Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Kazanılmış hipoparatiroidizmin (HypoPT) bir hayvan modeli, HipoPT'nin mineral iyon homeostazını nasıl etkilediğini anlamak ve yeni tedavilerin etkinliğini doğrulamak için çok önemlidir. Burada, karbon nanopartikülleri kullanılarak paratiroidektomi (PTX) ile edinilmiş bir hipoparatiroidizm (AHypoPT) sıçan modeli oluşturmak için bir teknik sunulmuştur.

Özet

Hipoparatiroidizm (HipoPT), paratiroid bezlerini tutan, yüksek serum fosfor düzeylerine ve düşük serum kalsiyum düzeylerine yol açan, paratiroid hormonunun (PTH) salgılanmasının veya gücünün azalması ile karakterize nadir görülen bir hastalıktır. HipoPT en sık bezlerin kazara hasar görmesinden veya tiroid veya diğer ön boyun cerrahisi sırasında çıkarılmasından kaynaklanır. Paratiroid/tiroid cerrahisi son yıllarda daha yaygın hale gelmiştir ve postoperatif bir komplikasyon olarak HipoPT oluşumunda buna bağlı bir artış olmuştur. HipoPT'nin mineral iyon homeostazı üzerindeki etkilerinin altında yatan mekanizmaları daha iyi anlamak ve yeni tedavilerin terapötik etkinliğini doğrulamak için bir HipoPT hayvan modeline kritik bir ihtiyaç vardır. Burada, karbon nanopartikülleri kullanılarak paratiroidektomi (PTX) yapılarak erkek sıçanlarda edinilmiş HipoPT oluşturmak için bir teknik bildirilmiştir. Sıçan modeli, hipoparatiroidizmin fare modelleri üzerinde büyük umut vaat ediyor. Önemli olarak, insan PTH reseptörü bağlanma bölgesi, farelerle paylaşılan% 73.7 benzerlikten daha yüksek olan sıçanınkiyle % 84.2'lik bir dizi benzerliğine sahiptir. Ayrıca, PTH / PTHrP reseptör sinyal yolunu etkileyebilen östrojenin etkileri, erkek sıçanlarda tam olarak araştırılmamıştır. Karbon nanopartikülleri, tiroid lenf düğümlerini işlevlerini etkilemeden siyaha boyayan lenfatik izleyicilerdir, ancak paratiroid bezlerini boyamazlar, bu da onları tanımlamayı ve çıkarmayı kolaylaştırır. Bu çalışmada, PTX sonrası serum PTH düzeyleri saptanamadı ve bu da belirgin hipokalsemi ve hiperfosfatemi ile sonuçlandı. Bu nedenle, postoperatif HipoPT'nin klinik durumu sıçan modelinde dikkat çekici bir şekilde temsil edilebilir. Bu nedenle, karbon-nanopartikül destekli PTX, HipoPT'nin patogenezini, tedavisini ve prognozunu incelemek için olağanüstü etkili ve kolayca uygulanabilir bir model olarak hizmet edebilir.

Giriş

Paratiroid hormonu (PTH) paratiroid bezleri tarafından salgılanır. Kalsiyum dengesinin önemli bir modülatörüdür, fosfat metabolizmasını korur ve kemik döngüsüne katılır 1,2. Hipoparatiroidizm (HipoPT), PTH'nin sekresyonunun azalması veya fonksiyonel kaybı olarak kendini gösterir. Nadir görülen bir endokrin bozukluktur ve prevalansı 100.000 kişi-yıl başına yaklaşık 9-37 arasındadır 3,4,5. HipoPT, artmış serum fosfor 6,7 ile birlikte azalmış serum PTH ve kalsiyum seviyeleri ile karakterizedir. HipoPT nedenine göre sınıflandırılır: edinilmiş hipoparatiroidizm (AHypoPT) veya idiyopatik hipoparatiroidizm (IHypoPT)8. AHypoPT klinik pratikte daha sık rastlanmaktadır; AHypoPT vakalarının yaklaşık% 75'i, tiroid cerrahisi veya diğer baş boyun ameliyatları sırasında paratiroid bezlerinin rezeksiyonu veya kazara yaralanmasından kaynaklanır. Diğer nedenler arasında baş boyun tümörleri için radyoterapi ve kemoterapi ve ilaç toksisitesi 1,8 sayılabilir. Gelişen tanı yöntemleri ve tiroid bezi ile ilişkili hastalıkların taranmasında artış, tiroid bezi cerrahi operasyonlarının sayısını artırmıştır. Bu da ilişkili paratiroid bezi komplikasyonlarında 9,10 artışa yol açmıştır.

