Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول القدرات وطرائق الاستزراع الأساسية لرقاقة الجهاز المفتوح من أجل الإنشاء الناجح ونضج مزارع الأعضاء على الرقاقة كاملة السماكة للأنسجة الأولية (الجلد والحويصلات الهوائية ومجرى الهواء والأمعاء) ، مما يوفر الفرصة للتحقيق في الجوانب الوظيفية المختلفة للواجهة الظهارية / الوسيطة والأوعية الدموية البشرية في المختبر.

Abstract

تصطف جميع الأعضاء البشرية تقريبا مع الأنسجة الظهارية ، التي تضم طبقة واحدة أو عدة طبقات من الخلايا المتصلة بإحكام منظمة في هياكل ثلاثية الأبعاد (3D). واحدة من الوظائف الرئيسية للظهارة هي تشكيل الحواجز التي تحمي الأنسجة السفلية ضد الإهانات الفيزيائية والكيميائية والعوامل المعدية. بالإضافة إلى ذلك ، تتوسط الظهارة في نقل العناصر الغذائية والهرمونات وجزيئات الإشارات الأخرى ، وغالبا ما تخلق تدرجات كيميائية حيوية توجه وضع الخلايا وتقسيمها داخل العضو. نظرا لدورها المركزي في تحديد بنية الأعضاء ووظيفتها ، تعد الظهارة أهدافا علاجية مهمة للعديد من الأمراض البشرية التي لا يتم التقاطها دائما بواسطة النماذج الحيوانية. إلى جانب الاختلافات الواضحة بين الأنواع ، فإن إجراء دراسات بحثية حول وظيفة الحاجز وخصائص نقل الظهارة في الحيوانات يتفاقم بسبب صعوبة الوصول إلى هذه الأنسجة في نظام حي. في حين أن ثقافات الخلايا البشرية ثنائية الأبعاد (2D) مفيدة للإجابة على الأسئلة العلمية الأساسية ، إلا أنها غالبا ما تسفر عن تنبؤات ضعيفة في الجسم الحي . للتغلب على هذه القيود ، في العقد الماضي ، ظهر عدد كبير من منصات المحاكاة الحيوية المهندسة بدقة ، والمعروفة باسم الأعضاء على رقاقة ، كبديل واعد للاختبارات التقليدية في المختبر والحيوانات. هنا ، نصف رقاقة الجهاز المفتوحة (أو رقاقة مفتوحة العلوي) ، وهي منصة مصممة لنمذجة الأنسجة الظهارية الخاصة بالأعضاء ، بما في ذلك الجلد والرئتين والأمعاء. توفر هذه الشريحة فرصا جديدة لإعادة تشكيل البنية متعددة الخلايا ووظيفة الأنسجة الظهارية ، بما في ذلك القدرة على إعادة إنشاء مكون انسجة 3D من خلال دمج الخلايا الليفية الخاصة بالأنسجة والخلايا البطانية داخل نظام نشط ميكانيكيا. توفر هذه الشريحة المفتوحة أداة غير مسبوقة لدراسة التفاعلات الظهارية / الوسيطة والأوعية الدموية على مستويات متعددة من الدقة ، من الخلايا المفردة إلى تركيبات الأنسجة متعددة الطبقات ، مما يسمح بالتشريح الجزيئي للحديث المتبادل بين الخلايا للأعضاء الظهارية في الصحة والمرض.

Introduction

تاريخيا ، اعتمد العلماء على الاختبارات قبل السريرية على الحيوانات لاكتشاف الأدوية ، ولكن تم التشكيك في عدد متزايد من هذه الطرق بسبب ضعف الارتباط بالنتيجة البشرية1. إن تنفيذ مبادئ "3Rs" لاستبدال التجارب على الحيوانات وتقليلها وصقلها يحث العلماء على إيجاد طرق بديلة جديدة في المختبر لدعم تقييم مخاطر الأدوية والسموم الكيميائية قبل السريرية2. ومع ذلك ، فإن العديد من النماذج المختبرية التي تم تطويرها حتى الآن تفتقر إلى البنية البيولوجية والتعقيد الخلوي والبيئة الميكانيكية اللازمة لتلخيص الطبيعة الديناميكية للأعضاء الحية البشرية 3,4.

عادة ما تستخدم الأنظمة قبل السريرية التقليدية في المختبر زراعات أحادية 2D للخلايا البشرية المزروعة على سطح بلاستيكي صلب. توفر هذه الأساليب أداة لإجراء دراسات ميكانيكية بسيطة وتمكن من الفحص السريع للأدوية المرشحة. نظرا لتكلفتها المنخفضة نسبيا وقوتها العالية ، غالبا ما يتم إقران نماذج 2D بأنظمة أوتوماتيكية عالية الإنتاجية وتستخدم لتحديد سريع للأدوية المرشحة المحتملة خلال المرحلة المبكرة من عملية تطوير الأدوية 5,6. ومع ذلك ، فإن نماذج 2D هذه لا توفر نهجا متعديا لنمذجة الاستجابات على مستوى الأنسجة أو على مستوى الأعضاء أو النظامية للمرشحين العلاجيين ، وهو أمر ضروري للتنبؤات الدقيقة بسلامة الأدوية وفعاليتها خلال المرحلة قبل السريرية من تطورها. لا تلخص مزارع الخلايا المسطحة البيئة المكروية للأنسجة الأصلية ، بما في ذلك التفاعل المعقد متعدد الخلايا ، والخصائص الميكانيكية الحيوية ، والبنية ثلاثية الأبعاد (3D) للأنسجة البشرية7. غالبا لا تكتسب الخلايا التي تنمو على سطح مستو نمطا ظاهريا ناضجا؛ ومن ثم لا يمكنها الاستجابة للمثيرات الدوائية كما تفعل في الأنسجة الأصلية. على سبيل المثال ، تظهر الخلايا الظهارية السنخية البشرية الأولية التي تنمو في المختبر نمطا ظاهريا حرشفيا وتفقد علامات النمط الظاهري الرئيسية ، بما في ذلك البروتينات الخافضة للتوتر السطحي C و B (SP-C و SP-B)8. بالإضافة إلى التمايز غير الكافي ، غالبا ما تصبح الخلايا الأولية غير حساسة للضغوط البيولوجية في المختبر ، حيث تصبح بعض المسارات الكيميائية الحيوية المرتبطة بالتهاب الأنسجة غير وظيفية9. يبدو أن هذا الفقدان لوظيفة الخلية يرتبط في المقام الأول باستخدام ركائز صلبة بالإضافة إلى نقص العوامل القابلة للذوبان التي تطلقها بشكل طبيعي الخلايا اللحمية الخاصة بالأنسجة مثل الخلايا الليفية الرئوية وخلايا العضلات الملساء10,11.

إن فهم أن الافتقار إلى التعقيد الكيميائي الفيزيائي والبيولوجي يحد من السلوك الفسيولوجي للخلايا في المختبر قد عزز تطوير نماذج متعددة الخلايا أكثر تطورا ، والتي أثبتت أنها تلتقط بشكل أفضل تعقيد الأنسجة البشرية خارج الجسم12,13. منذ إنشاء أول نماذج الثقافة المشتركة في أوائل سبعينيات القرن العشرين14 ، أدى إدخال الهلاميات المائية الاصطناعية والطبيعية إلى تحسين القدرة على تقليد البيئات الدقيقة للأنسجة الأصلية بشكل كبير وأصبح أداة لا تقدر بثمن لدفع التمايز الخلوي ، وتوجيه التنظيم الذاتي للخلايا إلى هياكل تشبه الأنسجة ، واستعادة وظائف الأنسجة الأصلية15,16. على سبيل المثال ، عندما تزرع في سقالة 3D المناسبة ، يمكن للخلايا البشرية أن ترتب ذاتيا في هياكل وظيفية مثل الكرويات أو المواد العضوية ، معبرة عن علامات الخلايا الجذعية ، وتكون قادرة على التجديد الذاتي17. في المقابل ، فإن الخلايا البشرية (بما في ذلك الخلايا الجذعية) ، عندما تنمو على ركائز 2D التقليدية ، تتقدم في العمر بسرعة وتخضع للشيخوخة بعد بضع مقاطع18. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن "تخصيص" الهلاميات المائية لتتناسب مع خصائص الأنسجة المحددة مثل المسامية وحجم المسام وسمك الألياف ومرونة اللزوجة والتضاريس والصلابة أو هندستها بشكل أكبر مع المكونات الخلوية المشتقة من الأنسجة و / أو الجزيئات النشطة بيولوجيا التي تمكن من محاكاة الظروف الفسيولوجية أو المرضية19,20. على الرغم من إمكاناتها الهائلة لاختبار الأدوية ، فإن النماذج القائمة على الهيدروجيل 3D المستخدمة في الأبحاث الصيدلانية لا تلخص بشكل كامل البنية الخلوية المعقدة للأنسجة في الجسم الحي وتفتقر إلى محفزات الدورة الدموية والميكانيكية المهمة الموجودة عادة في جسم الإنسان ، بما في ذلك الضغط الهيدروستاتيكي والتمدد الدوري وقص السوائل21.

ظهرت الأنظمة الفيزيولوجية الدقيقة (MPSs) مثل الأعضاء على الرقائق (OOCs) مؤخرا كأدوات قادرة على التقاط الاستجابات الفسيولوجية المعقدة في المختبر22,23. غالبا ما تستخدم هذه النماذج استخدام منصات الموائع الدقيقة ، والتي تمكن من نمذجة البيئة المكروية الديناميكية للأعضاء الحية.

لقد جمعنا بين مبادئ الهندسة الحيوية للأنسجة 3D وعلم الأحياء الميكانيكي لإنشاء نموذج رقاقة مفتوح للأنسجة الظهارية البشرية المعقدة. سمح لنا ذلك بتلخيص البيئة المكروية متعددة الخلايا والديناميكية للأنسجة الظهارية عن كثب. وهذا يشمل الإشارات البيوكيميائية والميكانيكية الحيوية الخاصة بالأنسجة الموجودة بشكل طبيعي في الأعضاء الحية ولكن غالبا ما يتم إهمالها من قبل النماذج التقليدية في المختبر 24. تشتمل الرقاقة المفتوحة على جزأتين: حجرة وعائية (الشكل 1 أ) وحجرة انسجة (الشكل 1 ب) مفصولة بغشاء مسامي ، مما يسمح بنشر العناصر الغذائية بين الغرفتين (الشكل 1 ج). تتعرض حجرة الأوعية الدموية لتدفق مستمر للسوائل لتلخيص إجهاد القص الفسيولوجي ، بينما يسمح التصميم القابل للتمدد للغرفة اللحمية بنمذجة الإجهاد الميكانيكي المرتبط بحركات التنفس أو التمعج المعوي. تحتوي المقصورة اللحمية على سقالة هيدروجيل 3D القابلة للضبط المصممة لدعم النمو الفسيولوجي للخلايا الليفية الخاصة بالأنسجة. إنه يمتلك غطاء قابلا للإزالة يسهل إنشاء واجهة هوائية سائلة ، وهي حالة تسمح بمحاكاة أكبر لفسيولوجيا الإنسان للأنسجة المخاطية بالإضافة إلى الوصول المباشر إلى الأنسجة لإدارة الأدوية مباشرة على الطبقة الظهارية. يلتقط الشكل التكميلي 1 بعض المكونات الرئيسية لتصميم الرقاقة المفتوحة بما في ذلك الأبعاد والمقصورات البيولوجية (الشكل التكميلي 1A-D) بالإضافة إلى الخطوات الفنية الرئيسية الموضحة في هذا البروتوكول (الشكل التكميلي 1E).

يتم تحقيق نضح الرقاقة المفتوحة باستخدام مضخة تمعجية قابلة للبرمجة (الشكل 1 د). يسمح إعداد المضخة التمعجية بإدخال 12 شريحة مفتوحة في وقت واحد. يمكن لمعظم الحاضنات استيعاب إعدادين مما يتيح ثقافة ما يصل إلى 24 شريحة لكل حاضنة. يتم تحقيق التمدد الميكانيكي باستخدام منظم ضغط فراغ قابل للبرمجة حسب الطلب (الشكل 1E). يتكون من منظم فراغ كهربائي هوائي يتم التحكم فيه إلكترونيا بواسطة محول رقمي إلى تناظري. بمعنى آخر ، يقوم منظم الفراغ الكهربائي الهوائي بإنشاء ملف تعريف فراغ جيبي بسعة وتردد يحددهما المستخدم. يتم إنشاء سلالة دورية تتراوح من 0٪ إلى 15٪ عن طريق تطبيق ضغط سلبي على قناة الفراغ للرقاقة المفتوحة بسعة تتراوح من 0 إلى -90 كيلو باسكال وتردد 0.2 هرتز. إنه نظام مصمم خصيصا يعادل وحدة إجهاد Flexcell المتاحة تجاريا والتي تم اعتمادها ووصفها سابقا في أوراق أخرى25. لتقليد تشوه الأنسجة الميكانيكية المرتبط ، على سبيل المثال ، بحركة التنفس في الرئة أو التمعج في الأمعاء ، يطبق المشغل الهوائي موجات الفراغ / الإجهاد الجيبية التي يمكن تعديل حجمها وسعتها لتتناسب مع المستوى الفسيولوجي للإجهاد والتردد الذي تختبره الخلايا البشرية في أنسجتها الأصلية.

هنا ، نصف طريقة فعالة وقابلة للتكرار لهندسة وزراعة مكافئات الظهارة العضوية على نموذج أولي لمنصة رقاقة Open-Top. يسمح بتوليد نماذج أعضاء معقدة مثل الجلد والحويصلات الهوائية ومجرى الهواء والقولون مع دمج تدفق السوائل الوعائية والتمدد الميكانيكي. سنحدد الجوانب الفنية الرئيسية التي يجب مراعاتها أثناء تنفيذ مبادئ هندسة الأنسجة لتوليد نماذج ظهارية معقدة. سنناقش المزايا والقيود المحتملة للتصميم الحالي.

تم الإبلاغ عن نظرة عامة على الخطوات الرئيسية المستخدمة لتحقيق نضج الأنسجة والأعضاء ، بما في ذلك معلمات التدفق والتمدد ، في: الشكل 2 للجلد ، الشكل 3 للحويصلات الهوائية ، الشكل 4 لمجرى الهواء ، والشكل 5 للأمعاء. وترد في الجداول التكميلية معلومات إضافية عن تكوين الوسائط والكواشف المستخدمة في استزراع نماذج الأعضاء المختلفة (الجدول التكميلي 1 للجلد؛ والجدول 1 للجلد؛ والجدول 1 للجلد؛ والجدول 1 للجلد). الجدول التكميلي 2 للحويصلات الهوائية؛ الجدول التكميلي 3 لمجرى الهواء ، والجدول التكميلي 4 للأمعاء).

Protocol

تم الحصول على القولون البشري من استئصال الأمعاء وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة السلامة البيولوجية المؤسسية لمستشفى سينسيناتي للأطفال (IBC 2017-2011).

1. تنشيط السطح

  1. إعداد المخزن المؤقت للتنشيط
    1. ضع الكواشف العازلة للربط المتشابك والمذيبات تحت خزانة السلامة البيولوجية (BSC) واتركها تتوازن في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 10 دقائق قبل الاستخدام.
    2. أعد تكوين 5 مجم من الرابط المتشابك في 5 مل من المخزن المؤقت للمذيب باستخدام حاوية معقمة منيعة للضوء أو أنبوب مخروطي شفاف سعة 15 مل ملفوف بورق الألمنيوم لحماية محلول الرابط المتشابك من التعرض المباشر للضوء.
    3. دوامة الحل لمدة 1 دقيقة لإزالة جميع الكتل ، ثم ماصة 50 ميكرولتر من محلول crosslinker مباشرة في القناة السفلية للرقاقة و 150 ميكرولتر في الغرفة المفتوحة.
    4. قم بإزالة أي فائض من محلول التشابك من سطح الشريحة باستخدام شفاط. ثم ماصة إضافية 50 ميكرولتر من محلول التشابك مباشرة في القناة السفلية للرقاقة و 150 ميكرولتر في الغرفة المفتوحة لإزالة أي فقاعة هواء متبقية.
  2. التنشيط باستخدام آلة التشابك للأشعة فوق البنفسجية
    1. قم بإزالة الغطاء برفق من الشريحة الموجودة أسفل BSC وقم بتخزينه في حاوية معقمة.
    2. انقل الرقائق التي تحتوي على محلول التشابك إلى طبق بتري ، وأغلق طبق بتري لتجنب التلوث ، وضع الطبق مع الرقائق تحت آلة التشابك للأشعة فوق البنفسجية.
      ملاحظة: قم بإزالة غطاء طبق بتري لزيادة التعرض للأشعة فوق البنفسجية.
    3. اضبط آلة التشابك للأشعة فوق البنفسجية بطول موجي ذروة يبلغ 365 نانومتر بكثافة 100 μJ / cm2 ، وقم بتشغيل ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 20 دقيقة.
      ملاحظة: بعد 20 دقيقة من العلاج بالأشعة فوق البنفسجية ، سيبدو محلول التشابك أغمق (بني).
    4. أعد الرقائق إلى أسفل BSC واستنشق محلول التشابك المؤكسد. بعد ذلك ، اشطف جميع الرقائق ثلاث مرات باستخدام المخزن المؤقت للمذيبات واترك الرقائق تجف تحت BSC لمدة 5-10 دقائق لإكمال الوظيفة الكيميائية لسطح polydimethylsiloxane (PDMS).

2. إعداد ما يعادل سدى

  1. تحضير 10x عازلة لإعادة الإعمار (100 مل)
    1. قم بإذابة 2.2 جم من بيكربونات الصوديوم في 75 مل من 0.067 M NaOH في ماء مقطر مزدوج.
    2. أضف 4.76 جم من HEPES وارفع الحجم إلى 100 مل باستخدام الماء المقطر المزدوج.
    3. قم بتصفية المحلول المعقم تحت BSC باستخدام مرشح معقم أعلى الزجاجة يمكن التخلص منه بغشاء 0.22 ميكرومتر.
      ملاحظة: المحلول مستقر لمدة 6 أشهر تقريبا عند تخزينه عند 4 درجات مئوية.
  2. تقدير حجم محلول ما قبل الهلام
    1. اضرب عدد الرقائق اللازمة للتجربة في 150 ميكرولتر (الحجم الداخلي للغرفة المركزية المفتوحة) لتقدير كمية محلول ما قبل الهلام المطلوب للتجربة:
      الحجم المطلوب = (عدد الرقائق × 150) ميكرولتر
    2. تحضير محلول الكولاجين قبل الهلام على الجليد عن طريق خلط: حجم واحد من 10x EMEM يحتوي على الخلايا المفضلة ، 1 حجم من 10x العازلة لإعادة البناء (انظر الخطوة 2.1) ، 8 مجلدات من محلول الكولاجين I (10 ملغ / مل) و 1 ميكرولتر من محلول 1 N NaOH لكل ملغ من الكولاجين I.
      ملاحظة: يوصى بإعداد حجم إضافي + 15٪ لحساب الأخطاء التجريبية ؛ يوفر المثال الموضح في القسم 2.2 إجراء تفصيليا خطوة بخطوة لإعداد ما يكفي من محلول ما قبل الهلام ل 12 شريحة وحجم إضافي بنسبة 15٪.
  3. تحضير محلول ما قبل الهلام لمكافئ السدى (ل 12 رقائق)
    1. جلب الحلول التالية تحت BSC على الجليد: 10x EMEM ؛ 10x المخزن المؤقت لإعادة الإعمار (انظر الخطوة 2.1) ؛ محلول الكولاجين I (10 ملغ / مل) ؛ ومحلول معقم 1 N NaOH.
    2. زراعة خلايا اللحمة المتوسطة الخاصة بالأنسجة حسب توجيهات مقدمي الخدمة حتى 80٪ -90٪ متقاربة ، ثم فصل الخلايا باستخدام التربسين أو طرق أخرى على النحو الموصى به من قبل مزود الخلية. اجمع الخلايا في حبيبات عن طريق الطرد المركزي عند 250 × جم لمدة 5 دقائق عند 24 درجة مئوية.
    3. أعد تعليق حبيبات الخلية في 225 ميكرولتر من الثلج البارد 10x EMEM ، وأضف 225 ميكرولتر من المخزن المؤقت لإعادة البناء 10x المثلج البارد (انظر الخطوة 2.1). امزج المحلول عن طريق سحب الإصبع برفق لأعلى ولأسفل ، ثم أضف 1800 ميكرولتر من محلول الكولاجين المثلج I.
    4. ماصة صعودا وهبوطا 5-6 مرات ، وتجنب الفقاعات لخلط محلول ما قبل الجل أثناء الثلج.
  4. دمج مكافئ السدى على الرقاقة (ل 12 شريحة)
    1. تحييد محلول ما قبل الجل مع 18 ميكرولتر من 1 N هيدروكسيد الصوديوم. امزج بلطف عن طريق سحب الماصة لأعلى ولأسفل 5-6 مرات ، ثم ماصة 150 ميكرولتر من الهيدروجيل المحمل بالخلايا في الغرفة المركزية للشريحة المفتوحة لتجنب الفقاعات.
      ملاحظة: إذا كان النقش الدقيق مطلوبا ، فيرجى الانتقال إلى الخطوة التالية (القسم 3).
    2. قم بتجميع الرقائق في أطباق بتري منفصلة ، بما في ذلك غطاء أنبوب طرد مركزي مملوء ب 2 مل من ddH 2 O المعقم في كل طبق بتري ، واحتضان طبق (أطباق) بتري في الحاضنة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2.
      ملاحظة: بعد 90 دقيقة ، سيتم بلمرة الهيدروجيل المحمل بالخلايا بالكامل.

3. النقش الدقيق السطحي (اختياري)

  1. قم بإجراء النقش الدقيق السطحي للهيدروجيل اللحمي بعد سحب هيدروجيل الكولاجين المحايد (لا يزال في حالته السائلة) باستخدام طوابع مطبوعة 3D.
    ملاحظة: يمكن الحصول على الطوابع المطبوعة 3D في مختلف التصاميم القابلة للتخصيص ، كما هو موضح سابقا في مكان آخر24.
  2. ماصة 20 ميكرولتر من محلول الكولاجين المحايد I pre-gel على السطح المنقوش لختم معقم مطبوع 3D وأدخل الختم داخل (في الأعلى) من الغرفة المفتوحة بينما لا يزال هيدروجيل اللحمية في شكل سائل.
  3. قم بإزالة أي بقايا من الهيدروجيل قد تنسكب من أعلى الحجرة المفتوحة باستخدام شفاط (أو ماصة). قم بتجميع جميع الرقائق في أطباق بتري منفصلة وقم بتضمين غطاء أنبوب مخروطي سعة 15 مل مملوء ب 2 مل من ddH2O المعقم في كل طبق بتري.
  4. احتضن جميع أطباق بتري عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 لمدة 90 دقيقة ، ثم أعد الرقائق تحت BSC وقم بإزالة الطوابع برفق باستخدام ملاقط دقيقة لتقليل مخاطر إتلاف الهيدروجيل.

4. طلاء السطح الظهاري والأوعية الدموية ببروتينات ECM الخاصة بالأنسجة

  1. طلاء غرفة الموائع الدقيقة الوعائية ببروتينات مصفوفة خارج الخلية
    1. اضرب عدد الرقائق اللازمة للتجربة في 20 ميكرولتر (حجم القناة الوعائية) لتقدير حجم محلول طلاء ECM الوعائي المطلوب للتجربة:
      الحجم المطلوب = (عدد الرقائق × 20) ميكرولتر
      ملاحظة: يوصى بإعداد حجم إضافي بنسبة 15٪ لحساب الأخطاء التجريبية.
    2. قم بإعداد محلول طلاء ECM الوعائي لجميع الرقائق (على سبيل المثال ، 300 ميكرولتر لكل 12 شريحة) باستخدام برنامج تلفزيوني بارد أو HBSS.
      ملاحظة: ارجع إلى جدول بروتوكول الأعضاء المحدد في قسم المواد التكميلية (الجدول التكميلي 1 للبشرة; الجدول التكميلي 2 للحويصلات الهوائية؛ الجدول التكميلي 2 لمجرى الهواء ، والجدول التكميلي 4 للأمعاء) لتحديد الكواشف المحددة وتكوين ECM الموصى به.
    3. ماصة 20 ميكرولتر من محلول طلاء ECM الوعائي في القناة الوعائية لكل شريحة.
  2. طلاء السطح القمي للمكافئ اللحمي ببروتينات مصفوفة خارج الخلية
    1. اضرب عدد الرقائق اللازمة للتجربة في 50 ميكرولتر (حجم القناة الوعائية) لتقدير حجم محلول طلاء ECM الظهاري المطلوب للتجربة:
      الحجم المطلوب = (عدد الرقائق × 50) ميكرولتر
      ملاحظة: يوصى بإعداد حجم إضافي بنسبة 15٪ لحساب الأخطاء التجريبية.
    2. قم بإعداد ما يكفي من محلول طلاء ECM لجميع الرقائق (على سبيل المثال ، 750 ميكرولتر لكل 12 شريحة) في PBS أو HBSS الباردة الجليدية ونقل 50 ميكرولتر من محلول طلاء ECM الظهاري مباشرة فوق سطح الهيدروجيل.
      ملاحظة: ارجع إلى جدول بروتوكول الأعضاء المحدد في قسم المواد التكميلية (الجدول التكميلي 1 للبشرة; الجدول التكميلي 2 للحويصلات الهوائية؛ الجدول التكميلي 2 لمجرى الهواء ، والجدول التكميلي 4 للأمعاء) لتحديد الكواشف المحددة وتكوين ECM الموصى به.
    3. قم بتجميع الرقائق في أطباق بتري منفصلة ، بما في ذلك غطاء أنبوب مخروطي سعة 15 مل مملوء ب 2 مل من ddH 2 O المعقم في كلطبق بتري ، واحتضان أطباق بتري في الحاضنة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 لمدة ساعتين قبل الشروع في بذر الخلايا الظهارية.

5. بذر الخلايا الظهارية على المكافئ اللحمي

  1. ثقافة الخلايا الظهارية
    1. زراعة الخلايا الظهارية الخاصة بالأنسجة حسب توجيهات مقدمي الخدمة حتى 80٪ -90٪ متقاربة.
    2. فصل الخلايا باستخدام إجراءات الإنزيم المحلل للبروتين على النحو الموصى به من قبل مزود الخلية.
      ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج ، احصد الخلايا الظهارية عند ممر منخفض (P1-P2) خلال مرحلة النمو النشط عندما تصل إلى التقاء يتراوح بين 70٪ -90٪.
    3. بمجرد الانفصال ، قم بطرد الخلايا وجمعها على شكل حبيبات.
    4. أعد تعليق الخلايا الظهارية إلى كثافة الخلية / الشظية المناسبة كما هو موضح في جدول بروتوكول العضو المحدد.
      ملاحظة: في هذه الدراسة ، تم استخدام محلول الخلايا بكثافة 3 × 10 6 خلايا / مل للجلد ، 1 × 10 6 خلايا / مل للحويصلات الهوائية ، 6 × 10 6 خلايا / مل لمجرى الهواء و 8 × 10 6 شظايا / مل للأمعاء.
  2. بذر الخلايا الظهارية
    1. نقل الرقائق من الحاضنة إلى BSC. نضح محلول الطلاء من قناة الأوعية الدموية ، وشطف قناة الموائع الدقيقة الوعائية ثلاث مرات باستخدام 50 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا البطانية الطازجة.
    2. نضح محلول الطلاء من سطح الهيدروجيل وشطف السطح اللحمي ثلاث مرات باستخدام 100 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا الظهارية الطازجة لإزالة أي محلول طلاء زائد.
    3. نضح الوسط الصاعد وبذر سطح الهيدروجيل ب 50 ميكرولتر من تعليق الخلية الظهارية باستخدام كثافة الخلية المناسبة ، كما هو موضح في الجداول التكميلية ، ثم انقل الرقائق مرة أخرى إلى الحاضنة لمدة 2 ساعة (أو بين عشية وضحاها للقولون).
    4. اشطف سطح الهيدروجيل برفق باستخدام وسط زراعة الخلايا مرتين لإزالة الحطام الخلوي. أخيرا ، قم بتحديث الوسيط عن طريق التعقيم في حاويات محكمة الغلق قابلة للتعقيم ، وقم بتوصيل الرقائق بالمضخة التمعجية.

6. توصيل الرقائق بالتدفق

  1. تحضير الأجزاء السائلة
    1. قطع 2 بوصة من أنابيب نقل المطاط الصناعي الحراري (TPE) المتوافقة حيويا (جدول المواد) لإعداد أنابيب الموائع الدقيقة القصيرة المطلوبة لتوصيل الرقائق بخزانات الوسائط.
    2. قطع 7.5 بوصة من أنابيب نقل TPE المتوافقة حيويا لإنتاج أنابيب الموائع الدقيقة الطويلة.
    3. قم بإعداد ما يكفي من الموصلات المعدنية 18 جم و 19 جم (جدول المواد).
      ملاحظة: يوصى بإعداد وتعقيم الأنابيب والموصلات الموضحة في الخطوتين 6.1.1 و 6.1.2 قبل يوم واحد على الأقل من توصيل الرقائق المفتوحة بالمضخات التمعجية.
    4. اثقب غطاء كل خزان متوسط بإبرة تحت الجلد مقاس 4 بوصات (جدول المواد).
  2. تفريغ متوسط
    1. اسمح لوسط زراعة الخلية بالتوازن مع درجة حرارة الغرفة (RT).
    2. انقل حجم الوسط المطلوب إلى أنبوب ترشيح مخروطي.
    3. قم بتطبيق ضغط فراغ سلبي يبلغ -20 رطل لكل بوصة مربعة لإزالة الغاز من الوسط (الترشيح المدفوع بالفراغ).
      ملاحظة: في حالة عدم توفر فراغ ، يمكن ترك وسط زراعة الخلايا للتوازن في الحاضنة طوال الليل لتحقيق نتائج مماثلة.
  3. قم بإعداد الشريحة المفتوحة لتدفق السوائل
    1. ضع الرقائق والأجزاء السائلة المعقمة أسفل BSC وقم بمحاذاة الغطاء (الجزء العلوي) من الشريحة المفتوحة لإغلاق النموذج الأولي للشريحة المفتوحة قبل بدء تدفق السوائل.
    2. ماصة 200 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا المنزوعة الغازات (انظر الجداول الخاصة بالأعضاء) في منفذ مدخل كل من القنوات العلوية والسفلية للرقاقة مع الانتباه لتجنب الفقاعات.
    3. ماصة 300 ميكرولتر من وسط الاستزراع في أنابيب الموائع الدقيقة القصيرة لتجهيز السطح الداخلي للأنابيب وتوصيل الأنبوب القصير بمداخل القنوات العلوية والسفلية للرقاقة.
  4. قم بتوصيل وتجهيز أسطح الموائع الدقيقة
    1. ضع الخزانات المتوسطة في رف المزرعة ، وقم بتوصيل الإبرة تحت الجلد بالمدخل السفلي للرقائق ، وأخيرا ، استوعب جميع الرقائق في حامل (ناقلات) الإسكان داخل الحاضنة.
    2. قم بتوصيل الرقائق بالمضخة التمعجية ، ثم افحص جميع الموصلات للتأكد من توصيل جميع الرقائق بشكل صحيح وأنه لا يوجد تسرب مرئي لوسائط زراعة الخلايا.
    3. استخدم زر التطهير الموجود على المضخة واحتفظ به لمدة 15 ثانية تقريبا أو حتى تظهر قطرات وسط زراعة الخلايا في نهاية أنبوب التدفق الخارجي.
    4. استخدم نظام التحكم في المضخة لضبط معدل تدفق رقاقة العضو المناسب (الشكل 2 والشكل 3 والشكل 4 والشكل 5).

7. صيانة الرقائق

  1. صيانة رقاقة الجهاز
    1. تحضير وسط زراعة الخلايا الطازجة للظهارة و / أو البطانة وتنفيذ خطوات التفريغ (كما هو موضح سابقا في الخطوة 6.2).
    2. أوقف المضخة التمعجية مؤقتا ، وافصل الرقائق بعناية عن المضخة ، واستخرج حامل (ناقلات) غلاف الرقاقة. نقل الرقائق من الحاضنة إلى BSC وإزالة حجم الوسائط المتبقية في الخزانات.
    3. استبدل وسائط زراعة الخلايا في خزانات المدخل العلوية والسفلية ب 5 مل من وسائط زراعة الخلايا الطازجة وضع حامل (ناقلات) غلاف الرقائق مرة أخرى في الحاضنة. قم بتوصيل الرقائق بالمضخة التمعجية وأعد تشغيل التدفق.
      ملاحظة: يوصى باستخدام وظيفة التطهير لتحديث الوسط بسرعة إلى حجرة الأوعية الدموية وتقليل خطر حدوث فقاعات هواء.
    4. كرر الخطوات 7.1.1-7.1.3 كل يومين ، كما هو موضح في الشكل 2 والشكل 3 والشكل 4 والشكل 5.
  2. إنشاء واجهة الهواء والسائل (ALI)
    1. أوقف المضخة التمعجية مؤقتا ، وافصل الرقائق بعناية عن المضخة ، واستخرج حامل (ناقلات) غلاف الرقاقة. نقل الرقائق من الحاضنة إلى خزانة السلامة الحيوية ، وإزالة حجم الوسط الأيسر في الخزان العلوي.
    2. قم بسحب كل الوسط برفق من قناة الموائع الدقيقة العلوية وقم بتثبيت أنبوب الموائع الدقيقة القصير المتصل بالمداخل العلوية باستخدام مشابك الموثق لتقليل تبخر الوسائط وصيانة ALI.
    3. ضع الشريحة المفتوحة على حامل (حاملات) الإسكان مرة أخرى في الحاضنة وأعد توصيل الرقائق بالمضخة التمعجية.
      ملاحظة: يوصى باستخدام وظيفة التطهير لتحديث الوسط بسرعة إلى حجرة الأوعية الدموية وتقليل خطر حدوث فقاعات هواء.
    4. استئناف التدفق عن طريق بدء تشغيل المضخة التمعجية.
  3. تمتد (اختياري)
    1. أوقف المضخة التمعجية مؤقتا وقم بتوصيل منافذ تفريغ الرقائق بوحدة التفريغ باستخدام أنبوبين طويلين من الموائع الدقيقة لكل شريحة.
    2. استخدم وحدة التفريغ لضبط إعداد التمدد على الحالة الموصى بها لكل عضو كما هو محدد داخل جداول بروتوكول الجهاز: الجدول التكميلي 1 للبشرة. الجدول التكميلي 2 للحويصلات الهوائية؛ الجدول التكميلي 2 لمجرى الهواء؛ والجدول التكميلي 4 للأمعاء.
    3. افحص توصيلات الأنبوب بصريا للتأكد من توصيل جميع الرقائق بشكل صحيح وعدم وجود قطرات مرئية من التنقيط المتوسط.
    4. استئناف التدفق عن طريق بدء تشغيل المضخة التمعجية.

8. بذر الخلايا البطانية في حجرة الأوعية الدموية

  1. تحضير الخلايا والرقائق لبذر الخلايا الوعائية
    1. استزراع الخلايا البطانية الخاصة بالأنسجة حسب توجيهات مقدمي الخدمة حتى 80٪ -90٪ متقاربة. فصل الخلايا باستخدام إجراء إنزيم محلل للبروتين (على النحو الموصى به من قبل المزود) ، وأخيرا ، أعد تعليق الخلايا البطانية في محلول 3 × 106 خلايا / مل.
      ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج ، احصد الخلايا البطانية عند ممر منخفض (P2-P4) خلال مرحلة النمو النشط عندما تصل إلى التقاء يتراوح بين 70٪ -90٪.
    2. أوقف المضخة التمعجية مؤقتا. انقل الرقائق من الحاضنة إلى BSC ، وافصل الرقائق عن خزانات الوسائط وأي أنابيب متصلة ، ثم قم بتجميع الرقائق في أطباق بتري منفصلة.
    3. قم بتحديث وسط زراعة الخلايا في المقصورة الظهارية بوسط زراعة الخلايا الظهارية الطازجة. شطف قناة الأوعية الدموية مع زراعة خلايا البطانة الطازجة المتوسطة مرتين ، ثم استنشاق الوسط من حجرة الأوعية الدموية.
  2. بذر الخلايا البطانية
    1. قم بزرع القناة السفلية (الوعائية) ب 25 ميكرولتر من تعليق الخلايا البطانية (3 × 106 خلايا / مل) ، واقلب الرقائق رأسا على عقب للسماح للخلايا البطانية بالالتصاق بالسطح العلوي لغرفة الموائع الدقيقة.
      ملاحظة: أضف 50 ميكرولتر من تعليق الخلية لكل شريحة (600 ميكرولتر لكل 12 شريحة).
    2. ضع الرقائق في أطباق بتري. ضعها مرة أخرى في الحاضنة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 ، واترك الخلايا البطانية تلتصق لمدة 1 ساعة.
    3. بعد 1 ساعة ، انقل الرقائق من الحاضنة إلى BSC. شطف قناة الأوعية الدموية مع وسط زراعة الخلايا البطانية مرتين لإزالة الحطام الخلوي.
    4. كرر الخطوات 8.2.1-8.2.2 لزرع القناة الوعائية مرة أخرى بالخلايا البطانية ووضع الرقائق بشكل مسطح لتسهيل التصاق الخلايا البطانية بالسطح السفلي للقناة الوعائية.
  3. أعد توصيل الشريحة بالتدفق
    1. املأ خزان الوسط الوعائي بوسط زراعة الخلايا الوعائية المفرغة تحت BSC.
    2. ضع الرقائق مرة أخرى داخل حامل (حاملات) غلاف الرقائق وأعد توصيل الرقائق بالخزانات المتوسطة في أحد طرفيها بالمضخة التمعجية على الطرف الآخر.
      ملاحظة: يوصى باستخدام وظيفة التطهير لتحديث الوسط بسرعة إلى حجرة الأوعية الدموية وتقليل خطر حدوث فقاعات هواء.
    3. افحص بصريا وصلات الموائع الدقيقة للتأكد من توصيل جميع الرقائق بشكل صحيح وعدم وجود قطرات مرئية من التنقيط المتوسط. بعد ذلك ، استأنف تدفق السوائل عن طريق بدء تشغيل المضخة التمعجية.

9. مقايسات نقطة النهاية الشائعة

  1. افصل الرقائق لفحوصات نقطة النهاية
    1. أوقف المضخة التمعجية مؤقتا ، وافصل الرقائق بعناية عن المضخة ، واستخرج حامل (ناقلات) غلاف الرقاقة. انقل حامل (حاملات) غلاف الرقائق من الحاضنة إلى BSC واضبط الرقائق مجانا.
    2. اغسل برفق الحجرة المركزية للرقاقة المفتوحة باستخدام وسط زراعة الخلايا الظهارية والقناة الوعائية باستخدام وسط زراعة البطانة مرتين لإزالة أي حطام خلوي.
    3. قم بإزالة غطاء الشريحة المفتوحة للوصول إلى المقصورة القمية للشريحة باستخدام الملقط.
  2. تلطيخ مناعي للفحص المجهري الفلوري
    1. تابع تثبيت العينات التقليدية والنفاذية والحظر.
      ملاحظة: في هذه الدراسة ، تم تثبيت العينات في 200 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهايد (PFA) لمدة 1 ساعة متبوعة بالشطف باستخدام PBS ، والنفاذية في 0.1٪ Triton X-100 لمدة 40 دقيقة والحجب في 1٪ من ألبومين مصل الأبقار لمدة 1 ساعة.
    2. احتضان الرقائق بالأجسام المضادة الأولية (جدول المواد) عند 4 درجات مئوية طوال الليل. ثم اغسل كل من المقصورات الظهارية والبطانية للرقائق ب 200 ميكرولتر من PBS مرتين. ثم ، تابع الأجسام المضادة الثانوية المناسبة لمدة 2 ساعة.
      ملاحظة: قم بتخفيف الأجسام المضادة الأولية والأجسام المضادة الثانوية في PBS + 1٪ BSA بتخفيف 1: 100 (الجسم المضاد الأساسي) و 1: 200 (الجسم المضاد الثانوي).
  3. الكيمياء الهيستولوجية المناعية
    1. استخرج المكافئات اللحمية من الغرفة الرئيسية للرقاقة المفتوحة باستخدام ملاقط ، واجمعها في أنبوب سعة 1.5 مل مملوء بالفورمالين المخزن المحايد بنسبة 10٪ واحتضانها لمدة 24 ساعة على الأقل.
    2. انقل المكافئ اللحمي الثابت إلى معالج الأنسجة واتبع الخطوات التالية لتحقيق الجفاف الأمثل للعينة.
      1. اغمر الهيدروجيل في 70٪ إيثانول لمدة 90 دقيقة.
      2. قم بإزالة الإيثانول بنسبة 70٪ واغمر الهيدروجيل في 80٪ إيثانول لمدة 90 دقيقة.
      3. قم بإزالة الإيثانول بنسبة 80٪ واغمر الهيدروجيل في 95٪ إيثانول لمدة 90 دقيقة.
      4. قم بإزالة الإيثانول بنسبة 95٪ واغمر الهيدروجيل في إيثانول 100٪ لمدة 90 دقيقة مرتين.
      5. قم بإزالة الإيثانول بنسبة 100٪ واغمر الهيدروجيل في محلول من الزيلين لمدة 120 دقيقة مرتين.
      6. قم بإزالة محلول الزيلين وتسلل إلى مكافئات اللحمة المعالجة في شمع البارافين لمدة 120 دقيقة (~ 2 ساعة) مرتين.
    3. قم بتضمين مكافئات اللحمة المتسللة في كتل البارافين المقسمة.
    4. في هذه المرحلة ، يمكن تقسيم المكافئات اللحمية ككتل بارافين باستخدام ميكروتوم ومعالجتها وفقا للتقنيات النسيجية التقليدية26.

النتائج

النقش الدقيق السطحي
يمكن استخدام التنميط الدقيق للمصفوفة خارج الخلية (ECM) لتكرار التكوين المكاني لواجهة القبو المعوي. يمكن تعديل تكوين رقاقة Open-Top لدمج الطوابع الدقيقة المصممة خصيصا لتقليد التضاريس الطبيعية لواجهة سدى ظهارة القولون (الشكل 6A ، B) والخباي...

Discussion

تمثل رقاقة Open-Top منصة تمكينية للتحقيق في التفاعل الخلوي المعقد الذي يحدث بين البطانة والسدى والظهارة في بيئة دقيقة خاضعة للرقابة ، في الوقت الفعلي. توفر هذه التقنية مزايا حاسمة على الثقافات العضوية والعضوية التقليدية ، مثل دمج الإشارات الفيزيائية والكيميائية الحيوية ذات الصلة بإعادة تكو...

Disclosures

يعلن المؤلفون عن المصالح المالية / العلاقات الشخصية التالية ، والتي يمكن اعتبارها مصالح متنافسة محتملة: فارون أنطونيو هو موظف سابق في شركة Emulate Inc. وقد يمتلك حصة في الأسهم في Emulate.

Acknowledgements

اي

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
10x EMEM Lonza12-684FMedium; Stroma
18 Gauge needleMicroGroup316H18RWTube stainless steel 316 welded, 18RW Full Hard 
19 Gauge needleMicroGroup316H19RWTube stainless steel 316 welded, 19RW Full Hard
2-Stop PharMed BPT Cole-Palmer EW-95723-12Tube, 0.25 mm, 12/pack
70% ethanol and wipes  -  - For surface sterilization 
8-Bromoadenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt (8-Br-cAMP)SigmaB7880Medium supplement 
A-83-01 Tocris 2939
AdenineSigmaA9795
Advanced DMEM/F12 Thermo12634010
Airway Epithelial CellsLifeline Cell TechnologyFC-0016
Aluminum foil  -  -  -
Alveolar cellsCell BiologicsH6621
Anti-ABCA3  ABCAM ab24751 Mouse monoclonal antibody [3C9] 
Anti-Aquaporin5 Alexa Fluor 647 ABCAM ab215225  Rabbit monoclonal antibody [EPR3747]  
Anti-Aquaporin5 ABCAM ab92320 Rabbit monoclonal antibody [EPR3747] 
Anti-beta IV Tubulin  ABCAM ab11315 Mouse monoclonal antibody [ONS.1A6] 
Anti-CD31 (PECAM-1) ABCAM ab9498 Mouse monoclonal [JC/70A] antibody  
Anti-CK5  ABCAM ab75869 Rabbit recombinant monoclonal [AY1E6] 
Anti-Cytokeratin 10  ThermoFisher MA5-13705 Mouse monoclonal antibody (DE-K10) 
Anti-Cytokeratin 14  ABCAM ab7800 Mouse monoclonal antibody 
Anti-E-Cadherin  ABCAM ab1416  Mouse monoclonal antibody 
Anti-Filaggrin  ThermoFisher PA5-79267 Rabbit polyclonal antibody  
Anti-HTI-56 Terrace Biotech TB-29AHT1-56  Mouse monoclonal antibody (IgG1) 
Anti-HTII-280 Terrace Biotech TB-27AHT2-280 Mouse monoclonal antibody (IgM) 
Anti-Involucrin  ThermoFisher MA5-11803 Mouse monoclonal antibody (SY5) 
Anti-Isoforms TA p63-α, -β, -γ  Biolengend 618902 Rabbit polyclonal antibody  
Anti-Ki67  ABCAM ab8191 Mouse monoclonal antibody [B126.1] 
Anti-LAMP3  ABCAM ab111090 Rabbit polyclonal antibody 
Anti-Mature SP-B Seven Hill WRAB-48604 Rabbit polyclonal antibody 
Anti-MUC5AC  ThermoFisher PA5-34612 Rabbit polyclonal antibody  
Anti-Mucin-2 SantaCruz Biotechnologysc-7314Mouse monoclonal antibody (IgG1) 
Anti-p63  Dako GA662 Mouse monoclonal antibody p63 Protein (Dako Omnis) Clone DAK-p63 
Anti-PCNA  ThermoFisher PA5-32541 Rabbit polyclonal antibody  
Anti-Podoplanin (AT-1α)  ABCAM ab128994 Rabbit polyclonal antibody 
Anti-Pro + Mature Surfactant Protein B ABCAM ab40876 Rabbit polyclonal antibody 
Anti-Surfactant C   Seven Hill  WRAB-9337  Rabbit polyclonal antibody 
Anti-Uteroglobin/SCGB1A1 Hycult Biotech HM2178 Mouse monoclonal antibody [AY1E6] 
Anti-VE-cadherin  ABCAM ab33168 Rabbit polyclonal antibody  
Anti-ZO-1  ThermoFisher 33-9100 Mouse monoclonal antibody [1A12] 
Ascorbic acidSigmaA4544
Aspirating pipettes Corning / Falcon 357558 2 mL, polystyrene, individually wrapped 
Aspirating tips  -  - Sterile (autoclaved) 
B27Thermo17504044
Blocker BSA (10X) in PBS solution  ThermoFisher 37525 Blocker agent 
Calcium ChlorideSigmaC7902
CHIR 99021Tocris4423
Collagen IAdvanced Biomatrix513310 mg/mL (Stroma)
Collagen I Advanced BioMatrix50053 mg/mL (Vascular ECM)
Collagen IVSigma C5533
Collagen-IVSigma C5533-5MG Collagen from human placenta, 5 mg powder, reconstitute to 1 mg/mL 
Colonic Fibroblasts Cell Biologics H6231
Colonic microvascular endothelial cells Cell BiologicsH6203 
Conical tubes   -  - 15 mL and 50 mL polypropylene, sterile 
Crosslinker (ER-1) Emulate 104615 mg powder 
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)  ThermoFisher D3571 DNA probe 
Dermal fibroblastsATCCPCS-201-010
Dermal microvascular endothelial cellsATCCCRL-3243
DexamethasoneSigmaD4902
DMEMThermoFisher11054020
DMEM/F-12 GIBCO 11320082
DMEM/F-12, GlutaMAX  GIBCO 10565-018 Basal medium for ALI medium 
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488)  ABCAM ab150105 Donkey Anti-Mouse secondary antibody  
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 568)  ABCAM ab175472 Donkey Anti-Mouse secondary antibody 
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647)  ABCAM ab150107 Donkey Anti-Mouse secondary antibody 
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488)  ABCAM  ab150073 Donkey Anti-Mouse secondary antibody 
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 568)  ABCAM ab175470 Donkey Anti-Mouse secondary antibody 
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 647)  ABCAM ab150075 Donkey Anti-Mouse secondary antibody 
Dulbecco’s PBS (DPBS-/-) (without Ca2+, Mg2+) Corning 21-031-CV 1x 
Epidermal Growth Factor (EGF) human, recombinant in E. coliPromoCellC-60170Medium supplement 
F-12 Ham’sInvitrogen 21700-108For vascular ECM
FibriCol Advanced BioMatrix 5133-20ML Collagen-I solution (10 mg/mL)
FibronectinCorning356008
Fibronectin, Human, Natural,  Corning 47743-654 human plasma fibronectin 
Fine-tip precision tweezers Aven18056USA Technik Style 5B-SA Precision Stainless Steel Tweezers
GlutamaxInvitrogen 21700-108
Glutamax Invitrogen 35050061
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 594)  ABCAM ab150080 Goat Anti-Mouse secondary antibody  
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647)  ABCAM ab150115 Goat Anti-Mouse secondary antibody  
Goat Anti-Mouse IgG H&L (FITC)  ABCAM ab6785 Goat Anti-Mouse secondary antibody  
Goat Anti-Mouse IgG1 Alexa Fluor 568  ThermoFisher A-21124 Goat Anti-Mouse IgG1 secondary antibody 
Goat Anti-Mouse IgM Alexa Fluor 488  ThermoFisher A-21042 Goat Anti-Mouse IgM secondary antibody 
Handheld vacuum aspirator Corning 4930  - 
Heat Inactivated HyClone FetalClone II Serum (FCS) GE Healthcare Life SciencesSH30066.03
Hemocytometer  -  - - 
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosaSigmaH3149
HEPESThermo15630080
Human [Leu15] - Gastrin SigmaG9145
Human colonoidsObtained from clinical resectionsObtained from clinical resections
Human EGF Recombinant Protein ThermoPHG0311L
human epithelial growth factor Thermo PHG0311
HyClone FetalClone II Serum (U.S.)  GE Healthcare SH30066.02HI  Sterile FBS heat-inactivated 
Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium saltSigmaH4881
Hydrocortisone PromoCell  C-64420 Medium supplement  
Ice bucket  -  -  - 
Ismatec IPC-N Cole-PalmerEW-78000-41Low-Speed Digital Peristaltic Pump; q24-Channel (1 per 12 Chips)
ITESBioWhittaker17-839Z
Keratinocyte Growth Factor (KGF), also known as Basic Fibroblast Growth Factor 7 (FGF-7), human, recombinant in HEKPromoCellC-63821
KeratinocytesATCCPCS-200-010
Laminin BiolaminaCT521-0501 
Laminin, 521 CTG (CT521) Biolamina  CT521-0501 human recombinant laminin 521    
Lung FibroblastCell BiologicsH6013
Lung FibroblastLifeline Cell TechnologyFC-0049
Lung microvascular endothelial cellsLonzaCC-2527
Lung smooth muscle cellsLifeline Cell TechnologyFC-0046
Manual counter  -  -  -
Masterflex (TPE) Transfer Tubing Cole-PalmerFV-96880-02PharMed BPT, 1/32" ID x 5/32" OD
Medium 199, no phenol redThermo 11043023
Microcentrifuge tube  -   -  1.5 mL, sterile 
Microscope (with camera)  -  - For bright-field imaging 
N2Sigma17502001
N-acetyl cysteineSigmaA5099
Noggin (HEK293T conditioned medium)SigmaN17001
Normal Goat Serum  ThermoFisher 50062Z Blocking solution  
O-phosphosrylethanolamine SigmaP0503
Paraformaldehyde (4% wt/vol)  EMS 15710 Fixing agent 
Penicillin StreptomycinGIBCO15140122
Penicillin-streptomycin Sigma P4333 10,000 U/mL; 10 mg/mL 
Pipette tips   -  - P20, P200, and P1000 sterile, low adhesion
Pipette Gilson  F167380 P20, P200, and P1000 
PluriQ Serum Replacement (or alternatively KO Serum replacement)AMSBIO (or Thermo)N/A (or C1910828010)
Poly-L-Lysine coated microscope glass slides  Sigma P0425 Glass slides 
PrimocinInvivoGenant-pm-1
ProgesteroneSigmaP8783
ProLong Gold  ThermoFisher P36931 Antifade Mountant with DAPI 
Retinoic Acid SigmaR2625
ROCK inhibitor (Y27632)TocrisTB1254-GMP/10
R-spondin (HEK293T conditioned medium)SigmaSCC111
SAGM SingleQuots supplements LonzaCC-4124
SAGMTM Small Airway Epithelial Cell Growth medium BulletKitTM Lonza CC-4124 Medium supplements 
SB2001190 Tocris 1264/10
Serological pipettes  -  - 2 mL, 5 mL, 10 mL, and 25 mL low endotoxin, sterile 
Small Airway Epithelial Cell Growth medium (SAGM)Lonza CC-4124 
Solvent Buffer (ER-2) Emulate 1046225 mL bottle 
Steriflip-HV MilliporeSE1M003M00Sterile filtering conical tube
Sterilin 100 mm Square Petri DishesThermo103Sterile, 1 per 6 chips 
T25 flasks  -  -  -
T75 flasks  -  -  - 
Tri-iodothyronineSigmaT5516
Triton X-100 (0.3% (vol/vol)  Sigma T8787 Permeabilization agent 
Trypan blue Sigma 93595 0.4% solution 
TrypEE solution Sigma 12604013 Cell detaching solution 
TWEEN-20 Sigma P2287 Permeabilization agent 
UV Light Oven (peak frequency 365nm, intensity of 100 µJ/cm2)VWR21474-598UVP, Long Range UV, 365 nm 60Hz Model CL-1000L
Vacuum set-up  -  - Minimum pressure: -70 kPa 
Vascular Endothelial Growth Factor 165 (VEGF-165) human, recombinant in E. coliPromoCellC-64420
VEGF-165  PromoCell  C-64420 Medium supplement 
Von Willebrand Factor conjugated FITC  ABCAM ab8822 Sheep polyclonal antibody 
Water bath (or beads)  -  - Set to 37 °C 
Wnt3A (L-Wnt3A conditioned medium)ATCCCRL-2647

References

  1. Van Norman, G. A. Limitations of animal studies for predicting toxicity in clinical trials: Is it time to rethink our current approach. JACC: Basic to Translational Science. 4 (7), 845-854 (2019).
  2. Wange, R. L., Brown, P. C., Davis-Bruno, K. L. Implementation of the principles of the 3Rs of animal testing at CDER: Past, present and future. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 123, 104953 (2021).
  3. Mosig, A. S. Organ-on-chip models: New opportunities for biomedical research. Future Science OA. 3 (2), (2017).
  4. Alépée, N., et al. State-of-the-art of 3D cultures (organs-on-a-chip) in safety testing and pathophysiology. Altex. 31 (4), 441-477 (2014).
  5. MacArron, R., et al. Impact of high-throughput screening in biomedical research. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (3), 188-195 (2011).
  6. Hughes, J. P., Rees, S. S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L. Principles of early drug discovery. British Journal of Pharmacology. 162 (6), 1239-1249 (2011).
  7. Kitaeva, K. V., Rutland, C. S., Rizvanov, A. A., Solovyeva, V. V. Cell culture based in vitro test systems for anticancer drug screening. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 322 (2020).
  8. Mao, P., et al. Human alveolar epithelial type II cells in primary culture. Physiological Reports. 3 (2), 12288 (2015).
  9. Zaitseva, M., Vollenhoven, B. J., Rogers, P. A. W. In vitro culture significantly alters gene expression profiles and reduces differences between myometrial and fibroid smooth muscle cells. Molecular Human Reproduction. 12 (3), 187-207 (2006).
  10. Singh, A., Brito, I., Lammerding, J. Beyond tissue stiffness and bioadhesivity: Advanced biomaterials to model tumor microenvironments and drug resistance. Trends in Cancer. 4 (4), 281-291 (2018).
  11. Nawroth, J. C., et al. Stem cell-based Lung-on-Chips: The best of both worlds. Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 12-32 (2019).
  12. Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2d to 3d cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).
  13. Kapałczyńska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
  14. Sutherland, R. M., Inch, W. R., McCredie, J. A., Kruuv, J. A multi-component radiation survival curve using an in vitro tumour model. International Journal of Radiation Biology. 18 (5), 491-495 (1970).
  15. Chandra, P., Lee, S. J. Synthetic extracellular microenvironment for modulating stem cell behaviors. Biomarker Insights. 10, 105-116 (2015).
  16. Nicolas, J., et al. 3D extracellular matrix mimics: Fundamental concepts and role of materials chemistry to influence stem cell fate. Biomacromolecules. 21 (6), 1968-1994 (2020).
  17. Brassard, J. A., Lutolf, M. P. Engineering stem cell self-organization to build better organoids. Cell Stem Cell. 24 (6), 860-876 (2019).
  18. Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. Designing materials to direct stem-cell fate. Nature. 462 (7272), 433-441 (2009).
  19. Mantha, S., et al. Smart hydrogels in tissue engineering and regenerative medicine. Materials. 12 (20), 3323 (2019).
  20. Langhans, S. A. Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning. Frontiers in Pharmacology. 9, 6 (2018).
  21. Li, H., et al. Biomechanical cues as master regulators of hematopoietic stem cell fate. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (16), 5881-5902 (2021).
  22. Donoghue, L., Nguyen, K. T., Graham, C., Sethu, P. Tissue chips and microphysiological systems for disease modeling and drug testing. Micromachines. 12 (2), 139 (2021).
  23. Ma, C., Peng, Y., Li, H., Chen, W. Organ-on-a-chip: A new paradigm for drug development. Trends in Pharmacological Sciences. 42 (2), 119-133 (2021).
  24. Varone, A., et al. A novel organ-chip system emulates three-dimensional architecture of the human epithelia and the mechanical forces acting on it. Biomaterials. 275, 120957 (2021).
  25. Hassell, B. A., et al. Human organ chip models recapitulate orthotopic lung cancer growth, therapeutic responses, and tumor dormancy in vitro. Cell Reports. 21 (2), 508-516 (2017).
  26. Sadeghipour, A., Babaheidarian, P. Making formalin-fixed, paraffin embedded blocks. Biobanking. 1897, 253-268 (2019).
  27. Grant, J., et al. Simulating drug concentrations in PDMS microfluidic organ chips. Lab on a Chip. 21 (18), 3509-3519 (2021).
  28. Barrile, R., et al. Organ-on-chip recapitulates thrombosis Induced by an anti-CD154 monoclonal antibody: Translational potential of advanced microengineered systems. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 104 (6), 1240-1248 (2018).
  29. Jain, A., et al. Primary human lung alveolus-on-a-chip model of intravascular thrombosis for assessment of therapeutics. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 103 (2), 332-340 (2018).
  30. Campbell, S. B., Wu, Q., Yazbeck, J., Liu, C., Okhovatian, S., Radisic, M. Beyond polydimethylsiloxane: Alternative materials for fabrication of organ-on-a-chip devices and microphysiological systems. ACS Biomaterials Science and Engineering. 7 (7), 2880-2899 (2021).
  31. Pun, S., Haney, L. C., Barrile, R. Modelling human physiology on-chip: Historical perspectives and future directions. Micromachines. 12 (10), 1250 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 192

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved