Génération de rats hypoparathyroïdiens par parathyroïdectomie assistée par nanoparticules de carbone

Résumé

Un modèle animal d’hypoparathyroïdie acquise (HypoPT) est crucial pour comprendre comment HypoPT affecte l’homéostasie des ions minéraux et pour vérifier l’efficacité des nouveaux traitements. Ici, une technique est présentée pour générer un modèle d’hypoparathyroïdie acquise (AHypoPT) chez le rat par parathyroïdectomie (PTX) en utilisant des nanoparticules de carbone.

Résumé

L’hypoparathyroïdie (HypoPT) est une maladie rare impliquant les glandes parathyroïdes qui se caractérise par une sécrétion ou une puissance réduite de l’hormone parathyroïdienne (PTH), ce qui entraîne des taux élevés de phosphore sérique et de faibles taux de calcium sérique. L’hypoPT résulte le plus souvent de dommages accidentels aux glandes ou de leur retrait lors d’une chirurgie thyroïdienne ou d’une autre chirurgie antérieure du cou. La chirurgie parathyroïdienne / thyroïdienne est devenue plus fréquente ces dernières années, avec une augmentation correspondante de la survenue de HypoPT en tant que complication postopératoire. Il existe un besoin critique d’un modèle animal HypoPT pour mieux comprendre les mécanismes sous-jacents aux effets de HypoPT sur l’homéostasie des ions minéraux et pour vérifier l’efficacité thérapeutique des nouveaux traitements. Ici, une technique est rapportée pour créer l’hypoPT acquis chez les rats mâles en effectuant une parathyroïdectomie (PTX) en utilisant des nanoparticules de carbone. Le modèle du rat est très prometteur par rapport aux modèles murins d’hypoparathyroïdie. Il est important de noter que la région de liaison au récepteur PTH humain présente une similitude de séquence de 84,2% avec celle du rat, ce qui est supérieur à la similitude de 73,7% partagée avec les souris. De plus, les effets des œstrogènes, qui peuvent affecter la voie de signalisation des récepteurs PTH/PTHrP, n’ont pas été pleinement étudiés chez les rats mâles. Les nanoparticules de carbone sont des traceurs lymphatiques qui colorent les ganglions lymphatiques thyroïdiens en noir sans affecter leur fonction, mais elles ne colorent pas les glandes parathyroïdes, ce qui les rend faciles à identifier et à enlever. Dans cette étude, les taux sériques de PTH étaient indétectables après PTX, ce qui a entraîné une hypocalcémie et une hyperphosphatémie significatives. Ainsi, l’état clinique de l’hypoPT postopératoire peut être remarquablement représenté dans le modèle du rat. Le PTX assisté par nanoparticules de carbone peut donc servir de modèle extraordinairement efficace et facilement réalisable pour étudier la pathogenèse, le traitement et le pronostic de l’hypoPT.

Introduction

L’hormone parathyroïdienne (PTH) est sécrétée par les glandes parathyroïdes. C’est un modulateur majeur de l’équilibre calcique, maintient le métabolisme du phosphate, et participe au renouvellement osseux ^1,2. L’hypoparathyroïdie (HypoPT) se manifeste par une diminution de la sécrétion ou une perte fonctionnelle de PTH. Il s’agit d’une maladie endocrinienne rare, avec une prévalence d’environ 9 à 37 pour 100 000 années-personnes ^3,4,5. HypoPT est caractérisé par une diminution des taux sériques de PTH et de calcium accompagnée d’une augmentation du phosphore sérique ^6,7. L’hypoPT est classée en fonction de sa cause : hypoparathyroïdie acquise (AHypoPT) ou hypoparathyroïdie idiopathique (IHypoPT)⁸. L’AHypoPT est plus fréquemment rencontré dans la pratique clinique; environ 75% des cas d’AHypoPT sont causés par une résection ou une blessure accidentelle des glandes parathyroïdes lors d’une chirurgie de la thyroïde ou d’autres chirurgies de la tête et du cou. D’autres causes comprennent la radiothérapie et la chimiothérapie pour les tumeurs de la tête et du cou et la toxicité des médicaments ^1,8. L’amélioration des méthodes de diagnostic et l’augmentation du dépistage des maladies associées à la glande thyroïde ont augmenté le nombre d’opérations chirurgicales de la glande thyroïde. Cela a conduit à une augmentation correspondante^{des complications de} la glande parathyroïde ^9,10.

Des modèles animaux faciles à établir avec des caractéristiques stables sont nécessaires pour mieux étudier l’AHypoPT et vérifier l’efficacité thérapeutique des nouveaux traitements. La parathyroïdectomie (PTX) pratiquée sur des rats et des souris a été rapportée dans des études antérieures ^6,11; Cependant, en raison de la taille extrêmement petite des glandes parathyroïdes et de la variabilité de leur distribution anatomique, le taux de réussite est relativement faible dans la pratique. Ainsi, la thyro-parathyroïdectomie (TPTX) (c’est-à-dire l’ablation totale de la thyroïde et des glandes parathyroïdes) est généralement réalisée pour assurer la résection des glandes parathyroïdes¹². Cependant, les faibles niveaux de thyroxine qui en résultent peuvent compliquer les études avec ce modèle animal¹³. Les modèles hypoPT établis par d’autres méthodes, telles que la stimulation médicamenteuse et l’édition de gènes, ne peuvent pas représenter correctement la pathogenèse AHypoPT la plus courante. Notre groupe a précédemment utilisé des modèles de souris knockout pour marquer les glandes parathyroïdes et permettre l’ablation des glandes parathyroïdes sans endommager les glandes thyroïdes et les structures anatomiques environnantes^14,15. Cependant, cette méthode utilise des modèles de souris transgéniques, qui nécessitent un temps de développement plus long en raison des exigences d’accouplement et de reproduction.

Par conséquent, nous avons cherché à établir un modèle facile à générer d’AHypoPT. Cette étude décrit un modèle de rat pour PTX utilisant le marquage des nanoparticules de carbone. Une suspension de nanoparticules de carbone de 50 mg/mL, couramment utilisée en chirurgie de la thyroïde, se répartit uniformément dans les glandes thyroïdes après injection locale¹⁶. Les glandes thyroïdes deviennent noires, mais les glandes parathyroïdes ne sont pas tachées¹⁷, ce qui distingue clairement les glandes parathyroïdes des glandes thyroïdes et permet d’effectuer le PTX sans affecter les glandes thyroïdes. Cette méthode convient aux rats d’âges différents. L’injection de la suspension de nanoparticules de carbone est sûre et a un effet négligeable sur la fonction thyroïdienne¹⁸. Le modèle de rat PTX marqué par des nanoparticules de carbone généré dans cette étude a montré des phénotypes significatifs d’hypocalcémie et d’hyperphosphatémie au cours de la période d’observation de 4 semaines. Ainsi, ce modèle AHypoPT est facile à établir et possède un phénotype reproductible.

Protocole

Cette étude a été approuvée par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux du Laboratoire clé d’État des maladies bucco-dentaires de l’Université du Sichuan. L’autorisation a été obtenue auprès des agences locales compétentes avant l’expérience. Huit rats Sprague-Dawley (SD) mâles âgés de 8 à 10 semaines, pesant en moyenne entre 200 et 250 g, ont été utilisés pour la présente étude. Les animaux ont été obtenus d’une source commerciale (voir le tableau des matériaux). De la nourriture et de l’eau ont été fournies ad libitum tout au long de la période expérimentale.

1. Préparation préopératoire pour la génération de rats PTX assistés par nanoparticules de carbone

1. Anesthésier les rats âgés de 8 à 10 semaines en inhalant de l’isoflurane de 2,0 % à 2,5 %, suivie d’une injection intrapéritonéale (i.p.) de tribromoéthanol à 10 mL/kg de poids corporel. Garantir une profondeur d’anesthésie suffisante en testant l’absence du réflexe lumineux pupillaire. Utilisez une pommade vétérinaire sur les yeux pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
   REMARQUE : Les rats âgés de 8 à 10 semaines sont reconnus comme des rats adultes. Cependant, cette méthode de modélisation peut être utilisée sur des rats dès l’âge de 7 jours.
2. Préparez les rats SD anesthésiés pour la chirurgie en rasant la fourrure de la région du cou ventral en décubitus dorsal. Désinfectez la zone opératoire à l’aide de boules de coton povidone iodée (voir le tableau des matières).
3. Couvrez l’animal avec des champs chirurgicaux (voir le tableau des matériaux) et exposez la région chirurgicale, dans le but de minimiser la contamination microbienne.

2. Parathyroïdectomie (PTX)

1. Commencez au milieu entre les deux oreilles et coupez une incision longitudinale de 2 cm vers la queue à l’aide d’un scalpel chirurgical. Disséquez successivement le fascia et la couche de graisse avec des pinces pointues, incurvées et dentelées.
2. Séparez les muscles paratrachéaux et exposez la trachée à l’aide de pinces relativement émoussées sous un stéréomicroscope à un grossissement de 4x-5x.
3. Localisez les lobes gauche et droit des glandes thyroïdes en forme de papillon sur le côté de la trachée.
4. Injecter 1 μL de la suspension de nanoparticules de carbone (voir le tableau des matériaux) sous la membrane des glandes thyroïdes à l’aide d’une seringue de 10 μL avec une aiguille biseautée de 30 G. Après 5 min, irriguer la région opératoire avec une solution saline pour nettoyer la suspension de nanoparticules de carbone supplémentaire recouvrant la membrane de la glande thyroïde.
   REMARQUE: Le point d’injection recommandé est la partie mésiale du lobe de la glande thyroïde, qui a moins de vaisseaux sanguins. Une suspension de nanoparticules de carbone est couramment utilisée en chirurgie de la thyroïde en raison de sa capacité à détecter les ganglions lymphatiques. La coloration des glandes thyroïdes et le fait de laisser les glandes parathyroïdes non tachées facilitent l’identification de ces dernières.
5. Vérifiez que les glandes thyroïdes deviennent noires alors que les glandes parathyroïdes restent non tachées en ~5 min. Observez les glandes parathyroïdes mises en évidence sous une lumière ordinaire à l’aide de la lumière d’un stéréomicroscope ou d’une lampe de table.
   REMARQUE: En règle générale, les rongeurs ont deux glandes parathyroïdes en forme de goutte situées sur les surfaces gauche et droite des glandes thyroïdes. Parfois, des glandes parathyroïdes supplémentaires peuvent être situées plus loin.
6. Coupez précisément les glandes parathyroïdes non tachées avec des pinces microchirurgicales et des ciseaux. Utilisez des boules de coton stériles pour l’hémostase ou une éponge de gélatine s’il y a plus de saignements.
7. Fermez les muscles, les couches de graisse et la peau, couche par couche, avec une suture horizontale interrompue du matelas à l’aide de sutures 6-0 polyglactin 910 (voir le tableau des matériaux).
8. Pour le groupe fictif, effectuer toutes les étapes de la préparation préopératoire et du PTX à l’exception de l’étape 2.6. Anesthésiez les rats et séparez les tissus au-dessus de la trachée. Localisez les glandes parathyroïdes, mais ne les enlevez pas. Effectuer une récupération postopératoire et une observation avec les rats du groupe PTX.

3. Récupération postopératoire et observation

1. Après la chirurgie, placez les rats sur une couverture électrique thermostatique (37 °C) pour maintenir leur température corporelle. Injecter du chlorhydrate de buprénorphine 0,01 mg/kg par voie sous-cutanée (s.c) toutes les 12 h comme analgésie postopératoire. Transférez les rats dans une cage stérile lorsqu’ils commencent à bouger et à essayer de ramper.
2. Observez attentivement les rats postopératoirement pendant 2 h. Retournez les rats dans la salle d’élevage, observez-les régulièrement et notez leur état.
3. Prélever 10 μL de sang de la veine de la queue 7 jours après la chirurgie. Mesurer le sérum Ca²⁺, le sérum Pi et le sérum PTH à l’aide de trousses commerciales appropriées (voir le tableau des matières). Une parathyroïdectomie réussie produit une séropositivité réduite de Ca²⁺ ionisée de niveau 2 SD inférieure à celle des rats opérés simulés (9,00 mmol / L, n = 16).
   REMARQUE : Un logiciel de statistiques et de graphiques (voir le tableau des matières) a été utilisé pour l’analyse statistique. Un test t de Student a été utilisé pour comparer les paramètres sériques et urinaires entre les groupes simulé et PTX. p < 0,05 a été considéré comme statistiquement significatif. Les Ca²⁺ et Pi sériques et urinaires ainsi que l’urée sérique et la créatinine ont été mesurées à l’aide de trousses commerciales conformément aux instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux). Le sérique C-télopeptide de collagène de type I et d’ostéocalcine a été mesuré avec des trousses ELISA disponibles dans le commerce (voir le tableau des matériaux).

Résultats

Les emplacements et le nombre de glandes parathyroïdes ont été initialement observés chez le rat au microscope à dissection. Avant l’injection de nanoparticules de carbone, les glandes thyroïdes étaient de couleur rouge translucide et les glandes parathyroïdes étaient à peine distinguables au microscope (Figure 1A). Après l’injection de nanoparticules, les glandes thyroïdes étaient colorées en noir, tandis que les glandes parathyroïdes restaient non colorées (

Discussion

Les rapports épidémiologiques indiquent que la détection des maladies thyroïdiennes a considérablement augmenté et que le nombre de chirurgies connexes effectuées a augmenté en conséquence^19,20. Le taux d’incidence de l’hypoparathyroïdie postopératoire est d’environ 7,6 %^8,21, tandis que la morbidité accrue de l’hypoparathyroïdie acquise a fait en sorte que cette maladie rare attire davantage l’attention d...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium Chloride Solution	Kelun Co. Sichuan, China
10 µL 30G NanoFil Syringe	WPI
6-0 polyglactin 910 suture with needle	Ethicon, Inc	J510G
Calcium LiquiColor test	EKF	0155-225	For Ca2+ analysis
Carbon Nanoparticles Suspension Injection	Lummy, Chongqing, China	H20073246	1 mL : 50 mg
Creatinine (Cr) Assay kit ( sarcosine oxidase )	Jiancheng, Nanjing, China	C011-2-1	For creatinine analysis
Disposable Scalpel	Shinva, China
Dumstar Biology forceps	Shinva, China
Micro Dissecting Spring Scissors	Shinva, China
MicroVue Rat intact PTH ELISA	Immunotopics	30-2531	For the measurement of PTH in rat serum
Needle Holder	Shinva, China
Phosphorus Liqui-UV test	EKF	0830-125	For Pi analysis
Ply gauze	Weian Co. Henan, China
Povidone-Iodine	Yongan pharmaceutical Co.Ltd. Chengdu, China
Prism 9.0 (statistics and graphing software)	GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA		https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/
Rat C-telopeptide of type I collagen (CTX-I) ELISA Kit	CUSABIO, Wuhan, China	CSB-E12776r	For CTX-I analysis
Rat Osteocalcin/Bone Gla Protein (OT/BGP) ELISA Kit	CUSABIO, Wuhan, China	CSB-E05129r	For osteocalcin analysis
Safety Single Edge Razor Blades	American Safety Razor Company	66-0089
Sprague-Dawley Rats			8 to 10 weeks old
Surgical Incise Drapes	Liangyou Co. Sichuan, China
Urea Assay Kit	Jiancheng, Nanjing, China	C013-2-1	For urea analysis