Generierung von hypoparathormonellen Ratten mittels Kohlenstoff-Nanopartikel-assistierter Parathyreoidektomie

Zusammenfassung

Ein Tiermodell des erworbenen Hypoparathyreoidismus (HypoPT) ist von entscheidender Bedeutung, um zu verstehen, wie HypoPT die Mineralionenhomöostase beeinflusst, und um die Wirksamkeit neuartiger Behandlungen zu überprüfen. In dieser Arbeit wird eine Technik vorgestellt, mit der ein erworbenes Hypoparathyreoidismus (AHypoPT) Rattenmodell durch Parathyreoidektomie (PTX) unter Verwendung von Kohlenstoffnanopartikeln generiert werden kann.

Zusammenfassung

Hypoparathyreoidismus (HypoPT) ist eine seltene Erkrankung der Nebenschilddrüsen, die durch eine verminderte Sekretion oder Potenz des Parathormons (PTH) gekennzeichnet ist, was zu hohen Serumphosphorspiegeln und niedrigen Serumkalziumspiegeln führt. HypoPT resultiert am häufigsten aus einer versehentlichen Schädigung der Drüsen oder ihrer Entfernung während einer Schilddrüsen- oder anderen Fronthalsoperation. Nebenschilddrüsen-/Schilddrüsenoperationen sind in den letzten Jahren häufiger geworden, mit einem entsprechenden Anstieg des Auftretens von HypoPT als postoperative Komplikation. Es besteht ein dringender Bedarf an einem HypoPT-Tiermodell, um die Mechanismen, die den Auswirkungen von HypoPT auf die Mineralionenhomöostase zugrunde liegen, besser zu verstehen und die therapeutische Wirksamkeit neuer Behandlungen zu überprüfen. Hier wird berichtet, dass eine Technik zur Erzeugung einer erworbenen HypoPT bei männlichen Ratten durch die Durchführung einer Parathyreoidektomie (PTX) mit Kohlenstoffnanopartikeln erzeugt wird. Das Rattenmodell ist vielversprechend gegenüber den Mausmodellen des Hypoparathyreoidismus. Wichtig ist, dass die Bindungsregion des menschlichen PTH-Rezeptors eine Sequenzähnlichkeit von 84,2 % mit der Ratte aufweist, was höher ist als die Ähnlichkeit von 73,7 % mit Mäusen. Darüber hinaus wurden die Auswirkungen von Östrogen, das den PTH/PTHrP-Rezeptor-Signalweg beeinflussen kann, bei männlichen Ratten nicht vollständig untersucht. Kohlenstoff-Nanopartikel sind lymphatische Tracer, die die Schilddrüsenlymphknoten schwarz färben, ohne ihre Funktion zu beeinträchtigen, aber sie verfärben die Nebenschilddrüsen nicht, wodurch sie leicht zu erkennen und zu entfernen sind. In dieser Studie waren die PTH-Spiegel im Serum nach PTX nicht nachweisbar, was zu einer signifikanten Hypokalzämie und Hyperphosphatämie führte. Somit kann der klinische Zustand der postoperativen HypoPT im Rattenmodell bemerkenswert dargestellt werden. Kohlenstoff-Nanopartikel-gestütztes PTX kann daher als außerordentlich effektives und leicht implementierbares Modell für die Untersuchung der Pathogenese, Behandlung und Prognose der HypoPT dienen.

Einleitung

Parathormon (PTH) wird von den Nebenschilddrüsen ausgeschüttet. Es ist ein wichtiger Modulator des Kalziumhaushalts, hält den Phosphatstoffwechsel aufrecht und ist am Knochenumsatz beteiligt ^1,2. Hypoparathyreoidismus (HypoPT) äußert sich durch eine verminderte Sekretion oder einen funktionellen Verlust der PTH. Es handelt sich um eine seltene endokrine Erkrankung mit einer Prävalenz von etwa 9-37 pro 100.000 Personenjahre ^3,4,5. Die HypoPT ist gekennzeichnet durch einen verminderten PTH- und Kalziumspiegel im Serum, der von einem erhöhten Serumphosphorspiegel begleitet^{wird 6,7}. Die HypoPT wird nach ihrer Ursache klassifiziert: erworbener Hypoparathyreoidismus (AHypoPT) oder idiopathischer Hypoparathyreoidismus (IHypoPT)⁸. AHypoPT ist in der klinischen Praxis häufiger anzutreffen; Etwa 75% der AHypoPT-Fälle werden durch eine Resektion oder versehentliche Verletzung der Nebenschilddrüsen bei Schilddrüsenoperationen oder anderen Kopf- und Halsoperationen verursacht. Weitere Ursachen sind Strahlen- und Chemotherapie bei Kopf-Hals-Tumoren und Arzneimitteltoxizität ^1,8. Verbesserte diagnostische Methoden und eine Zunahme des Screenings auf Schilddrüsen-assoziierte Erkrankungen haben die Zahl der Schilddrüsenoperationen erhöht. Dies hat zu einem entsprechenden Anstieg der damit verbundenen Nebenschilddrüsenkomplikationen geführt ^9,10.

Um AHypoPT besser untersuchen und die therapeutische Wirksamkeit neuartiger Therapien verifizieren zu können, werden leicht zu etablierende Tiermodelle mit stabilen Eigenschaften benötigt. In früheren Studien wurde über eine Parathyreoidektomie (PTX) an Ratten und Mäusen berichtet ^6,11; Aufgrund der extrem geringen Größe der Nebenschilddrüsen und der Variabilität in ihrer anatomischen Verteilung ist die Erfolgsquote in der Praxis jedoch relativ gering. So wird in der Regel eine Thyreo-Parathyreoidektomie (TPTX) (d. h. die vollständige Entfernung der Schilddrüse und der Nebenschilddrüsen) durchgeführt, um die Resektion der Nebenschilddrüsen^{sicherzustellen 12}. Die daraus resultierenden niedrigen Thyroxinspiegel können jedoch Studien mit diesem Tiermodell erschweren¹³. HypoPT-Modelle, die mit anderen Methoden, wie z.B. medikamentöser Stimulation und Geneditierung, etabliert wurden, können die häufigste AHypoPT-Pathogenese nicht adäquat abbilden. Unsere Gruppe verwendete zuvor Knockout-Mausmodelle, um die Nebenschilddrüsen zu markieren und die Entfernung der Nebenschilddrüsen zu ermöglichen, ohne die Schilddrüse und die umgebenden anatomischen Strukturen zu beschädigen^14,15. Bei dieser Methode werden jedoch transgene Mausmodelle verwendet, die aufgrund der Paarungs- und Zuchtanforderungen eine längere Entwicklungszeit benötigen.

Daher war es unser Ziel, ein einfach zu generierendes Modell von AHypoPT zu etablieren. In dieser Arbeit wird ein Rattenmodell für PTX beschrieben, das die Markierung von Kohlenstoffnanopartikeln verwendet. Eine Kohlenstoff-Nanopartikel-Suspension von 50 mg/ml, die üblicherweise in der Schilddrüsenchirurgie verwendet wird, verteilt sich nach lokaler Injektion gleichmäßig in den Schilddrüsen¹⁶. Die Schilddrüsen verfärben sich schwarz, aber die Nebenschilddrüsen bleiben ungefärbt¹⁷, wodurch die Nebenschilddrüsen klar von den Schilddrüsen unterschieden werden und die PTX durchgeführt werden kann, ohne die Schilddrüse zu beeinträchtigen. Diese Methode ist für Ratten unterschiedlichen Alters geeignet. Die Injektion der Kohlenstoff-Nanopartikel-Suspension ist sicher und hat einen vernachlässigbaren Einfluss auf die Schilddrüsenfunktion¹⁸. Das in dieser Studie generierte Kohlenstoff-Nanopartikel-markierte PTX-Rattenmodell zeigte während des 4-wöchigen Beobachtungszeitraums signifikante Hypokalzämie- und Hyperphosphatämie-Phänotypen. Somit ist dieses AHypoPT-Modell einfach zu etablieren und hat einen reproduzierbaren Phänotyp.

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Protokoll

Diese Studie wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee am State Key Laboratory of Oral Diseases der Universität Sichuan genehmigt. Vor dem Experiment wurde die Genehmigung der zuständigen lokalen Behörden eingeholt. Für die vorliegende Studie wurden acht 8-10 Wochen alte männliche Sprague-Dawley (SD) Ratten mit einem Durchschnittsgewicht von 200-250 g verwendet. Die Tiere stammen aus einer kommerziellen Quelle (siehe Materialtabelle). Nahrung und Wasser wurden während des gesamten Versuchszeitraums ad libitum zur Verfügung gestellt.

1. Präoperative Vorbereitung für die Generierung von Kohlenstoff-Nanopartikel-gestützten PTX-Ratten

1. Die 8-10 Wochen alten Ratten werden mit einer 2,0%-2,5%igen Isofluran-Inhalation anästhesiert, gefolgt von einer intraperitonealen (i.p.) Injektion von Tribromethanol mit 10 ml/kg Körpergewicht. Gewährleisten Sie eine ausreichende Narkosetiefe, indem Sie das Fehlen des Pupillenlichtreflexes testen. Verwenden Sie Tierarztsalbe auf den Augen, um Trockenheit unter Narkose zu vermeiden.
   HINWEIS: Ratten, die 8-10 Wochen alt sind, werden als erwachsene Ratten erkannt. Diese Modellierungsmethode kann jedoch bei Ratten im Alter von nur 7 Tagen angewendet werden.
2. Bereiten Sie die anästhesierten SD-Ratten auf die Operation vor, indem Sie das Fell der ventralen Halsregion in Rückenlage rasieren. Desinfizieren Sie den Operationsbereich mit Povidon-Jod-Wattebällchen (siehe Materialtabelle).
3. Decken Sie das Tier mit chirurgischen Abdecktüchern ab (siehe Materialtabelle) und legen Sie den chirurgischen Bereich frei, um die mikrobielle Kontamination zu minimieren.

2. Parathyreoidektomie (PTX)

1. Beginnen Sie in der Mitte zwischen den beiden Ohren und schneiden Sie mit einem chirurgischen Skalpell einen 2 cm langen Schnitt in Längsrichtung zum Schwanz. Präparieren Sie die Faszien- und Fettschicht nacheinander mit einer scharfen, gebogenen, gezackten Pinzette.
2. Trennen Sie die paratrachealen Muskeln und legen Sie die Luftröhre mit einer relativ stumpfen Pinzette unter einem Stereomikroskop bei 4-5-facher Vergrößerung frei.
3. Lokalisieren Sie den linken und rechten Lappen der schmetterlingsförmigen Schilddrüsen an der Seite der Luftröhre.
4. Injizieren Sie 1 μl der Kohlenstoff-Nanopartikel-Suspension (siehe Materialtabelle) mit einer 10-μl-Spritze und einer abgeschrägten 30-G-Nadel unter die Membran der Schilddrüsen. Spülen Sie nach 5 Minuten den Operationsbereich mit Kochsalzlösung, um die zusätzliche Kohlenstoff-Nanopartikel-Suspension zu reinigen, die die Schilddrüsenmembran bedeckt.
   Anmerkungen: Der empfohlene Injektionspunkt ist der mesiale Teil des Schilddrüsenlappens, der weniger Blutgefäße aufweist. Eine Kohlenstoff-Nanopartikel-Suspension wird häufig in der Schilddrüsenchirurgie verwendet, da sie die Lymphknoten erkennen kann. Die Schilddrüse zu verfärben und die Nebenschilddrüsen ungefärbt zu lassen, erleichtert die Identifizierung der letzteren.
5. Stellen Sie sicher, dass sich die Schilddrüsen schwarz verfärben, während die Nebenschilddrüsen in ~5 Minuten ungefärbt bleiben. Beobachten Sie die hervorgehobenen Nebenschilddrüsen unter normalem Licht, entweder mit dem Licht eines Stereomikroskops oder einer Tischlampe.
   Anmerkungen: Typischerweise haben Nagetiere zwei tropfenförmige Nebenschilddrüsen, die sich auf der linken und rechten Oberfläche der Schilddrüse befinden. Gelegentlich können sich weitere Nebenschilddrüsen weiter entfernt befinden.
6. Schneiden Sie die unverfärbten Nebenschilddrüsen mit einer mikrochirurgischen Zange und einer Schere präzise ab. Verwenden Sie sterile Wattebällchen für die Blutstillung oder einen Gelatineschwamm, wenn es mehr Blutungen gibt.
7. Schließen Sie die Muskeln, Fettschichten und die Haut Schicht für Schicht mit einer unterbrochenen horizontalen Matratzennaht mit 6-0 Polyglactin 910-Nähten (siehe Materialtabelle).
8. Führen Sie für die Scheingruppe alle Schritte der präoperativen Vorbereitung und PTX mit Ausnahme von Schritt 2.6 durch. Betäuben Sie die Ratten und trennen Sie das Gewebe über der Luftröhre. Lokalisieren Sie die Nebenschilddrüsen, aber entfernen Sie sie nicht. Führen Sie zusammen mit den Ratten der PTX-Gruppe eine postoperative Genesung und Beobachtung durch.

3. Postoperative Genesung und Beobachtung

1. Legen Sie die Ratten nach der Operation auf eine thermostatische Heizdecke (37 °C), um ihre Körpertemperatur aufrechtzuerhalten. Als postoperative Analgesie wird Buprenorphinhydrochlorid 0,01 mg/kg subkutan (s.c) alle 12 h injiziert. Bringen Sie die Ratten in einen sterilen Käfig, wenn sie anfangen, sich zu bewegen und zu krabbeln.
2. Beobachten Sie die Ratten postoperativ 2 h lang. Bringen Sie die Ratten in den Aufzuchtraum zurück, beobachten Sie sie routinemäßig und zeichnen Sie ihren Zustand auf.
3. 7 Tage nach der Operation werden 10 μl Blut aus der Schwanzvene entnommen. Messen Sie das Serum-Ca²⁺, das Serum-Pi und das Serum-PTH mit geeigneten handelsüblichen Kits (siehe Materialtabelle). Eine erfolgreiche Parathyreoidektomie führt zu einem reduzierten ionisierten Serum-Ca2+-SD-Wert von 2⁺ , der niedriger ist als bei scheinoperierten Ratten (9,00 mmol/L, n = 16).
   HINWEIS: Für die statistische Analyse wurde eine Statistik- und Grafiksoftware (siehe Materialtabelle) verwendet. Ein Schüler-t-Test wurde verwendet, um die Serum- und Harnparameter zwischen der Schein- und der PTX-Gruppe zu vergleichen. p < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Die Serum- und Urinwerte Ca²⁺ und Pi sowie der Serumharnstoff und das Kreatinin wurden mit handelsüblichen Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen (siehe Materialtabelle). Das Serum-C-Telopeptid von Kollagen Typ I und Osteocalcin wurde mit kommerziell erhältlichen ELISA-Kits gemessen (siehe Materialtabelle).

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Ergebnisse

Die Lage und Anzahl der Nebenschilddrüsen wurden zunächst bei Ratten unter dem Präpariermikroskop beobachtet. Vor der Injektion von Kohlenstoff-Nanopartikeln waren die Schilddrüsen durchscheinend rot gefärbt und die Nebenschilddrüsen waren unter dem Mikroskop kaum zu unterscheiden (Abbildung 1A). Nach der Injektion der Nanopartikel waren die Schilddrüsen schwarz gefärbt, während die Nebenschilddrüsen ungefärbt blieben (Abbildung 1B). Die sorgfältige ...

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Diskussion

Epidemiologische Berichte deuten darauf hin, dass die Erkennung von Schilddrüsenerkrankungen deutlich zugenommen hat und die Zahl der damit verbundenen Operationen entsprechend zugenommen hat^19,20. Die Inzidenzrate des postoperativen Hypoparathyreoidismus liegt bei etwa 7,6 %^8,21, während die erhöhte Morbidität des erworbenen Hypoparathyreoidismus dazu geführt hat, dass diese seltene Erkrankung größere Aufmerksamkeit in d...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium Chloride Solution	Kelun Co. Sichuan, China
10 µL 30G NanoFil Syringe	WPI
6-0 polyglactin 910 suture with needle	Ethicon, Inc	J510G
Calcium LiquiColor test	EKF	0155-225	For Ca2+ analysis
Carbon Nanoparticles Suspension Injection	Lummy, Chongqing, China	H20073246	1 mL : 50 mg
Creatinine (Cr) Assay kit ( sarcosine oxidase )	Jiancheng, Nanjing, China	C011-2-1	For creatinine analysis
Disposable Scalpel	Shinva, China
Dumstar Biology forceps	Shinva, China
Micro Dissecting Spring Scissors	Shinva, China
MicroVue Rat intact PTH ELISA	Immunotopics	30-2531	For the measurement of PTH in rat serum
Needle Holder	Shinva, China
Phosphorus Liqui-UV test	EKF	0830-125	For Pi analysis
Ply gauze	Weian Co. Henan, China
Povidone-Iodine	Yongan pharmaceutical Co.Ltd. Chengdu, China
Prism 9.0 (statistics and graphing software)	GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA		https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/
Rat C-telopeptide of type I collagen (CTX-I) ELISA Kit	CUSABIO, Wuhan, China	CSB-E12776r	For CTX-I analysis
Rat Osteocalcin/Bone Gla Protein (OT/BGP) ELISA Kit	CUSABIO, Wuhan, China	CSB-E05129r	For osteocalcin analysis
Safety Single Edge Razor Blades	American Safety Razor Company	66-0089
Sprague-Dawley Rats			8 to 10 weeks old
Surgical Incise Drapes	Liangyou Co. Sichuan, China
Urea Assay Kit	Jiancheng, Nanjing, China	C013-2-1	For urea analysis