AHypoPT'yi daha iyi araştırmak ve yeni tedavilerin terapötik etkinliğini doğrulamak için kararlı özelliklere sahip kolayca oluşturulmuş hayvan modellerine ihtiyaç vardır. Sıçan ve farelere yapılan paratiroidektomi (PTX) önceki çalışmalarda bildirilmiştir 6,11; Bununla birlikte, paratiroid bezlerinin son derece küçük boyutları ve anatomik dağılımlarındaki değişkenlik nedeniyle, pratikte başarı oranı nispeten düşüktür. Bu nedenle, tiro-paratiroidektomi (TPTX) (yani, tiroid ve paratiroid bezlerinin tamamen çıkarılması) genellikle paratiroid bezlerinin rezeksiyonunu sağlamak için yapılır12. Bununla birlikte, ortaya çıkan düşük tiroksin seviyeleri, bu hayvan modeli13 ile yapılan çalışmaları zorlaştırabilir. İlaç stimülasyonu ve gen düzenleme gibi diğer yöntemlerle oluşturulan hipoPT modelleri, en yaygın AHypoPT patogenezini doğru bir şekilde temsil edememektedir. Grubumuz daha önce paratiroid bezlerini etiketlemek ve tiroid bezlerine ve çevresindeki anatomik yapılara zarar vermeden paratiroid bezlerinin çıkarılmasına izin vermek için nakavt fare modelleri kullanmıştır14,15. Bununla birlikte, bu yöntem, çiftleşme ve üreme gereksinimleri nedeniyle daha uzun bir geliştirme süresi gerektiren transgenik fare modellerini kullanır.

Bu nedenle, AHypoPT'nin kolay oluşturulan bir modelini kurmayı amaçladık. Bu çalışma, karbon nanopartikül etiketlemesini kullanarak PTX için bir sıçan modelini açıklamaktadır. Tiroid cerrahisinde yaygın olarak kullanılan 50 mg / mL'lik bir karbon nanopartikül süspansiyonu, lokal enjeksiyon16'dan sonra tiroid bezlerinde eşit olarak dağılır. Tiroid bezleri siyaha döner, ancak paratiroid bezleri lekesiz kalır17, böylece paratiroid bezlerini tiroid bezlerinden açıkça ayırt eder ve PTX'in tiroid bezlerini etkilemeden yapılmasına izin verir. Bu yöntem farklı yaşlardaki sıçanlar için uygundur. Karbon nanopartikül süspansiyonunun enjeksiyonu güvenlidir ve tiroid fonksiyonu üzerinde ihmal edilebilir bir etkiye sahiptir18. Bu çalışmada üretilen karbon nanopartikül etiketli PTX sıçan modeli, 4 haftalık gözlem süresi boyunca önemli hipokalsemi ve hiperfosfatemi fenotipleri göstermiştir. Bu nedenle, bu AHypoPT modelinin kurulması kolaydır ve tekrarlanabilir bir fenotipe sahiptir.

Protokol

Bu çalışma, Sichuan Üniversitesi Ağız Hastalıkları Devlet Anahtar Laboratuvarı'ndaki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır. Deneyden önce ilgili yerel kurumlardan izin alınmıştır. Bu çalışmada ortalama ağırlığı 200-250 g olan sekiz adet 8-10 haftalık erkek Sprague-Dawley (SD) sıçanı kullanıldı. Hayvanlar ticari bir kaynaktan elde edilmiştir (bakınız Malzeme Tablosu). Deney dönemi boyunca yiyecek ve su ad libitum olarak sağlanmıştır.

1. Karbon-nanopartikül destekli PTX sıçanlarının üretimi için preoperatif hazırlık

  1. 8-10 haftalık sıçanları %2.0-%2.5 izofluran inhalasyonu kullanarak uyuşturun, ardından 10 mL/kg vücut ağırlığında intraperitoneal (i.p.) tribromoetanol enjeksiyonu yapın. Pupilla ışık refleksinin yokluğunu test ederek yeterli anestezi derinliğini garanti edin. Anestezi altındayken kuruluğu önlemek için gözlerde veteriner merhemi kullanın.
    NOT: 8-10 haftalık sıçanlar yetişkin sıçanlar olarak kabul edilir. Bununla birlikte, bu modelleme yöntemi 7 günlük kadar genç sıçanlarda kullanılabilir.
  2. Anestezi uygulanan SD sıçanları, ventral boyun bölgesinin kürkünü sırtüstü pozisyonda tıraş ederek ameliyat için hazırlayın. Povidon-iyot pamuk topları kullanarak ameliyat bölgesini dezenfekte edin (bakınız Malzeme Tablosu).
  3. Hayvanı cerrahi örtülerle örtün (bakınız Malzeme Tablosu) ve mikrobiyal kontaminasyonu en aza indirmeyi amaçlayan cerrahi bölgeyi açığa çıkarın.

2. Paratiroidektomi (PTX)

  1. İki kulak arasındaki orta noktadan başlayın ve cerrahi bir neşter kullanarak kuyruğa doğru uzunlamasına 2 cm'lik bir kesi kesin. Fasya ve yağ tabakasını keskin, kavisli, tırtıklı forsepslerle art arda diseke edin.
  2. Paratrakeal kasları ayırın ve trakeayı stereo mikroskop altında 4x-5x büyütmede nispeten künt forseps kullanarak açığa çıkarın.
  3. Kelebek şeklindeki tiroid bezlerinin sol ve sağ loblarını trakeanın yan tarafına yerleştirin.
  4. 30 G eğimli iğne ile 10 μL'lik bir şırınga kullanarak tiroid bezlerinin zarının altına 1 μL karbon nanopartikül süspansiyonu (bakınız Malzeme Tablosu) enjekte edin. 5 dakika sonra, tiroid bezi zarını kaplayan ekstra karbon nanopartikül süspansiyonunu temizlemek için ameliyat bölgesini salinle sulayın.
    NOT: Önerilen enjeksiyon noktası, tiroid bezi lobunun daha az kan damarına sahip olan mesial kısmıdır. Bir karbon nanopartikül süspansiyonu, lenf düğümlerini tespit etme kabiliyeti nedeniyle tiroid cerrahisinde yaygın olarak kullanılır. Tiroid bezlerinin boyanması ve paratiroid bezlerinin lekesiz bırakılması, ikincisinin tanımlanmasını kolaylaştırır.
  5. Paratiroid bezleri ~ 5 dakika içinde lekesiz kalırken tiroid bezlerinin siyaha döndüğünden emin olun. Vurgulanan paratiroid bezlerini, bir stereo mikroskobun veya bir masa lambasının ışığını kullanarak normal ışık altında gözlemleyin.
    NOT: Tipik olarak, kemirgenler tiroid bezlerinin sol ve sağ yüzeylerinde bulunan iki damla şeklinde paratiroid bezine sahiptir. Bazen, ek paratiroid bezleri daha uzağa yerleştirilebilir.
  6. Lekesiz paratiroid bezlerini mikrocerrahi forseps ve makasla kesin olarak kesin. Hemostaz için steril pamuk topları veya daha fazla kanama varsa jelatin sünger kullanın.
  7. Kasları, yağ tabakalarını ve cildi katman katman, 6-0 poliglactin 910 sütür kullanarak kesilmiş yatay yatak sütürü ile kapatın (bkz.
  8. Sahte grup için, preoperatif preparatın ve PTX'in adım 2.6 hariç tüm adımlarını uygulayın. Sıçanları uyuşturun ve trakeanın üzerindeki dokuları ayırın. Paratiroid bezlerini bulun, ancak çıkarmayın. PTX grubunun sıçanları ile birlikte postoperatif iyileşme ve gözlem yapın.

3. Postoperatif iyileşme ve gözlem

  1. Ameliyattan sonra, vücut ısılarını korumak için sıçanları termostatik bir elektrikli battaniyeye (37 ° C) yerleştirin. Postoperatif analjezi olarak her 12 saatte bir deri altından 0.01 mg/kg buprenorfin hidroklorür (s.c) enjekte edin. Sıçanları hareket etmeye başladıklarında ve sürünmeye çalıştıklarında steril bir kafese aktarın.
  2. Sıçanları ameliyat sonrası 2 saat boyunca yakından gözlemleyin. Sıçanları yetiştirme odasına geri getirin, rutin olarak gözlemleyin ve durumlarını kaydedin.
  3. Ameliyattan 7 gün sonra kuyruk damarından 10 μL kan alın. Serum Ca2+, serum Pi ve serum PTH'yi uygun ticari kitler kullanarak ölçün (bkz. Başarılı bir paratiroidektomi, sham ile ameliyat edilen sıçanlarınkinden daha düşük serum iyonize Ca2 + seviye 2 SD üretir (9.00 mmol / L, n = 16).
    NOT: İstatistiksel analiz için bir istatistik ve grafik yazılımı (bakınız Malzeme Tablosu) kullanılmıştır. Sahte ve PTX grupları arasındaki serum ve üriner parametreleri karşılaştırmak için bir Student'ın t-testi kullanıldı. p < 0.05 istatistiksel olarak anlamlı bulundu. Serum ve idrar Ca2+ ve Pi ile serum üre ve kreatinin, üreticilerin talimatlarına göre ticari kitlerle ölçüldü (bakınız Malzeme Tablosu). Tip I kollajen ve osteokalsinin serum C-telopeptidi, piyasada bulunan ELISA kitleri ile ölçüldü (bakınız Malzeme Tablosu).

Sonuçlar

Paratiroid bezlerinin yerleri ve sayısı başlangıçta diseksiyon mikroskobu altında sıçanlarda gözlendi. Karbon nanopartikül enjeksiyonundan önce, tiroid bezleri yarı saydam kırmızı bir renkteydi ve paratiroid bezleri mikroskop altında zorlukla ayırt edilebiliyordu (Şekil 1A). Nanopartikül enjeksiyonundan sonra, tiroid bezleri siyaha boyanırken, paratiroid bezleri lekesiz kaldı (Şekil 1B). Açık renkli paratiroid bezlerinin dikkatli diseksiy...

Tartışmalar

Epidemiyolojik raporlar, tiroid hastalıklarının saptanmasının önemli ölçüde arttığını ve buna bağlı olarak yapılan ilgili ameliyatların sayısının arttığını göstermektedir19,20. Cerrahi sonrası hipoparatiroidi insidansı yaklaşık %7,68,21 iken, edinsel hipoparatiroidizmin artmış morbiditesi bu nadir hastalığın araştırmalara daha fazla ilgi çekmesine neden olmuştur. Bu n...

Açıklamalar

Yazarlar, rakip finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Bu çalışma NSFC hibe 81800928, Batı Çin Stomatoloji Okulu / Hastanesi Sichuan Üniversitesi'nden Araştırma Fonu (No. RCDWJS2021-1) ve Ağız Hastalıkları Açık Finansman Devlet Anahtar Laboratuvarı SKLOD-R013 tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
0.9% Sodium Chloride SolutionKelun Co. Sichuan, China
10 µL 30G NanoFil SyringeWPI
6-0 polyglactin 910 suture with needleEthicon, IncJ510G
Calcium LiquiColor testEKF0155-225For Ca2+ analysis
Carbon Nanoparticles Suspension InjectionLummy, Chongqing, ChinaH200732461 mL : 50 mg
Creatinine (Cr) Assay kit ( sarcosine oxidase )Jiancheng, Nanjing, ChinaC011-2-1For creatinine analysis
Disposable ScalpelShinva, China
Dumstar Biology forcepsShinva, China
Micro Dissecting Spring ScissorsShinva, China
MicroVue Rat intact PTH ELISAImmunotopics30-2531For the measurement of PTH in rat serum
Needle HolderShinva, China
Phosphorus Liqui-UV testEKF0830-125For Pi analysis
Ply gauzeWeian Co. Henan, China
Povidone-IodineYongan pharmaceutical Co.Ltd. Chengdu, China
Prism 9.0 (statistics and graphing software)GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USAhttps://www.graphpad.com/scientific-software/prism/
Rat C-telopeptide of type I collagen (CTX-I) ELISA KitCUSABIO, Wuhan, ChinaCSB-E12776rFor CTX-I analysis
Rat Osteocalcin/Bone Gla Protein (OT/BGP) ELISA KitCUSABIO, Wuhan, ChinaCSB-E05129rFor osteocalcin analysis
Safety Single Edge Razor BladesAmerican Safety Razor Company66-0089
Sprague-Dawley Rats8 to 10 weeks old
Surgical Incise DrapesLiangyou Co. Sichuan, China
Urea Assay KitJiancheng, Nanjing, ChinaC013-2-1For urea analysis

Referanslar

  1. Bilezikian, J. P., et al. Hypoparathyroidism in the adult: Epidemiology, diagnosis, pathophysiology, target-organ involvement, treatment, and challenges for future research. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (10), 2317-2337 (2011).
  2. Bilezikian, J. P. Hypoparathyroidism. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 105 (6), 1722-1736 (2020).
  3. Underbjerg, L., Sikjaer, T., Mosekilde, L., Rejnmark, L. Postsurgical hypoparathyroidism-Risk of fractures, psychiatric diseases, cancer, cataract, and infections. Journal of Bone and Mineral Research. 29 (11), 2504-2510 (2014).
  4. Underbjerg, L., Sikjaer, T., Mosekilde, L., Rejnmark, L. The epidemiology of nonsurgical hypoparathyroidism in Denmark: A nationwide case finding study. Journal of Bone and Mineral Research. 30 (9), 1738-1744 (2015).
  5. Astor, M. C., et al. Epidemiology and health-related quality of life in hypoparathyroidism in Norway. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 101 (8), 3045-3053 (2016).
  6. Rodriguez-Ortiz, M. E., et al. Calcium deficiency reduces circulating levels of FGF23. Journal of the American Society of Nephrology. 23 (7), 1190-1197 (2012).
  7. Davies, B. M., Gordon, A. H., Mussett, M. V. A plasma calcium assay for parathyroid hormone, using parathyroidectomized rats. The Journal of Physiology. 125 (2), 383-395 (1954).
  8. Clarke, B. L., et al. Epidemiology and diagnosis of hypoparathyroidism. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 101 (6), 2284-2299 (2016).
  9. Liu, Y., Shan, Z. Expert consensus on diagnosis and treatment for elderly with thyroid diseases in China. Aging Medicine. 4 (2), 70-92 (2021).
  10. Sulejmanovic, M., Cickusic, A. J., Salkic, S., Bousbija, F. M. Annual incidence of thyroid disease in patients who first time visit department for thyroid diseases in Tuzla Canton. Materia Socio-Medica. 31 (2), 130-134 (2019).
  11. Liao, H. W., et al. Relationship between fibroblast growth factor 23 and biochemical and bone histomorphometric alterations in a chronic kidney disease rat model undergoing parathyroidectomy. PloS One. 10 (7), 0133278 (2015).
  12. Russell, P. S., Gittes, R. F. Parathyroid transplants in rats: A comparison of their survival time with that of skin grafts. The Journal of Experimental Medicine. 109 (6), 571-588 (1959).
  13. Sakai, A., et al. Osteoclast development in immobilized bone is suppressed by parathyroidectomy in mice. Journal of Bone and Mineral Metabolism. 23 (1), 8-14 (2005).
  14. Bi, R., Fan, Y., Luo, E., Yuan, Q., Mannstadt, M. Two techniques to create hypoparathyroid mice: parathyroidectomy using GFP glands and diphtheria-toxin-mediated parathyroid ablation. Journal of Visualized Experiments. (121), e55010 (2017).
  15. Bi, R., et al. Diphtheria toxin- and GFP-based mouse models of acquired hypoparathyroidism and treatment with a long-acting parathyroid hormone analog. Journal of Bone and Mineral Research. 31 (5), 975-984 (2016).
  16. Huang, Y., et al. Carbon nanoparticles suspension injection for photothermal therapy of xenografted human thyroid carcinoma in vivo. MedComm. 1 (2), 202-210 (2020).
  17. Zhang, R. J., Chen, Y. L., Deng, X., Yang, H. Carbon nanoparticles for thyroidectomy and central lymph node dissection for thyroid cancer. The American Surgeon. , (2022).
  18. Long, M., et al. A carbon nanoparticle lymphatic tracer protected parathyroid glands during radical thyroidectomy for papillary thyroid non-microcarcinoma. Surgical Innovation. 24 (1), 29-34 (2017).
  19. Li, Y., et al. Efficacy and safety of long-term universal salt iodization on thyroid disorders: Epidemiological evidence from 31 provinces of mainland China. Thyroid. 30 (4), 568-579 (2020).
  20. Powers, J., Joy, K., Ruscio, A., Lagast, H. Prevalence and incidence of hypoparathyroidism in the United States using a large claims database. Journal of Bone and Mineral Research. 28 (12), 2570-2576 (2013).
  21. Zihao, N., et al. Promotion of allogeneic parathyroid cell transplantation in rats with hypoparathyroidism. Gland Surgery. 10 (12), 3403-3414 (2021).
  22. Goncu, B., et al. Xenotransplantation of microencapsulated parathyroid cells as a potential treatment for autoimmune-related hypoparathyroidism. Experimental and Clinical Transplantation. , (2021).
  23. Jung, S. Y., et al. Standardization of a physiologic hypoparathyroidism animal model. PLoS One. 11 (10), 0163911 (2016).
  24. Chen, W., Lv, Y., Xie, R., Xu, D., Yu, J. Application of lymphatic mapping to recognize and protect parathyroid in thyroid carcinoma surgery by using carbon nanoparticles. Journal of Clinical Otorhinolaryngology, Head, and Neck Surgery. 28 (24), 1918-1920 (1924).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

T pSay 197

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır