Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את היכולות ואת אופני התרבית החיוניים של שבב האיברים הפתוח להקמה והבשלה מוצלחת של תרביות איבר-על-שבב בעובי מלא של רקמות ראשוניות (עור, נאדיות, דרכי נשימה ומעי), ומספק הזדמנות לחקור היבטים תפקודיים שונים של ממשק נישה אפיתל/מזנכימלי וכלי דם אנושי במבחנה.

Abstract

כמעט כל האיברים האנושיים מרופדים ברקמות אפיתל, המורכבות משכבה אחת או יותר של תאים מחוברים היטב המאורגנים במבנים תלת-ממדיים (תלת-ממדיים). אחד התפקידים העיקריים של אפיתליה הוא היווצרות של מחסומים המגנים על רקמות קו תחתון מפני עלבונות פיזיים וכימיים וסוכנים זיהומיים. בנוסף, אפיתליה מתווכת את ההובלה של חומרים מזינים, הורמונים ומולקולות איתות אחרות, ולעתים קרובות יוצרת שיפועים ביוכימיים המנחים את מיקום התאים ומידור בתוך האיבר. בשל תפקידם המרכזי בקביעת מבנה האיברים ותפקודם, אפיתליה היא מטרה טיפולית חשובה למחלות אנושיות רבות שלא תמיד נלכדות על ידי מודלים של בעלי חיים. מלבד ההבדלים הברורים בין מינים למינים, ביצוע מחקרים על תפקוד מחסום ותכונות הובלה של אפיתליה בבעלי חיים מחמיר עוד יותר על ידי הקושי לגשת לרקמות אלה במערכת חיה. בעוד תרביות תאים אנושיים דו-ממדיות (דו-ממדיות) שימושיות למענה על שאלות מדעיות בסיסיות, לעתים קרובות הן מניבות תחזיות גרועות in vivo . כדי להתגבר על מגבלות אלה, בעשור האחרון, שפע של פלטפורמות ביומימטיות מיקרו-מהונדסות, הידועות בשם איברים על שבב, התגלו כחלופה מבטיחה לניסויים מסורתיים במבחנה ובבעלי חיים. במאמר זה אנו מתארים שבב איברים פתוח (או Open-Top Chip), פלטפורמה המיועדת למידול רקמות אפיתל ספציפיות לאיברים, כולל העור, הריאות והמעיים. שבב זה מציע הזדמנויות חדשות לבנייה מחדש של הארכיטקטורה והתפקוד הרב-תאיים של רקמות אפיתל, כולל היכולת ליצור מחדש רכיב סטרומה תלת-ממדי על ידי שילוב פיברובלסטים ספציפיים לרקמות ותאי אנדותל בתוך מערכת פעילה מכנית. שבב פתוח זה מספק כלי חסר תקדים לחקר אינטראקציות אפיתל/מזנכימליות וכלי דם בסקאלות רזולוציה מרובות, מתאים בודדים ועד מבנים רקמתיים רב-שכבתיים, ובכך מאפשר דיסקציה מולקולרית של הדיבור הבין-תאי של איברים אפיתליאליים בבריאות ובחולי.

Introduction

מבחינה היסטורית, מדענים הסתמכו על ניסויים פרה-קליניים בבעלי חיים לצורך גילוי תרופות, אך מספר גדל והולך של שיטות אלה הוטלו בספק בגלל מתאם גרוע עם תוצאות אנושיות1. יישום עקרונות "3Rs" להחלפה, הפחתה ושכלול של ניסויים בבעלי חיים דוחק במדענים למצוא שיטות חלופיות חדשות במבחנה לתמיכה בהערכת סיכונים פרה-קליניים של תרופות וטוקסיקולוגיה כימית2. עם זאת, מודלים רבים במבחנה שפותחו עד כה חסרים את הארכיטקטורה הביולוגית, המורכבות התאית והסביבה המכנית הנחוצות כדי לשחזר את הטבע הדינמי של איברים חיים אנושיים 3,4.

מערכות פרה-קליניות קונבנציונליות במבחנה משתמשות בדרך כלל במונוקולטורה דו-ממדית של תאים אנושיים הגדלים על משטח פלסטיק קשיח. שיטות אלה מספקות כלי לביצוע מחקרים מכניסטיים פשוטים ומאפשרות סינון מהיר של מועמדים לתרופה. בשל עלותם הנמוכה יחסית וחוסנם הגבוה, מודלים דו-ממדיים משויכים לעתים קרובות למערכות אוטומטיות בעלות תפוקה גבוהה ומשמשים לזיהוי מהיר של מועמדים פוטנציאליים לתרופות בשלב המוקדם של תהליך פיתוח התרופה 5,6. עם זאת, מודלים דו-ממדיים כאלה אינם מספקים גישה תרגומית למידול תגובות ברמת הרקמה, ברמת האיבר או ברמת המערכת למועמדים טיפוליים, הדרושה לחיזוי מדויק של בטיחות ויעילות התרופות בשלב הפרה-קליני של פיתוחן. תרביות תאים שטוחות אינן משחזרות את המיקרו-סביבה הטבעית של הרקמה, כולל יחסי הגומלין הרב-תאיים המורכבים, התכונות הביומכניות והארכיטקטורה התלת-ממדית (תלת-ממדית) של רקמות אנושיות7. תאים הגדלים על משטח שטוח לעתים קרובות אינם רוכשים פנוטיפ בוגר, ולכן אינם יכולים להגיב לגירויים פרמקולוגיים כפי שהיו מגיבים ברקמה הטבעית. לדוגמה, תאי אפיתל מכתשית אנושיים ראשוניים הגדלים במבחנה מציגים פנוטיפ קשקשי ומאבדים סמנים פנוטיפיים מרכזיים, כולל חלבונים פעילי שטח C ו- B (SP-C ו- SP-B)8. בנוסף להתמיינות לא מספקת, תאים ראשוניים הופכים לעתים קרובות לבלתי רגישים לגורמי עקה ביולוגיים במבחנה, כאשר מסלולים ביוכימיים מסוימים הקשורים לדלקת רקמות הופכים ללא פונקציונליים9. נראה כי אובדן כזה של תפקוד התא קשור בעיקר לשימוש במצעים נוקשים, כמו גם להיעדר גורמים מסיסים המשוחררים באופן טבעי על ידי תאי סטרומה ספציפיים לרקמות כגון פיברובלסטים של ריאות ותאי שריר חלק10,11.

ההבנה כי היעדר מורכבות כימו-פיזיקלית וביולוגית מגבילה את ההתנהגות הפיזיולוגית של תאים במבחנה עודדה פיתוח מודלים רב-תאיים מתוחכמים יותר, שהוכחו כלוכדים טוב יותר את המורכבות של רקמות אנושיות מחוץ לגוף12,13. מאז יצירת המודלים הראשונים של תרביות משותפות בתחילת שנות השבעים14, הכנסת הידרוג'לים סינתטיים וטבעיים שיפרה באופן משמעותי את היכולת לחקות מיקרו-סביבות רקמה טבעיות והפכה לכלי רב ערך להנעת התמיינות תאית, הנחיית הארגון העצמי של תאים למבנים דמויי רקמות, ושיקום תפקודי רקמה מקומיים15,16. לדוגמה, כאשר הם גדלים בפיגום התלת-ממדי המתאים, תאים אנושיים יכולים להתארגן בעצמם למבנים פונקציונליים כגון ספרואידים או אורגנואידים, המבטאים סמנים של תאי גזע, והם מסוגלים להתחדשות עצמית17. לעומת זאת, תאים אנושיים (כולל תאי גזע), כאשר הם גדלים על מצעים דו-ממדיים מסורתיים, מזדקנים במהירות ועוברים הזדקנות לאחר כמה מעברים18. בנוסף, ניתן "לתפור" הידרוג'לים כך שיתאימו לתכונות רקמה ספציפיות כגון נקבוביות, גודל נקבוביות, עובי סיבים, צמיגות, טופוגרפיה ונוקשות, או להנדס אותם עם רכיבים תאיים שמקורם ברקמה ו/או מולקולות ביו-אקטיביות המאפשרות חיקוי של מצבים פיזיולוגיים או פתולוגיים19,20. למרות הפוטנציאל העצום שלהם לבדיקות תרופות, מודלים מבוססי הידרוג'ל תלת-ממדיים המשמשים במחקר פרמצבטי אינם משחזרים באופן מלא את הציטוארכיטקטורה המורכבת של רקמות in vivo וחסרים גירויים המודינמיים ומכניים חשובים הקיימים בדרך כלל בגוף האדם, כולל לחץ הידרוסטטי, מתיחה מחזורית וגזירת נוזלים21.

מערכות מיקרופיזיולוגיות (MPS) כגון איברים על שבבים (OOCs) התפתחו לאחרונה ככלים המסוגלים ללכוד תגובות פיזיולוגיות מורכבות במבחנה22,23. מודלים אלה משתמשים לעתים קרובות בפלטפורמות מיקרופלואידיות, המאפשרות מידול של מיקרו-סביבה דינמית של איברים חיים.

שילבנו את העקרונות של ביו-הנדסה תלת-ממדית של רקמות ומכנוביולוגיה כדי ליצור מודל של שבב פתוח של רקמת אפיתל אנושית מורכבת. זה איפשר לנו לשחזר מקרוב את המיקרו-סביבה הרב-תאית והדינמית של רקמות אפיתל. זה כולל רמזים ביוכימיים וביומכניים ספציפיים לרקמות הקיימים באופן טבעי באיברים חיים, אך לעתים קרובות מוזנחים על ידי מודלים מסורתיים במבחנה 24. השבב הפתוח משלב שני תאים: תא כלי דם (איור 1A) ותא סטרומה (איור 1B) המופרדים על-ידי קרום נקבובי, מה שמאפשר פיזור חומרי מזון בין שני החדרים (איור 1C). תא כלי הדם חשוף לזרימת נוזלים רציפה כדי לשחזר לחץ גזירה פיזיולוגי, בעוד העיצוב הנמתח של תא הסטרומה מאפשר מידול של המתח המכני הקשור לתנועות נשימה או פריסטליס מעיים. תא הסטרומה מכיל את פיגום ההידרוג'ל התלת-ממדי הניתן להתאמה שנועד לתמוך בצמיחה פיזיולוגית של פיברובלסטים ספציפיים לרקמות. יש לו מכסה נשלף המאפשר הקמת ממשק אוויר-נוזל, מצב המאפשר חיקוי גדול יותר של הפיזיולוגיה האנושית של רקמות הרירית, כמו גם גישה ישירה לרקמה לניהול תרופות ישירות על שכבת האפיתל. איור משלים 1 לוכד כמה ממרכיבי המפתח של תכנון השבב הפתוח, כולל ממדים ותאים ביולוגיים (איור משלים 1A-D), כמו גם את השלבים הטכניים העיקריים המתוארים בפרוטוקול זה (איור משלים 1E).

זילוח של השבב הפתוח מושג באמצעות משאבה פריסטלטית ניתנת לתכנות (איור 1D). מערך המשאבה הפריסטלטית מאפשר לחורר 12 שבבים פתוחים בו זמנית. רוב החממות יכולות לאכלס שני מערכים המאפשרים תרבות של עד 24 שבבים לכל אינקובטור. מתיחה מכנית מושגת באמצעות וסת לחץ ואקום הניתן לתכנות בהתאמה אישית (איור 1E). הוא מורכב מווסת ואקום אלקטרו-פנאומטי הנשלט אלקטרונית על ידי ממיר דיגיטלי לאנלוגי. במילים אחרות, וסת הוואקום האלקטרו-פנאומטי מייצר פרופיל ואקום סינוסואידלי עם משרעת ותדירות שנקבעת על ידי המשתמש. זן מחזורי הנע בין 0% ל -15% נוצר על ידי הפעלת לחץ שלילי על ערוץ הריק של השבב הפתוח באמפליטודה הנעה בין 0 ל -90 kPa ותדר של 0.2 הרץ. זוהי מערכת מותאמת אישית המקבילה ליחידת המתח Flexcell הזמינה מסחרית שאומצה בעבר ותוארה במאמרים אחרים25. כדי לחקות את עיוות הרקמה המכנית הקשורים, למשל, לתנועת הנשימה של הריאה או לפריסטלטיקה של המעי, המפעיל הפנאומטי מפעיל גלי ואקום/מתח סינוסואידים שניתן להתאים את גודלם ואת המשרעת שלהם לרמה הפיזיולוגית של מאמץ ותדירות שתאים אנושיים חווים ברקמה הטבעית שלהם.

כאן, אנו מתארים שיטה יעילה וניתנת לשחזור להנדסה וטיפוח של אפיתל אורגנוטיפי שווה ערך על פלטפורמת אב טיפוס של שבב פתוח. הוא מאפשר יצירת מודלים מורכבים של איברים כגון עור, נאדיות, דרכי נשימה ומעי גס תוך שילוב זרימת נוזל כלי דם ומתיחה מכנית. נתאר היבטים טכניים מרכזיים שיש לקחת בחשבון תוך יישום עקרונות של הנדסת רקמות ליצירת מודלים אפיתליאליים מורכבים. נדון ביתרונות ובמגבלות האפשריות של העיצוב הנוכחי.

סקירה כללית של השלבים העיקריים המשמשים להשגת הבשלת רקמות ואיברים, כולל פרמטרים של זרימה ומתיחה, מדווחת ב: איור 2 עבור העור, איור 3 עבור הנאדיות, איור 4 עבור דרכי הנשימה ואיור 5 עבור המעי. מידע נוסף על הרכב המדיה וריאגנטים המשמשים לגידול דגמי האיברים השונים כלולים בטבלאות המשלימות (טבלה משלימה 1 לעור; טבלה משלימה 2 עבור alveolus; טבלה משלימה 3 לדרכי הנשימה, וטבלה משלימה 4 למעי).

Protocol

קולונואידים אנושיים התקבלו מכריתות מעיים בהתאם להנחיות הוועדה המוסדית לבטיחות ביולוגית של בית החולים לילדים בסינסינטי (IBC 2017-2011).

1. הפעלת פני השטח

  1. הכנת מאגר הפעלה
    1. הניחו את הקרוסלינקר ואת ריאגנטי החיץ הממס מתחת לארון הבטיחות הביולוגית (BSC) ותנו להם להתאזן בטמפרטורת החדר (RT) למשך 10 דקות לפני השימוש.
    2. הרכיבו מחדש 5 מ"ג של קרוסלינקר ב-5 מ"ל של חיץ הממס באמצעות מיכל סטרילי אטום לאור או צינור חרוטי שקוף בנפח 15 מ"ל עטוף ברדיד אלומיניום כדי להגן על תמיסת הקרוסלינקר מפני חשיפה ישירה לאור.
    3. מערבול את התמיסה במשך דקה אחת כדי להסיר את כל הגושים, ולאחר מכן פיפטה 50 μL של פתרון crosslinker ישירות לתוך הערוץ התחתון של השבב ו 150 μL לתוך החדר העליון.
    4. הסר כל עודף של פתרון crosslinking מפני השטח של השבב באמצעות אספירטור. לאחר מכן פיפטה נוספת 50 μL של תמיסת crosslinking ישירות לתוך הערוץ התחתון של השבב ו 150 μL לתוך התא העליון הפתוח כדי להסיר כל בועת אוויר שנותרה.
  2. הפעלה עם מכונת crosslinking UV
    1. הסר בעדינות את המכסה מהשבב מתחת ל- BSC ואחסן אותו במיכל סטרילי.
    2. מעבירים את הצ'יפס המכיל את תמיסת הקרוסלינקר לצלחת פטרי, סוגרים את צלחת הפטרי כדי למנוע זיהום, ומניחים את הצלחת עם הצ'יפס מתחת למכונת הקרוסלינקינג UV.
      הערה: הסירו את מכסה צלחת הפטרי כדי למקסם את החשיפה לקרינת UV.
    3. הגדר את מכונת הקישור UV עם אורך גל שיא של 365 ננומטר בעוצמה של 100 μJ / cm2, והפעל את אור UV למשך 20 דקות.
      הערה: לאחר 20 דקות של טיפול UV, פתרון crosslinker ייראה כהה יותר (חום).
    4. החזירו את השבבים מתחת ל-BSC ושאפו את תמיסת הקרוסלינקר המחומצנת. לאחר מכן, שטפו את כל השבבים שלוש פעמים עם מאגר הממס ותנו לשבבים להתייבש מתחת ל-BSC במשך 5-10 דקות כדי להשלים את התפקוד הכימי של משטח הפולידימתילסילוקסאן (PDMS).

2. הכנת המקבילה סטרומה

  1. הכנת חיץ שחזור 10x (100 מ"ל)
    1. להמיס 2.2 גרם של סודיום ביקרבונט ב 75 מ"ל של 0.067 M NaOH במים מזוקקים כפול.
    2. מוסיפים 4.76 גרם HEPES ומביאים את הנפח ל -100 מ"ל באמצעות מים מזוקקים כפולים.
    3. מסננים סטריליים את התמיסה מתחת ל-BSC באמצעות פילטר חד פעמי סטרילי מבקבוק עם קרום של 0.22 מיקרומטר.
      הערה: התמיסה יציבה למשך כ-6 חודשים כאשר היא מאוחסנת ב-4°C.
  2. הערכת נפח תמיסת הפרה-ג'ל
    1. הכפל את מספר השבבים הדרושים לניסוי ב- 150 μL (נפח פנימי של התא הפתוח המרכזי) כדי להעריך את כמות תמיסת הפרה-ג'ל הדרושה לניסוי:
      נפח הדרוש = (מספר שבבים x 150) μL
    2. הכינו את תמיסת קדם-ג'ל הקולגן על קרח על ידי ערבוב: נפח אחד של 10x EMEM המכיל את התאים הנבחרים, נפח אחד של חיץ שחזור 10x (ראה שלב 2.1), 8 כרכים של תמיסת קולגן I (10 מ"ג/מ"ל) ו-1 μL של תמיסת 1 N NaOH עבור כל מ"ג קולגן I.
      הערה: מומלץ להכין נפח נוסף +15% כדי לקחת בחשבון שגיאות ניסוי; הדוגמה המתוארת בסעיף 2.2 מספקת הליך מפורט שלב אחר שלב להכנת תמיסת קדם-ג'ל מספקת עבור 12 שבבים ונפח נוסף של 15%.
  3. הכנת תמיסת פרה-ג'ל למקבילה סטרומה (ל-12 שבבים)
    1. הבא את הפתרונות הבאים תחת BSC על קרח: 10x EMEM; 10x מאגר שחזור (ראה שלב 2.1); תמיסת קולגן I (10 מ"ג/מ"ל); ותמיסת NaOH סטרילית 1 N.
    2. תרבית תאים מזנכימליים ספציפיים לרקמה לפי הוראות הספקים עד למפגש של 80%-90%, ולאחר מכן מנתקים את התאים באמצעות טריפסין או שיטות אחרות לפי המלצת ספק התא. לאסוף את התאים בגלולה על ידי צנטריפוגה ב 250 x גרם במשך 5 דקות ב 24 ° C.
    3. השהה מחדש את גלולת התא ב- 225 μL של EMEM 10x קר כקרח, והוסף 225 μL של חיץ שחזור 10x קר כקרח (ראה שלב 2.1). ערבבו את התמיסה בעדינות מעלה ומטה, ולאחר מכן הוסיפו 1,800 מיקרוליטר של תמיסת קולגן I קרה כקרח.
    4. פיפטה למעלה ולמטה 5-6 פעמים, הימנעות בועות כדי לערבב את תמיסת טרום ג'ל בזמן על קרח.
  4. שילוב של שווה ערך סטרומה על שבב (עבור 12 שבבים)
    1. נטרל את תמיסת הפרה-ג'ל עם 18 μL של 1 N NaOH. מערבבים בעדינות על ידי פיפטציה למעלה ולמטה 5-6 פעמים, ולאחר מכן פיפטה 150 μL של הידרוג'ל עמוס תאים לתוך התא המרכזי של השבב הפתוח כדי למנוע בועות.
      הערה: אם נדרש מיקרו-דפוס, עבור לשלב הבא (סעיף 3).
    2. קבצו את הצ'יפס לצלחות פטרי נפרדות, כולל מכסה צינור צנטריפוגה מלא ב-2 מ"ל של ddH 2 O סטרילי בכל צלחת פטרי, ודגרו על צלחות הפטרי באינקובטור בטמפרטורה של 37°C, 5% CO2.
      הערה: לאחר 90 דקות, ההידרוג'ל עמוס התאים יעבור פולימריזציה מלאה.

3. מיקרו-תבניות משטח (אופציונלי)

  1. בצע מיקרו-תבניות פני השטח של הידרוג'ל הסטרומה לאחר צנרת הקולגן הידרוג'ל המנוטרל (עדיין במצבו הנוזלי) באמצעות חותמות מודפסות בתלת-ממד.
    הערה: ניתן להשיג את הבולים המודפסים בתלת-ממד בעיצובים שונים הניתנים להתאמה אישית, כפי שתואר קודם לכן במקום אחר24.
  2. פיפטה 20 μL של תמיסת טרום ג'ל קולגן I מנוטרל על פני השטח המעוצבים של בול סטרילי המודפס בתלת-ממד ומכניסים את החותמת פנימה (למעלה) של התא הפתוח כאשר הידרוג'ל הסטרומה עדיין בצורה נוזלית.
  3. יש להסיר שאריות של ההידרוג'ל שעלולות להישפך מראש החדר הפתוח באמצעות שואב (או פיפטה). קבצו את כל הצ'יפס לצלחות פטרי נפרדות וכללו פקק צינור חרוטי צנטריפוגה בנפח 15 מ"ל מלא ב-2 מ"ל של ddHסטרילי 2O בכל צלחת פטרי.
  4. יש לדגור על כל צלחות הפטרי בטמפרטורה של 37°C, 5% CO2 למשך 90 דקות, ולאחר מכן להחזיר את השבבים מתחת ל-BSC ולהסיר בעדינות את החותמות באמצעות פינצטה מדויקת כדי להפחית את הסיכון לפגיעה בהידרוג'ל.

4. ציפוי משטח האפיתל וכלי הדם בחלבוני ECM ספציפיים לרקמה

  1. ציפוי התא המיקרופלואידי של כלי הדם בחלבוני מטריצה חוץ-תאיים
    1. הכפל את מספר השבבים הדרושים לניסוי ב- 20 μL (נפח תעלת כלי הדם) כדי להעריך את נפח תמיסת ציפוי ECM וסקולרית הנדרשת לניסוי:
      נפח נדרש = (מספר שבבים x 20) μL
      הערה: מומלץ להכין אמצעי אחסון נוסף של 15% כדי להתחשב בשגיאות ניסוי.
    2. הכן את תמיסת ציפוי ECM וסקולרית עבור כל השבבים (לדוגמה, 300 μL לכל 12 שבבים) באמצעות PBS קר כקרח או HBSS.
      הערה: עיין בטבלת פרוטוקול האיברים הספציפית בסעיף החומרים המשלימים (טבלה משלימה 1 לעור; טבלה משלימה 2 עבור alveolus; טבלה משלימה 2 לדרכי הנשימה, וטבלה משלימה 4 למעי) לזיהוי ריאגנטים ספציפיים והרכב ECM מומלץ.
    3. פיפטה 20 μL של תמיסת ציפוי ECM וסקולרית לתוך תעלת כלי הדם של כל שבב.
  2. ציפוי פני השטח האפיקליים של המקבילה הסטרומלית בחלבוני מטריצה חוץ-תאיים
    1. הכפל את מספר השבבים הדרושים לניסוי ב- 50 μL (נפח תעלת כלי הדם) כדי להעריך את נפח תמיסת ציפוי ECM אפיתל הנדרשת לניסוי:
      נפח נדרש = (מספר שבבים x 50) μL
      הערה: מומלץ להכין נפח נוסף של 15% כדי לקחת בחשבון שגיאות ניסוי.
    2. הכינו מספיק תמיסת ציפוי ECM לכל השבבים (לדוגמה, 750 μL לכל 12 שבבים) ב- PBS או HBSS קרים כקרח והעבירו 50 μL של תמיסת ציפוי ECM אפיתל ישירות על גבי משטח ההידרוג'ל.
      הערה: עיין בטבלת פרוטוקול האיברים הספציפית בסעיף החומרים המשלימים (טבלה משלימה 1 לעור; טבלה משלימה 2 עבור alveolus; טבלה משלימה 2 לדרכי הנשימה, וטבלה משלימה 4 למעי) לזיהוי ריאגנטים ספציפיים והרכב ECM מומלץ.
    3. קבצו את הצ'יפס לצלחות פטרי נפרדות, כולל פקק צינור חרוטי צנטריפוגה 15 מ"ל מלא ב-2 מ"ל של ddH 2 O סטרילי בכל צלחת פטרי, ודגרו על צלחות הפטרי באינקובטור בטמפרטורה של 37°C, 5% CO2למשך שעתיים לפני שתמשיכו בזריעת תאי אפיתל.

5. זריעת תאי אפיתל על המקבילה סטרומה

  1. תרבית תאי אפיתל
    1. תאי אפיתל ספציפיים לרקמת תרבית לפי הוראות הספקים עד למפגש של 80%-90%.
    2. נתק את התאים באמצעות הליכי אנזים מפרקי חלבון בהתאם להמלצת ספק התא.
      הערה: לקבלת התוצאות הטובות ביותר, יש לקצור תאי אפיתל במעבר נמוך (P1-P2) במהלך שלב הגידול הפעיל, כאשר הם מגיעים למפגש של 70%-90%.
    3. לאחר הניתוק, צנטריפוגו את התאים ואספו אותם כגלולה.
    4. השהה מחדש את תאי האפיתל לצפיפות התא/שבר המתאימה כפי שמצוין בטבלת פרוטוקול האיברים הספציפיים.
      הערה: במחקר זה, תמיסת תאים שימשה בצפיפות של 3 x 10 6 תאים / מ"ל עבור העור, 1 x 10 6 תאים / מ"ל עבור alveolus, 6 x 10 6 תאים / מ"ל עבור דרכי הנשימה ו 8 x 10 6 מקטעים / מ"ל עבור המעי.
  2. זריעת תאי אפיתל
    1. להעביר את השבבים מן האינקובטור לתוך BSC. שאפו את תמיסת הציפוי מתעלת כלי הדם, ושטפו את התעלה המיקרופלואידית של כלי הדם שלוש פעמים עם 50 מיקרוליטר של מדיום תרבית תאי אנדותל טריים.
    2. שאפו את תמיסת הציפוי ממשטח ההידרוג'ל ושטפו את משטח הסטרומה שלוש פעמים עם 100 מיקרוליטר של מדיום תרבית תאי אפיתל טריים כדי להסיר תמיסת ציפוי עודפת.
    3. שואפים את התווך העולה וזורעים את משטח ההידרוג'ל עם 50 מיקרוליטר של תרחיף תאי האפיתל באמצעות צפיפות תאים מתאימה, כפי שמצוין בטבלאות המשלימות ולאחר מכן מעבירים את השבבים חזרה לאינקובטור למשך שעתיים (או לילה לקולונואידים).
    4. שטפו בעדינות את משטח ההידרוג'ל עם מדיום תרבית התא פעמיים כדי להסיר פסולת תאית. לבסוף, רענן את המדיום על ידי autoclaving במיכלים אטומים autoclavable, ולחבר את השבבים למשאבה peristaltic.

6. חיבור שבבים לזרימה

  1. הכנת החלקים הזורמים
    1. חתכו 2 אינץ' של צינורות העברה תרמופלסטיים מבוססי פוליפרופילן (TPE) תואמים ביולוגית (טבלה של חומרים) כדי להכין את הצינור המיקרופלואידי הקצר הדרוש לחיבור השבבים למאגרי המדיה.
    2. חתכו 7.5 אינץ' של צינורות העברה TPE תואמים ביולוגית כדי לייצר את הצינור המיקרופלואידי הארוך.
    3. הכינו מספיק מחברי מתכת 18 G ו- 19 G (טבלת חומרים).
      הערה: מומלץ להכין ולעקר את הצינורות והמחברים המתוארים בשלבים 6.1.1 ו-6.1.2 לפחות יום אחד לפני חיבור השבבים הפתוחים למשאבות הפריסטלטיות.
    4. נקב את המכסה של כל מאגר בינוני עם מחט היפודרמית 4 אינץ '(טבלה של חומרים).
  2. הפחתת גזים בינונית
    1. אפשרו למדיום תרבית התאים להתאזן לטמפרטורת החדר (RT).
    2. מעבירים את נפח התווך הדרוש לצינור סינון חרוט.
    3. החל לחץ ואקום שלילי של -20 PSI כדי להוריד גז מהתווך (סינון מונע ואקום).
      הערה: אם ואקום אינו זמין, ניתן להשאיר את מדיום תרבית התאים לשיווי משקל באינקובטור בן לילה כדי להשיג תוצאות דומות.
  3. הכינו את השבב הפתוח לזרימת נוזלים
    1. הבא את השבבים ואת חלקי הנוזל הסטריליים מתחת ל- BSC ויישר את המכסה (החלק העליון) של השבב הפתוח לאיטום אב הטיפוס של שבב Open-Top לפני תחילת זרימת הנוזל.
    2. פיפטה 200 μL של מדיום תרבית התא degassed (ראה טבלאות ספציפיות לאיבר) לתוך פתח הכניסה של שני הערוצים העליון והתחתון של השבב תוך שימת לב כדי למנוע בועות.
    3. פיפטה 300 μL של מדיום התרבית לתוך צינורות מיקרופלואידים קצרים כדי להקדים את פני השטח הפנימיים של הצינורות ולחבר את הצינור הקצר לפתחים של הערוצים העליונים והתחתונים של השבב.
  4. לחבר ולכוון את המשטחים המיקרופלואידים
    1. מקם את המאגרים הבינוניים במדף החווה, חבר את המחט ההיפודרמית לכניסה התחתונה של השבבים, ולבסוף, להכיל את כל השבבים במוביל הדיור (ים) בתוך האינקובטור.
    2. חבר את השבבים למשאבה הפריסטלטית ולאחר מכן בדוק את כל המחברים כדי לוודא שכל השבבים מחוברים כראוי ושאין דליפה נראית לעין של מדיה של תרבית תאים.
    3. השתמש בלחצן הטיהור במשאבה והחזק אותו למשך כ -15 שניות או עד שטיפות התווך של תרבית התאים מופיעות בקצה צינורות היציאה.
    4. השתמשו במערכת הבקרה במשאבה כדי להגדיר את קצב זרימת שבב האיבר המתאים (איור 2, איור 3, איור 4 ואיור 5).

7. תחזוקת שבבים

  1. תחזוקת שבבי איברים
    1. הכינו תרבית תאים טרייה עבור האפיתל ו/או האנדותל ובצעו את שלבי פירוק הגזים (כפי שתואר קודם לכן בשלב 6.2).
    2. השהה את המשאבה הפריסטלטית, נתק בזהירות את השבבים מהמשאבה וחלץ את נשא בית השבב. מעבירים את השבבים מהאינקובטור ל-BSC ומוציאים את נפח המדיה שנשאר למאגרים.
    3. החלף את מדיית תרביות התאים למאגרי הכניסה העליונים והתחתונים ב-5 מ"ל של מדיה טרייה של תרביות תאים והחזיר את נשא השבב לאינקובטור. חבר את השבבים למשאבה הפריסטלטית והפעל מחדש את הזרימה.
      הערה: מומלץ להשתמש בפונקציית הטיהור כדי לרענן במהירות את המדיום לתא כלי הדם ולהפחית את הסיכון לבועות אוויר.
    4. חזור על שלבים 7.1.1-7.1.3 פעם ביומיים, לפי איור 2, איור 3, איור 4 ואיור 5.
  2. הקמת ממשק אוויר-נוזל (ALI)
    1. השהה את המשאבה הפריסטלטית, נתק בזהירות את השבבים מהמשאבה וחלץ את נשא בית השבב. מעבירים את השבבים מהאינקובטור לארון הבטיחות הביולוגית, ומוציאים את נפח התווך שנותר למאגר העליון.
    2. שאפו בעדינות את כל התווך מהתעלה המיקרופלואידית העליונה ומהדקים את הצינור המיקרופלואידי הקצר המחובר לפתחים העליונים באמצעות תפסי קלסרים כדי להפחית את אידוי המדיה ותחזוקת ALI.
    3. הניחו את השבב הפתוח על מוביל הדיור בחזרה לאינקובטור וחברו מחדש את השבבים למשאבה הפריסטלטית.
      הערה: מומלץ להשתמש בפונקציית הטיהור כדי לרענן במהירות את המדיום לתא כלי הדם ולהפחית את הסיכון לבועות אוויר.
    4. חדש את הזרימה על ידי הפעלת המשאבה הפריסטלטית.
  3. מתיחות (אופציונלי)
    1. השהה את המשאבה הפריסטלטית וחבר את יציאות הוואקום של השבבים למודול הוואקום באמצעות שתי שפופרות מיקרופלואידיות ארוכות לכל שבב.
    2. השתמש במודול הוואקום כדי להתאים את הגדרת המתיחה למצב המומלץ עבור כל איבר כמפורט בטבלאות פרוטוקול האיברים: טבלה משלימה 1 לעור; טבלה משלימה 2 עבור alveolus; טבלה משלימה 2 לנתיב האוויר; וטבלה משלימה 4 למעי.
    3. בדוק חזותית את חיבורי הצינור כדי לוודא שכל השבבים מחוברים כראוי ואין טיפות נראות לעין של טפטוף בינוני.
    4. חדש את הזרימה על ידי הפעלת המשאבה הפריסטלטית.

8. זריעת תאי אנדותל בתא כלי הדם

  1. הכנת תאים ושבבים לזריעת תאי כלי דם
    1. תרבית את תאי האנדותל הספציפיים לרקמה לפי הוראות הספקים עד למפגש של 80%-90%. נתק את התאים באמצעות הליך אנזים פרוטאוליטי (לפי המלצת הספק) ולבסוף, השהה מחדש את תאי האנדותל בתמיסה של 3 x 106 תאים / מ"ל.
      הערה: לקבלת התוצאות הטובות ביותר, קצרו את תאי האנדותל במעבר נמוך (P2-P4) במהלך שלב הגידול הפעיל כאשר הם מגיעים למפגש של 70%-90%.
    2. השהה את המשאבה הפריסטלטית. מעבירים את השבבים מהאינקובטור ל-BSC, מנתקים את השבבים ממאגרי המדיה ומכל צינורות מחוברים, ואז מקבצים את השבבים לצלחות פטרי נפרדות.
    3. רעננו את מדיום תרבית התאים של תא האפיתל עם מדיום תרבית תאי אפיתל טרי. יש לשטוף את תעלת כלי הדם בתרבית תאי אנדותל טריים פעמיים, ולאחר מכן לשאוף את התווך מתא כלי הדם.
  2. זריעת תאי אנדותל
    1. זרעו את התעלה התחתונה (כלי הדם) עם 25 μL של תרחיף תאי אנדותל (3 x 106 תאים / מ"ל), הפכו את השבבים כדי לאפשר לתאי אנדותל להיצמד לפני השטח העליונים של התא המיקרופלואידי.
      הערה: הוסף 50 μL של מתלה התא לכל שבב (600 μL לכל 12 שבבים).
    2. קבצו את הצ'יפס לצלחות פטרי. החזירו אותם לאינקובטור בטמפרטורה של 37°C, 5% CO2, ותנו לתאי האנדותל להתחבר למשך שעה אחת.
    3. לאחר 1 שעה, להעביר את השבבים מן האינקובטור ל BSC. יש לשטוף את תעלת כלי הדם בתרבית תאי אנדותל פעמיים כדי להסיר פסולת תאית.
    4. חזור על שלבים 8.2.1-8.2.2 כדי לזרוע שוב את תעלת כלי הדם עם תאי אנדותל ולהניח את השבבים שטוחים כדי להקל על הידבקות תאי האנדותל לפני השטח התחתונים של תעלת כלי הדם.
  3. חבר מחדש את השבב לזרימה
    1. מלאו את מאגר מדיום כלי הדם בתווך תרבית תאי כלי הדם תחת BSC.
    2. החזירו את השבבים למנשא(ים) של בית השבבים וחברו מחדש את השבבים למאגרים הבינוניים בקצה אחד למשאבה הפריסטלטית בקצה השני.
      הערה: מומלץ להשתמש בפונקציית הטיהור כדי לרענן במהירות את המדיום לתא כלי הדם ולהפחית את הסיכון לבועות אוויר.
    3. בדוק חזותית את החיבורים המיקרופלואידים כדי לוודא שכל השבבים מחוברים כראוי ואין טיפות נראות לעין של טפטוף בינוני. לאחר מכן, חדש את זרימת הנוזלים על ידי הפעלת המשאבה הפריסטלטית.

9. בדיקות נפוצות של נקודות קצה

  1. נתק שבבים עבור בדיקות של נקודות קצה
    1. השהה את המשאבה הפריסטלטית, נתק בזהירות את השבבים מהמשאבה וחלץ את נשא בית השבב. העבר את נושא בית השבב מהאינקובטור ל- BSC ושחרר את השבבים.
    2. שטפו בעדינות את החדר המרכזי של השבב הפתוח עם מדיום תרבית תאי האפיתל ואת תעלת כלי הדם עם מדיום תרבית האנדותל פעמיים כדי להסיר פסולת תאית.
    3. הסר את מכסה השבב הפתוח כדי לגשת לתא האפי של השבב באמצעות פינצטה.
  2. Immunostaining עבור מיקרוסקופ פלואורסצנטי
    1. המשך בקיבוע דגימה קונבנציונאלי, חדירה וחסימה.
      הערה: במחקר זה, הדגימות תוקנו ב-200 מיקרוליטר של 4% פרפורמלדהיד (PFA) למשך שעה אחת ולאחר מכן שטיפה עם PBS, חדירה ב-0.1% Triton X-100 למשך 40 דקות וחסימה באלבומין בסרום בקר 1% למשך שעה אחת.
    2. לדגור את השבבים עם נוגדנים ראשוניים (טבלה של חומרים) ב 4 ° C במשך הלילה. ולאחר מכן לשטוף את שני תאי אפיתל אנדותל של שבבים עם 200 μL של PBS פעמיים. לאחר מכן, המשך עם הנוגדנים המשניים המתאימים במשך 2 שעות.
      הערה: לדלל את הנוגדנים הראשוניים והנוגדנים המשניים ב- PBS + 1% BSA בדילול של 1:100 (נוגדן ראשוני) ו- 1:200 (נוגדן משני).
  3. אימונוהיסטוכימיה
    1. חלצו את המקבילות סטרומה מהחדר הראשי של השבב הפתוח באמצעות פינצטה, אספו אותן לתוך צינור 1.5 מ"ל מלא בפורמלין חוצץ נייטרלי 10% ודגרו במשך 24 שעות לפחות.
    2. העבר את הסטרומה הקבועה המקבילה למעבד הרקמה ובצע את השלבים הבאים כדי להשיג התייבשות דגימה אופטימלית.
      1. טבלו את ההידרוג'ל באתנול 70% למשך 90 דקות.
      2. מוציאים את האתנול 70% וטובלים את ההידרוג'ל באתנול 80% למשך 90 דקות.
      3. מוציאים את 80% האתנול וטובלים את ההידרוג'ל באתנול 95% למשך 90 דקות.
      4. מוציאים את האתנול 95% וטובלים את ההידרוג'ל באתנול 100% למשך 90 דקות פעמיים.
      5. מוציאים את האתנול 100% וטובלים את ההידרוג'ל בתמיסה של קסילן למשך 120 דקות פעמיים.
      6. הסר את תמיסת הקסילן והסתנן למקבילות הסטרומה המעובדות בשעוות פרפין למשך 120 דקות (~ 2 שעות) פעמיים.
    3. הטמע את המקבילות הסטרומה שהוחדרו לתוך בלוקי פרפין חתכים.
    4. בשלב זה, ניתן לחלק את המקבילות סטרומה כבלוקים פרפין באמצעות מיקרוטום ולעבד על פי טכניקות היסטולוגיות קונבנציונליות26.

תוצאות

מיקרו-תבניות משטח
ניתן להשתמש במיקרו-תבניות של המטריצה החוץ תאית (ECM) כדי לשכפל את התצורה המרחבית של ממשק הקריפטה של המעי. ניתן לשנות את תצורת השבב הפתוח כדי לשלב חותמות מיקרו-תבניות שתוכננו במיוחד כדי לחקות את הטופוגרפיה הטבעית של ממשק אפיתל-סטרומה של המעי הגס (איור 6A,B) ...

Discussion

השבב הפתוח מהווה פלטפורמה המאפשרת לחקור את יחסי הגומלין התאיים המורכבים המתרחשים בין אנדותל, סטרומה ואפיתל במיקרו-סביבה מבוקרת, בזמן אמת. טכנולוגיה זו מציעה יתרונות קריטיים על פני תרביות אורגנוטיפיות ואורגנואידים קונבנציונליות, כגון שילוב של רמזים פיזיקליים וביוכימיים הרלוונטיים לשחז?...

Disclosures

המחברים מצהירים על האינטרסים הפיננסיים/יחסים האישיים הבאים, אשר עשויים להיחשב כאינטרסים מתחרים פוטנציאליים: Varone Antonio הוא עובד לשעבר של Emulate Inc. ועשוי להחזיק במניות ב-Emulate.

Acknowledgements

ללא

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
10x EMEM Lonza12-684FMedium; Stroma
18 Gauge needleMicroGroup316H18RWTube stainless steel 316 welded, 18RW Full Hard 
19 Gauge needleMicroGroup316H19RWTube stainless steel 316 welded, 19RW Full Hard
2-Stop PharMed BPT Cole-Palmer EW-95723-12Tube, 0.25 mm, 12/pack
70% ethanol and wipes  -  - For surface sterilization 
8-Bromoadenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt (8-Br-cAMP)SigmaB7880Medium supplement 
A-83-01 Tocris 2939
AdenineSigmaA9795
Advanced DMEM/F12 Thermo12634010
Airway Epithelial CellsLifeline Cell TechnologyFC-0016
Aluminum foil  -  -  -
Alveolar cellsCell BiologicsH6621
Anti-ABCA3  ABCAM ab24751 Mouse monoclonal antibody [3C9] 
Anti-Aquaporin5 Alexa Fluor 647 ABCAM ab215225  Rabbit monoclonal antibody [EPR3747]  
Anti-Aquaporin5 ABCAM ab92320 Rabbit monoclonal antibody [EPR3747] 
Anti-beta IV Tubulin  ABCAM ab11315 Mouse monoclonal antibody [ONS.1A6] 
Anti-CD31 (PECAM-1) ABCAM ab9498 Mouse monoclonal [JC/70A] antibody  
Anti-CK5  ABCAM ab75869 Rabbit recombinant monoclonal [AY1E6] 
Anti-Cytokeratin 10  ThermoFisher MA5-13705 Mouse monoclonal antibody (DE-K10) 
Anti-Cytokeratin 14  ABCAM ab7800 Mouse monoclonal antibody 
Anti-E-Cadherin  ABCAM ab1416  Mouse monoclonal antibody 
Anti-Filaggrin  ThermoFisher PA5-79267 Rabbit polyclonal antibody  
Anti-HTI-56 Terrace Biotech TB-29AHT1-56  Mouse monoclonal antibody (IgG1) 
Anti-HTII-280 Terrace Biotech TB-27AHT2-280 Mouse monoclonal antibody (IgM) 
Anti-Involucrin  ThermoFisher MA5-11803 Mouse monoclonal antibody (SY5) 
Anti-Isoforms TA p63-α, -β, -γ  Biolengend 618902 Rabbit polyclonal antibody  
Anti-Ki67  ABCAM ab8191 Mouse monoclonal antibody [B126.1] 
Anti-LAMP3  ABCAM ab111090 Rabbit polyclonal antibody 
Anti-Mature SP-B Seven Hill WRAB-48604 Rabbit polyclonal antibody 
Anti-MUC5AC  ThermoFisher PA5-34612 Rabbit polyclonal antibody  
Anti-Mucin-2 SantaCruz Biotechnologysc-7314Mouse monoclonal antibody (IgG1) 
Anti-p63  Dako GA662 Mouse monoclonal antibody p63 Protein (Dako Omnis) Clone DAK-p63 
Anti-PCNA  ThermoFisher PA5-32541 Rabbit polyclonal antibody  
Anti-Podoplanin (AT-1α)  ABCAM ab128994 Rabbit polyclonal antibody 
Anti-Pro + Mature Surfactant Protein B ABCAM ab40876 Rabbit polyclonal antibody 
Anti-Surfactant C   Seven Hill  WRAB-9337  Rabbit polyclonal antibody 
Anti-Uteroglobin/SCGB1A1 Hycult Biotech HM2178 Mouse monoclonal antibody [AY1E6] 
Anti-VE-cadherin  ABCAM ab33168 Rabbit polyclonal antibody  
Anti-ZO-1  ThermoFisher 33-9100 Mouse monoclonal antibody [1A12] 
Ascorbic acidSigmaA4544
Aspirating pipettes Corning / Falcon 357558 2 mL, polystyrene, individually wrapped 
Aspirating tips  -  - Sterile (autoclaved) 
B27Thermo17504044
Blocker BSA (10X) in PBS solution  ThermoFisher 37525 Blocker agent 
Calcium ChlorideSigmaC7902
CHIR 99021Tocris4423
Collagen IAdvanced Biomatrix513310 mg/mL (Stroma)
Collagen I Advanced BioMatrix50053 mg/mL (Vascular ECM)
Collagen IVSigma C5533
Collagen-IVSigma C5533-5MG Collagen from human placenta, 5 mg powder, reconstitute to 1 mg/mL 
Colonic Fibroblasts Cell Biologics H6231
Colonic microvascular endothelial cells Cell BiologicsH6203 
Conical tubes   -  - 15 mL and 50 mL polypropylene, sterile 
Crosslinker (ER-1) Emulate 104615 mg powder 
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)  ThermoFisher D3571 DNA probe 
Dermal fibroblastsATCCPCS-201-010
Dermal microvascular endothelial cellsATCCCRL-3243
DexamethasoneSigmaD4902
DMEMThermoFisher11054020
DMEM/F-12 GIBCO 11320082
DMEM/F-12, GlutaMAX  GIBCO 10565-018 Basal medium for ALI medium 
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488)  ABCAM ab150105 Donkey Anti-Mouse secondary antibody  
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 568)  ABCAM ab175472 Donkey Anti-Mouse secondary antibody 
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647)  ABCAM ab150107 Donkey Anti-Mouse secondary antibody 
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488)  ABCAM  ab150073 Donkey Anti-Mouse secondary antibody 
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 568)  ABCAM ab175470 Donkey Anti-Mouse secondary antibody 
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 647)  ABCAM ab150075 Donkey Anti-Mouse secondary antibody 
Dulbecco’s PBS (DPBS-/-) (without Ca2+, Mg2+) Corning 21-031-CV 1x 
Epidermal Growth Factor (EGF) human, recombinant in E. coliPromoCellC-60170Medium supplement 
F-12 Ham’sInvitrogen 21700-108For vascular ECM
FibriCol Advanced BioMatrix 5133-20ML Collagen-I solution (10 mg/mL)
FibronectinCorning356008
Fibronectin, Human, Natural,  Corning 47743-654 human plasma fibronectin 
Fine-tip precision tweezers Aven18056USA Technik Style 5B-SA Precision Stainless Steel Tweezers
GlutamaxInvitrogen 21700-108
Glutamax Invitrogen 35050061
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 594)  ABCAM ab150080 Goat Anti-Mouse secondary antibody  
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647)  ABCAM ab150115 Goat Anti-Mouse secondary antibody  
Goat Anti-Mouse IgG H&L (FITC)  ABCAM ab6785 Goat Anti-Mouse secondary antibody  
Goat Anti-Mouse IgG1 Alexa Fluor 568  ThermoFisher A-21124 Goat Anti-Mouse IgG1 secondary antibody 
Goat Anti-Mouse IgM Alexa Fluor 488  ThermoFisher A-21042 Goat Anti-Mouse IgM secondary antibody 
Handheld vacuum aspirator Corning 4930  - 
Heat Inactivated HyClone FetalClone II Serum (FCS) GE Healthcare Life SciencesSH30066.03
Hemocytometer  -  - - 
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosaSigmaH3149
HEPESThermo15630080
Human [Leu15] - Gastrin SigmaG9145
Human colonoidsObtained from clinical resectionsObtained from clinical resections
Human EGF Recombinant Protein ThermoPHG0311L
human epithelial growth factor Thermo PHG0311
HyClone FetalClone II Serum (U.S.)  GE Healthcare SH30066.02HI  Sterile FBS heat-inactivated 
Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium saltSigmaH4881
Hydrocortisone PromoCell  C-64420 Medium supplement  
Ice bucket  -  -  - 
Ismatec IPC-N Cole-PalmerEW-78000-41Low-Speed Digital Peristaltic Pump; q24-Channel (1 per 12 Chips)
ITESBioWhittaker17-839Z
Keratinocyte Growth Factor (KGF), also known as Basic Fibroblast Growth Factor 7 (FGF-7), human, recombinant in HEKPromoCellC-63821
KeratinocytesATCCPCS-200-010
Laminin BiolaminaCT521-0501 
Laminin, 521 CTG (CT521) Biolamina  CT521-0501 human recombinant laminin 521    
Lung FibroblastCell BiologicsH6013
Lung FibroblastLifeline Cell TechnologyFC-0049
Lung microvascular endothelial cellsLonzaCC-2527
Lung smooth muscle cellsLifeline Cell TechnologyFC-0046
Manual counter  -  -  -
Masterflex (TPE) Transfer Tubing Cole-PalmerFV-96880-02PharMed BPT, 1/32" ID x 5/32" OD
Medium 199, no phenol redThermo 11043023
Microcentrifuge tube  -   -  1.5 mL, sterile 
Microscope (with camera)  -  - For bright-field imaging 
N2Sigma17502001
N-acetyl cysteineSigmaA5099
Noggin (HEK293T conditioned medium)SigmaN17001
Normal Goat Serum  ThermoFisher 50062Z Blocking solution  
O-phosphosrylethanolamine SigmaP0503
Paraformaldehyde (4% wt/vol)  EMS 15710 Fixing agent 
Penicillin StreptomycinGIBCO15140122
Penicillin-streptomycin Sigma P4333 10,000 U/mL; 10 mg/mL 
Pipette tips   -  - P20, P200, and P1000 sterile, low adhesion
Pipette Gilson  F167380 P20, P200, and P1000 
PluriQ Serum Replacement (or alternatively KO Serum replacement)AMSBIO (or Thermo)N/A (or C1910828010)
Poly-L-Lysine coated microscope glass slides  Sigma P0425 Glass slides 
PrimocinInvivoGenant-pm-1
ProgesteroneSigmaP8783
ProLong Gold  ThermoFisher P36931 Antifade Mountant with DAPI 
Retinoic Acid SigmaR2625
ROCK inhibitor (Y27632)TocrisTB1254-GMP/10
R-spondin (HEK293T conditioned medium)SigmaSCC111
SAGM SingleQuots supplements LonzaCC-4124
SAGMTM Small Airway Epithelial Cell Growth medium BulletKitTM Lonza CC-4124 Medium supplements 
SB2001190 Tocris 1264/10
Serological pipettes  -  - 2 mL, 5 mL, 10 mL, and 25 mL low endotoxin, sterile 
Small Airway Epithelial Cell Growth medium (SAGM)Lonza CC-4124 
Solvent Buffer (ER-2) Emulate 1046225 mL bottle 
Steriflip-HV MilliporeSE1M003M00Sterile filtering conical tube
Sterilin 100 mm Square Petri DishesThermo103Sterile, 1 per 6 chips 
T25 flasks  -  -  -
T75 flasks  -  -  - 
Tri-iodothyronineSigmaT5516
Triton X-100 (0.3% (vol/vol)  Sigma T8787 Permeabilization agent 
Trypan blue Sigma 93595 0.4% solution 
TrypEE solution Sigma 12604013 Cell detaching solution 
TWEEN-20 Sigma P2287 Permeabilization agent 
UV Light Oven (peak frequency 365nm, intensity of 100 µJ/cm2)VWR21474-598UVP, Long Range UV, 365 nm 60Hz Model CL-1000L
Vacuum set-up  -  - Minimum pressure: -70 kPa 
Vascular Endothelial Growth Factor 165 (VEGF-165) human, recombinant in E. coliPromoCellC-64420
VEGF-165  PromoCell  C-64420 Medium supplement 
Von Willebrand Factor conjugated FITC  ABCAM ab8822 Sheep polyclonal antibody 
Water bath (or beads)  -  - Set to 37 °C 
Wnt3A (L-Wnt3A conditioned medium)ATCCCRL-2647

References

  1. Van Norman, G. A. Limitations of animal studies for predicting toxicity in clinical trials: Is it time to rethink our current approach. JACC: Basic to Translational Science. 4 (7), 845-854 (2019).
  2. Wange, R. L., Brown, P. C., Davis-Bruno, K. L. Implementation of the principles of the 3Rs of animal testing at CDER: Past, present and future. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 123, 104953 (2021).
  3. Mosig, A. S. Organ-on-chip models: New opportunities for biomedical research. Future Science OA. 3 (2), (2017).
  4. Alépée, N., et al. State-of-the-art of 3D cultures (organs-on-a-chip) in safety testing and pathophysiology. Altex. 31 (4), 441-477 (2014).
  5. MacArron, R., et al. Impact of high-throughput screening in biomedical research. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (3), 188-195 (2011).
  6. Hughes, J. P., Rees, S. S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L. Principles of early drug discovery. British Journal of Pharmacology. 162 (6), 1239-1249 (2011).
  7. Kitaeva, K. V., Rutland, C. S., Rizvanov, A. A., Solovyeva, V. V. Cell culture based in vitro test systems for anticancer drug screening. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 322 (2020).
  8. Mao, P., et al. Human alveolar epithelial type II cells in primary culture. Physiological Reports. 3 (2), 12288 (2015).
  9. Zaitseva, M., Vollenhoven, B. J., Rogers, P. A. W. In vitro culture significantly alters gene expression profiles and reduces differences between myometrial and fibroid smooth muscle cells. Molecular Human Reproduction. 12 (3), 187-207 (2006).
  10. Singh, A., Brito, I., Lammerding, J. Beyond tissue stiffness and bioadhesivity: Advanced biomaterials to model tumor microenvironments and drug resistance. Trends in Cancer. 4 (4), 281-291 (2018).
  11. Nawroth, J. C., et al. Stem cell-based Lung-on-Chips: The best of both worlds. Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 12-32 (2019).
  12. Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2d to 3d cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).
  13. Kapałczyńska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
  14. Sutherland, R. M., Inch, W. R., McCredie, J. A., Kruuv, J. A multi-component radiation survival curve using an in vitro tumour model. International Journal of Radiation Biology. 18 (5), 491-495 (1970).
  15. Chandra, P., Lee, S. J. Synthetic extracellular microenvironment for modulating stem cell behaviors. Biomarker Insights. 10, 105-116 (2015).
  16. Nicolas, J., et al. 3D extracellular matrix mimics: Fundamental concepts and role of materials chemistry to influence stem cell fate. Biomacromolecules. 21 (6), 1968-1994 (2020).
  17. Brassard, J. A., Lutolf, M. P. Engineering stem cell self-organization to build better organoids. Cell Stem Cell. 24 (6), 860-876 (2019).
  18. Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. Designing materials to direct stem-cell fate. Nature. 462 (7272), 433-441 (2009).
  19. Mantha, S., et al. Smart hydrogels in tissue engineering and regenerative medicine. Materials. 12 (20), 3323 (2019).
  20. Langhans, S. A. Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning. Frontiers in Pharmacology. 9, 6 (2018).
  21. Li, H., et al. Biomechanical cues as master regulators of hematopoietic stem cell fate. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (16), 5881-5902 (2021).
  22. Donoghue, L., Nguyen, K. T., Graham, C., Sethu, P. Tissue chips and microphysiological systems for disease modeling and drug testing. Micromachines. 12 (2), 139 (2021).
  23. Ma, C., Peng, Y., Li, H., Chen, W. Organ-on-a-chip: A new paradigm for drug development. Trends in Pharmacological Sciences. 42 (2), 119-133 (2021).
  24. Varone, A., et al. A novel organ-chip system emulates three-dimensional architecture of the human epithelia and the mechanical forces acting on it. Biomaterials. 275, 120957 (2021).
  25. Hassell, B. A., et al. Human organ chip models recapitulate orthotopic lung cancer growth, therapeutic responses, and tumor dormancy in vitro. Cell Reports. 21 (2), 508-516 (2017).
  26. Sadeghipour, A., Babaheidarian, P. Making formalin-fixed, paraffin embedded blocks. Biobanking. 1897, 253-268 (2019).
  27. Grant, J., et al. Simulating drug concentrations in PDMS microfluidic organ chips. Lab on a Chip. 21 (18), 3509-3519 (2021).
  28. Barrile, R., et al. Organ-on-chip recapitulates thrombosis Induced by an anti-CD154 monoclonal antibody: Translational potential of advanced microengineered systems. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 104 (6), 1240-1248 (2018).
  29. Jain, A., et al. Primary human lung alveolus-on-a-chip model of intravascular thrombosis for assessment of therapeutics. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 103 (2), 332-340 (2018).
  30. Campbell, S. B., Wu, Q., Yazbeck, J., Liu, C., Okhovatian, S., Radisic, M. Beyond polydimethylsiloxane: Alternative materials for fabrication of organ-on-a-chip devices and microphysiological systems. ACS Biomaterials Science and Engineering. 7 (7), 2880-2899 (2021).
  31. Pun, S., Haney, L. C., Barrile, R. Modelling human physiology on-chip: Historical perspectives and future directions. Micromachines. 12 (10), 1250 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE192

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved