge Razor Blades	American Safety Razor Company	66-0089
Sprague-Dawley Rats			8 to 10 weeks old
Surgical Incise Drapes	Liangyou Co. Sichuan, China
Urea Assay Kit	Jiancheng, Nanjing, China	C013-2-1	For urea analysis