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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Fähigkeiten und die wesentlichen Kulturmodalitäten des Open-Top Organ-Chips für die erfolgreiche Etablierung und Reifung von Organ-on-Chip-Kulturen in voller Dicke von primären Geweben (Haut, Alveole, Atemwege und Darm) und bietet die Möglichkeit, verschiedene funktionelle Aspekte der humanen epithelial/mesenchymalen und vaskulären Nischenschnittstelle in vitro zu untersuchen.

Zusammenfassung

Fast alle menschlichen Organe sind mit Epithelgewebe ausgekleidet, das aus einer oder mehreren Schichten eng verbundener Zellen besteht, die in dreidimensionalen (3D) Strukturen organisiert sind. Eine der Hauptfunktionen von Epithelien ist die Bildung von Barrieren, die das darunter liegende Gewebe vor physikalischen und chemischen Beleidigungen und Infektionserregern schützen. Darüber hinaus vermitteln Epithelien den Transport von Nährstoffen, Hormonen und anderen Signalmolekülen, wodurch oft biochemische Gradienten entstehen, die die Zellpositionierung und Kompartimentierung innerhalb des Organs steuern. Aufgrund ihrer zentralen Rolle bei der Bestimmung der Organstruktur und -funktion sind Epithelien wichtige therapeutische Angriffspunkte für viele menschliche Krankheiten, die nicht immer von Tiermodellen erfasst werden. Neben den offensichtlichen Unterschieden zwischen den Arten wird die Durchführung von Forschungsstudien über die Barrierefunktion und die Transporteigenschaften von Epithelien bei Tieren durch die Schwierigkeit des Zugangs zu diesen Geweben in einem lebenden System noch verstärkt. Während zweidimensionale (2D) menschliche Zellkulturen für die Beantwortung grundlegender wissenschaftlicher Fragen nützlich sind, liefern sie oft schlechte In-vivo-Vorhersagen . Um diese Einschränkungen zu überwinden, hat sich in den letzten zehn Jahren eine Vielzahl von mikrotechnisch hergestellten biomimetischen Plattformen, die als Organs-on-a-Chip bekannt sind, als vielversprechende Alternative zu herkömmlichen In-vitro - und Tierversuchen herausgestellt. Hier beschreiben wir einen Open-Top-Organ-Chip (oder Open-Top-Chip), eine Plattform zur Modellierung organspezifischer Epithelgewebe, einschließlich Haut, Lunge und Darm. Dieser Chip bietet neue Möglichkeiten für die Rekonstruktion der multizellulären Architektur und Funktion von Epithelgeweben, einschließlich der Fähigkeit, eine 3D-Stromakomponente durch den Einbau gewebespezifischer Fibroblasten und Endothelzellen in ein mechanisch aktives System nachzubilden. Dieser Open-Top-Chip bietet ein noch nie dagewesenes Werkzeug für die Untersuchung von epithelialen/mesenchymalen und vaskulären Interaktionen auf verschiedenen Auflösungsskalen, von einzelnen Zellen bis hin zu mehrschichtigen Gewebekonstrukten, und ermöglicht so die molekulare Zerlegung der interzellulären Wechselwirkung epithelialisierter Organe in Gesundheit und Krankheit.

Einleitung

In der Vergangenheit haben sich Wissenschaftler bei der Arzneimittelforschung auf präklinische Tierversuche verlassen, aber eine wachsende Zahl dieser Methoden wurde aufgrund der schlechten Korrelation mit dem menschlichen Ergebnis in Frage gestellt1. Die Umsetzung der "3R"-Prinzipien zum Ersetzen, Reduzieren und Verfeinern von Tierversuchen drängt Wissenschaftler, neue alternative In-vitro-Methoden zu finden, um die präklinische Risikobewertung von Arzneimitteln und chemischer Toxikologiezu unterstützen 2. Vielen bisher entwickelten In-vitro-Modellen fehlt jedoch die biologische Architektur, die zelluläre Komplexität und die mechanische Umgebung, die erforderlich sind, um die dynamische Natur menschlicher lebender Organe zu rekapitulieren 3,4.

Konventionelle präklinische In-vitro-Systeme verwenden in der Regel 2D-Monokulturen menschlicher Zellen, die auf einer starren Kunststoffoberfläche gezüchtet werden. Diese Methoden bieten ein Werkzeug für die Durchführung einfacher mechanistischer Studien und ermöglichen ein schnelles Screening von Wirkstoffkandidaten. Aufgrund ihrer relativ geringen Kosten und hohen Robustheit werden 2D-Modelle häufig mit automatischen Hochdurchsatzsystemen kombiniert und zur schnellen Identifizierung potenzieller Wirkstoffkandidaten in der frühen Phase des Arzneimittelentwicklungsprozesses verwendet 5,6. Solche 2D-Modelle bieten jedoch keinen translationalen Ansatz zur Modellierung von Gewebe-, Organ- oder systemischen Reaktionen auf therapeutische Kandidaten, der für genaue Vorhersagen der Arzneimittelsicherheit und -wirksamkeit während der präklinischen Phase ihrer Entwicklung erforderlich ist. Flachzellkulturen rekapitulieren nicht die native Gewebemikroumgebung, einschließlich des komplexen multizellulären Zusammenspiels, der biomechanischen Eigenschaften und der dreidimensionalen (3D) Architektur menschlicher Gewebe7. Zellen, die auf einer flachen Oberfläche wachsen, erhalten oft keinen reifen Phänotyp und können daher nicht auf pharmakologische Reize reagieren, wie dies im nativen Gewebe der Fall wäre. Zum Beispiel weisen primäre menschliche Alveolarepithelzellen, die in vitro gezüchtet wurden, einen Plattenepitheltyp auf und verlieren wichtige phänotypische Marker, einschließlich der Tensidproteine C und B (SP-C und SP-B)8. Neben einer unzureichenden Differenzierung werden Primärzellen in vitro häufig unempfindlich gegenüber biologischen Stressoren, da bestimmte biochemische Signalwege, die mit Gewebeentzündungen assoziiert sind, funktionsunfähig werden9. Ein solcher Verlust der Zellfunktion scheint in erster Linie mit der Verwendung steifer Substrate sowie dem Mangel an löslichen Faktoren verbunden zu sein, die auf natürliche Weise von gewebespezifischen Stromazellen wie Lungenfibroblasten und glatten Muskelzellen freigesetzt werden10,11.

Das Verständnis, dass der Mangel an chemophysikalischer und biologischer Komplexität das physiologische Verhalten von Zellen in vitro einschränkt, hat die Entwicklung ausgefeilterer multizellulärer Modelle gefördert, die nachweislich die Komplexität des menschlichen Gewebes außerhalb des Körpers besser erfassen12,13. Seit der Entwicklung der ersten Co-Kulturmodelle in den frühen 1970er Jahren14 hat die Einführung synthetischer und natürlicher Hydrogele die Fähigkeit, native Gewebemikroumgebungen nachzuahmen, erheblich verbessert und ist zu einem unschätzbaren Werkzeug geworden, um die zelluläre Differenzierung voranzutreiben, die Selbstorganisation von Zellen in gewebeähnliche Strukturen zu lenken und native Gewebefunktionen wiederherzustellen15,16. Wenn menschliche Zellen beispielsweise im entsprechenden 3D-Gerüst gezüchtet werden, können sie sich selbst zu funktionellen Strukturen wie Sphäroiden oder Organoiden anordnen, Stammzellmarker exprimieren und sich selbst erneuern17. Im Gegensatz dazu altern menschliche Zellen (einschließlich Stammzellen), wenn sie auf herkömmlichen 2D-Substraten gezüchtet werden, schnell und durchlaufen nach wenigen Passagen eine Seneszenz18. Darüber hinaus können Hydrogele auf bestimmte Gewebeeigenschaften wie Porosität, Porengröße, Faserdicke, Viskoelastizität, Topographie und Steifigkeit "zugeschnitten" oder mit aus Gewebe gewonnenen zellulären Komponenten und/oder bioaktiven Molekülen weiterentwickelt werden, um eine Nachahmung der physiologischen oder pathologischen Bedingungen zu ermöglichen19,20. Trotz ihres enormen Potenzials für Arzneimitteltests rekapitulieren 3D-Hydrogel-basierte Modelle, die in der pharmazeutischen Forschung verwendet werden, die komplexe Zytoarchitektur des In-vivo-Gewebes nicht vollständig und es fehlen wichtige hämodynamische und mechanische Reize, die normalerweise im menschlichen Körper vorhanden sind, einschließlich hydrostatischem Druck, zyklischer Dehnung und Flüssigkeitsscherung21.

Mikrophysiologische Systeme (MPS) wie Organs-on-Chips (OOCs) haben sich in jüngster Zeit als Werkzeuge herausgestellt, die in der Lage sind, komplexe physiologische Reaktionen in vitro zu erfassen 22,23. Diese Modelle verwenden häufig mikrofluidische Plattformen, die die Modellierung der dynamischen Mikroumgebung lebender Organe ermöglichen.

Wir haben die Prinzipien des 3D-Gewebe-Bioengineerings und der Mechanobiologie kombiniert, um ein Open-Top-Chip-Modell von komplexem menschlichem Epithelgewebe zu erstellen. Dies ermöglichte es uns, die multizelluläre und dynamische Mikroumgebung des Epithelgewebes genau zu rekapitulieren. Dazu gehören gewebespezifische biochemische und biomechanische Hinweise, die natürlicherweise in lebenden Organen vorhanden sind, aber von herkömmlichen In-vitro-Modellen oft vernachlässigt werden24. Der Open-Top-Chip besteht aus zwei Kompartimenten: einem Gefäßkompartiment (Abbildung 1A) und einem Stromakompartiment (Abbildung 1B), die durch eine poröse Membran getrennt sind und die Diffusion von Nährstoffen zwischen den beiden Kammern ermöglichen (Abbildung 1C). Das Gefäßkompartiment ist einem kontinuierlichen Flüssigkeitsfluss ausgesetzt, um die physiologische Scherbelastung zu rekapitulieren, während das dehnbare Design der Stromakammer die Modellierung der mechanischen Belastung ermöglicht, die mit Atembewegungen oder Darmperistaltik verbunden ist. Das Stromakompartiment beherbergt das einstellbare 3D-Hydrogel-Gerüst, das das physiologische Wachstum gewebespezifischer Fibroblasten unterstützt. Es verfügt über einen abnehmbaren Deckel, der die Einrichtung einer Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche erleichtert, eine Bedingung, die eine bessere Nachahmung der menschlichen Physiologie von Schleimhautgeweben sowie einen direkten Zugang zum Gewebe für die Verabreichung von Medikamenten direkt auf die Epithelschicht ermöglicht. Ergänzende Abbildung 1 zeigt einige der Schlüsselkomponenten des Open-Top-Chip-Designs, einschließlich Abmessungen und biologischer Kompartimente (ergänzende Abbildung 1A-D) sowie die wichtigsten technischen Schritte, die in diesem Protokoll beschrieben sind (ergänzende Abbildung 1E).

Die Perfusion des Open-Top-Chips wird mit einer programmierbaren Peristaltikpumpe erreicht (Abbildung 1D). Der Aufbau der Peristaltikpumpe ermöglicht die gleichzeitige Perfundierung von 12 Open-Top-Chips. Die meisten Inkubatoren können zwei Setups beherbergen, so dass bis zu 24 Chips pro Inkubator kultiviert werden können. Die mechanische Streckung wird durch einen speziell angefertigten programmierbaren Vakuumdruckregler erreicht (Abbildung 1E). Es besteht aus einem elektropneumatischen Vakuumregler, der elektronisch von einem Digital-Analog-Wandler gesteuert wird. Mit anderen Worten, der elektropneumatische Vakuumregler erzeugt ein sinusförmiges Vakuumprofil mit einer vom Benutzer festgelegten Amplitude und Frequenz. Eine zyklische Dehnung von 0 % bis 15 % wird erzeugt, indem Unterdruck auf den Vakuumkanal des Open-Top-Chips mit einer Amplitude von 0 bis -90 kPa und einer Frequenz von 0,2 Hz ausgeübt wird. Es handelt sich um ein maßgeschneidertes System, das der kommerziell erhältlichen Flexcell-Dehnungseinheit entspricht, die zuvor verwendet und in anderen Veröffentlichungen25 beschrieben wurde. Um die mechanische Gewebeverformung nachzuahmen, die beispielsweise mit der Atembewegung der Lunge oder der Peristaltik des Darms verbunden ist, wendet der pneumatische Aktuator sinusförmige Vakuum-/Dehnungswellen an, deren Größe und Amplitude an das physiologische Belastungsniveau und die Frequenz angepasst werden können, die menschliche Zellen in ihrem nativen Gewebe erfahren.

Hier beschreiben wir eine effiziente und reproduzierbare Methode zur Entwicklung und Kultivierung organotypischer Epitheläquivalente auf einer prototypischen Open-Top-Chip-Plattform. Es ermöglicht die Erzeugung komplexer Organmodelle wie Haut, Alveole, Atemwege und Dickdarm unter gleichzeitiger Integration eines Gefäßflüssigkeitsflusses und mechanischer Dehnung. Wir werden die wichtigsten technischen Aspekte skizzieren, die bei der Umsetzung der Prinzipien des Tissue Engineering zur Erzeugung komplexer Epithelmodelle berücksichtigt werden müssen. Wir werden die Vorteile und möglichen Einschränkungen des aktuellen Designs diskutieren.

Einen Überblick über die wichtigsten Schritte zur Gewebe- und Organreifung, einschließlich der Fluss- und Dehnungsparameter, finden Sie in: Abbildung 2 für die Haut, Abbildung 3 für die Alveole, Abbildung 4 für die Atemwege und Abbildung 5 für den Darm. Weitere Informationen zur Zusammensetzung der Medien und zu den Reagenzien, die für die Kultivierung der verschiedenen Organmodelle verwendet werden, sind in den Ergänzungstabellen enthalten (Ergänzungstabelle 1 für die Haut; Ergänzende Tabelle 2 für die Alveole; Ergänzungstabelle 3 für die Atemwege und Ergänzungstabelle 4 für den Darm).

Protokoll

Humane Kolonoide wurden aus Darmresektionen gemäß den Richtlinien des Institutional Biosafety Committee des Cincinnati Children's Hospital (IBC 2017-2011) gewonnen.

1. Aktivierung der Oberfläche

  1. Vorbereitung des Aktivierungspuffers
    1. Legen Sie den Vernetzer und die Lösungsmittelpufferreagenzien unter die Biosicherheitswerkbank (BSC) und lassen Sie sie vor Gebrauch 10 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) äquilibrieren.
    2. Rekonstituieren Sie 5 mg Vernetzer in 5 ml des Lösungsmittelpuffers unter Verwendung eines sterilen, lichtundurchlässigen Behälters oder eines transparenten konischen 15-ml-Röhrchens, das in Aluminiumfolie eingewickelt ist, um die Vernetzerlösung vor direkter Lichteinwirkung zu schützen.
    3. Sprühen Sie die Lösung 1 Minute lang, um alle Klumpen zu entfernen, und pipettieren Sie dann 50 μl der Vernetzerlösung direkt in den unteren Kanal des Chips und 150 μl in die offene Kammer.
    4. Entfernen Sie überschüssige Vernetzungslösung mit einem Absauger von der Oberfläche des Chips. Dann pipettieren Sie weitere 50 μl der Vernetzungslösung direkt in den unteren Kanal des Chips und 150 μl in die offene Kammer, um die verbleibende Luftblase zu entfernen.
  2. Aktivierung mit UV-Vernetzungsmaschine
    1. Entfernen Sie vorsichtig den Deckel vom Chip unter dem BSC und bewahren Sie ihn in einem sterilen Behälter auf.
    2. Übertragen Sie die Späne mit der Vernetzerlösung in eine Petrischale, verschließen Sie die Petrischale, um eine Kontamination zu vermeiden, und stellen Sie die Schale mit den Spänen unter die UV-Vernetzungsmaschine.
      Anmerkungen: Entfernen Sie den Deckel der Petrischale, um die UV-Exposition zu maximieren.
    3. Stellen Sie die UV-Vernetzungsmaschine mit einer Spitzenwellenlänge von 365 nm auf eine Intensität von 100 μJ/cm2 ein und schalten Sie das UV-Licht für 20 min ein.
      Anmerkungen: Nach 20 Minuten UV-Behandlung sieht die Vernetzerlösung dunkler (braun) aus.
    4. Bringen Sie die Späne wieder unter den BSC und saugen Sie die oxidierte Vernetzerlösung ab. Spülen Sie dann alle Späne dreimal mit dem Lösungsmittelpuffer ab und lassen Sie die Späne 5-10 Minuten unter dem BSC trocknen, um die chemische Funktionalisierung der Polydimethylsiloxan-Oberfläche (PDMS) abzuschließen.

2. Vorbereitung des Stroma-Äquivalents

  1. Herstellung von 10x Rekonstruktionspuffer (100 mL)
    1. 2,2 g Natriumbicarbonat werden in 75 ml 0,067 M NaOH in doppelt destilliertem Wasser gelöst.
    2. Fügen Sie 4,76 g HEPES hinzu und bringen Sie das Volumen mit doppelt destilliertem Wasser auf 100 ml.
    3. Sterilfiltrieren Sie die Lösung unter dem BSC mit einem sterilen Einweg-Flaschenaufsatzfilter mit einer 0,22-μm-Membran.
      HINWEIS: Die Lösung ist bei Lagerung bei 4 °C ca. 6 Monate haltbar.
  2. Abschätzung des Volumens der Vorgellösung
    1. Multiplizieren Sie die Anzahl der für das Experiment benötigten Chips mit 150 μL (Innenvolumen der zentralen offenen Kammer), um die für das Experiment erforderliche Menge an Pre-Gel-Lösung abzuschätzen:
      Benötigtes Volumen = (Anzahl der Chips x 150) μL
    2. Bereiten Sie die Kollagen-Vorgellösung auf Eis vor, indem Sie Folgendes mischen: 1 Volumen 10x EMEM, das die Zellen Ihrer Wahl enthält, 1 Volumen 10-facher Rekonstruktionspuffer (siehe Schritt 2.1), 8 Volumen Kollagen-I-Lösung (10 mg/ml) und 1 μl 1 N NaOH-Lösung für jedes mg Kollagen I.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, ein zusätzliches Volumen von +15 % vorzubereiten, um experimentelle Fehler zu berücksichtigen. Das in Abschnitt 2.2 beschriebene Beispiel bietet eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Herstellung einer ausreichenden Vorgellösung für 12 Chips und zusätzliche 15 % Volumen.
  3. Herstellung von Pre-Gel-Lösung für das Stroma-Äquivalent (für 12 Chips)
    1. Bringen Sie die folgenden Lösungen unter die BSC auf Eis: 10x EMEM; 10x Rekonstruktionspuffer (siehe Schritt 2.1); Kollagen-I-Lösung (10 mg/ml); und sterile 1 N NaOH-Lösung.
    2. Kultur gewebespezifischer mesenchymaler Zellen nach Anweisung der Anbieter bis zu 80%-90% Konfluent und dissoziieren Sie dann die Zellen mit Trypsin oder anderen Methoden, die vom Zellanbieter empfohlen werden. Die Zellen werden in einem Pellet durch Zentrifugieren bei 250 x g für 5 min bei 24 °C gesammelt.
    3. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 225 μl eiskaltem 10x EMEM und fügen Sie 225 μl eiskalten 10x Rekonstruktionspuffer hinzu (siehe Schritt 2.1). Mischen Sie die Lösung, indem Sie vorsichtig auf und ab pipettieren, und fügen Sie dann 1.800 μl eiskalte Kollagen-I-Lösung hinzu.
    4. Pipettieren Sie 5-6 Mal auf und ab und vermeiden Sie Blasen, um die Pre-Gel-Lösung auf Eis zu mischen.
  4. Einbau des Stroma-Äquivalents auf Chip (für 12 Chips)
    1. Neutralisieren Sie die Pre-Gel-Lösung mit 18 μl 1 N NaOH. Mischen Sie vorsichtig, indem Sie 5-6 Mal auf und ab pipettieren und dann 150 μl zellbeladenes Hydrogel in die zentrale Kammer des Open-Top-Chips pipettieren, um Blasen zu vermeiden.
      HINWEIS: Wenn eine Mikrostrukturierung erforderlich ist, fahren Sie bitte mit dem nächsten Schritt (Abschnitt 3) fort.
    2. Gruppieren Sie die Chips in separate Petrischalen mit einer Zentrifugenröhrchenkappe, die mit 2 ml sterilem ddH 2 O in jeder Petrischale gefüllt ist, und inkubieren Sie die Petrischale(n) im Inkubator bei 37 °C, 5 % CO2.
      HINWEIS: Nach 90 Minuten ist das zellbeladene Hydrogel vollständig polymerisiert.

3. Mikrostrukturierung der Oberfläche (optional)

  1. Führen Sie eine Oberflächenmikrostrukturierung des Stroma-Hydrogels durch, nachdem Sie das neutralisierte Kollagen-Hydrogel (noch in seinem flüssigen Zustand) mit 3D-gedruckten Stempeln pipettiert haben.
    HINWEIS: Die 3D-gedruckten Stempel sind in verschiedenen anpassbaren Designs erhältlich, wie bereits an anderer Stelle24 beschrieben.
  2. Pipettieren Sie 20 μl der neutralisierten Kollagen-I-Vorgellösung auf die strukturierte Oberfläche eines sterilen 3D-gedruckten Stempels und führen Sie den Stempel in die (oben) der offenen Kammer ein, während das Stroma-Hydrogel noch in flüssiger Form vorliegt.
  3. Entfernen Sie alle Rückstände des Hydrogels, die von der Oberseite der offenen Kammer verschüttet werden könnten, mit einem Absauger (oder einer Pipette). Gruppieren Sie alle Chips in separate Petrischalen und legen Sie in jede Petrischale eine konische Zentrifugenkappe mit 15 ml konischem Röhrchen, die mit 2 ml sterilem ddH2O gefüllt ist.
  4. Inkubieren Sie alle Petrischale(n) 90 min lang bei 37 °C, 5 % CO2 , und bringen Sie dann die Chips wieder unter die BSC und entfernen Sie die Stempel vorsichtig mit einer Präzisionspinzette, um das Risiko einer Beschädigung des Hydrogels zu verringern.

4. Beschichtung der Epithel- und Gefäßoberfläche mit gewebespezifischen EZM-Proteinen

  1. Beschichtung der vaskulären mikrofluidischen Kammer mit Proteinen der extrazellulären Matrix
    1. Multiplizieren Sie die Anzahl der für das Experiment benötigten Chips mit 20 μl (Volumen des Gefäßkanals), um das für das Experiment erforderliche Volumen der vaskulären ECM-Beschichtungslösung abzuschätzen:
      Benötigtes Volumen = (Anzahl der Chips x 20) μL
      HINWEIS: Es wird empfohlen, ein zusätzliches Volumen von 15 % vorzubereiten, um experimentelle Fehler zu berücksichtigen.
    2. Bereiten Sie die vaskuläre ECM-Beschichtungslösung für alle Chips (z. B. 300 μl pro 12 Chips) mit eiskaltem PBS oder HBSS vor.
      ANMERKUNG: Beachten Sie die Tabelle mit den spezifischen Organprotokollen im Abschnitt "Ergänzende Materialien" (Ergänzende Tabelle 1 für die Haut; Ergänzende Tabelle 2 für die Alveole; Ergänzende Tabelle 2 für die Atemwege und Ergänzende Tabelle 4 für den Darm), um die spezifischen Reagenzien und die empfohlene EZM-Zusammensetzung zu identifizieren.
    3. Pipettieren Sie 20 μl vaskuläre ECM-Beschichtungslösung in den Gefäßkanal jedes Chips.
  2. Beschichtung der apikalen Oberfläche des Stroma-Äquivalents mit Proteinen der extrazellulären Matrix
    1. Multiplizieren Sie die Anzahl der für das Experiment benötigten Chips mit 50 μl (Volumen des Gefäßkanals), um das für das Experiment erforderliche Volumen der epithelialen ECM-Beschichtungslösung abzuschätzen:
      Benötigtes Volumen = (Anzahl der Chips x 50) μL
      HINWEIS: Es wird empfohlen, ein zusätzliches Volumen von 15 % vorzubereiten, um experimentelle Fehler zu berücksichtigen.
    2. Bereiten Sie genügend ECM-Beschichtungslösung für alle Chips (z. B. 750 μl pro 12 Chips) in eiskaltem PBS oder HBSS vor und übertragen Sie 50 μl epitheliale ECM-Beschichtungslösung direkt auf die Hydrogeloberfläche.
      ANMERKUNG: Beachten Sie die Tabelle mit den spezifischen Organprotokollen im Abschnitt "Ergänzende Materialien" (Ergänzende Tabelle 1 für die Haut; Ergänzende Tabelle 2 für die Alveole; Ergänzende Tabelle 2 für die Atemwege und Ergänzende Tabelle 4 für den Darm), um die spezifischen Reagenzien und die empfohlene EZM-Zusammensetzung zu identifizieren.
    3. Gruppieren Sie die Chips in separate Petrischale, einschließlich einer konischen Zentrifugenkappe mit 15 ml, die mit 2 ml sterilem ddH 2O in jeder Petrischale gefüllt ist, und inkubieren Sie die Petrischale(n) im Inkubator bei 37 °C, 5 % CO2 h lang, bevor Sie mit der Epithelzellaussaat fortfahren.

5. Aussaat von Epithelzellen auf das Stromaäquivalent

  1. Epithelzellkultur
    1. Kultur gewebespezifischer Epithelzellen nach Anweisung der Anbieter bis 80%-90% konfluent.
    2. Dissoziieren Sie die Zellen mit proteolytischen Enzymverfahren, wie vom Zellanbieter empfohlen.
      Anmerkungen: Die besten Ergebnisse erzielen Sie, wenn Sie Epithelzellen bei niedriger Passage (P1-P2) während der aktiven Wachstumsphase ernten, wenn sie eine Konfluenz zwischen 70 % und 90 % erreichen.
    3. Nach der Dissoziation zentrifugieren Sie die Zellen und sammeln sie als Pellet.
    4. Resuspendieren Sie die Epithelzellen auf die entsprechende Zell-/Fragmentdichte, wie in der spezifischen Organprotokolltabelle angegeben.
      HINWEIS: In dieser Studie wurde Zelllösung mit einer Dichte von 3 x 10 6 Zellen/ml für die Haut, 1 x 10 6 Zellen/ml für die Alveole, 6 x 10 6 Zellen/ml für die Atemwege und 8 x 10 6 Fragmente/ml für den Darm verwendet.
  2. Aussaat von Epithelzellen
    1. Übertragen Sie die Chips aus dem Inkubator in den BSC. Saugen Sie die Beschichtungslösung aus dem Gefäßkanal ab und spülen Sie den mikrofluidischen Gefäßkanal dreimal mit 50 μl frischem Endothelzellkulturmedium.
    2. Saugen Sie die Beschichtungslösung von der Hydrogeloberfläche ab und spülen Sie die Stromaoberfläche dreimal mit 100 μl frischem Epithelzellkulturmedium ab, um überschüssige Beschichtungslösung zu entfernen.
    3. Aspirieren Sie das aufsteigende Medium und besiedeln Sie die Hydrogeloberfläche mit 50 μl der Epithelzellsuspension bei entsprechender Zelldichte, wie in den ergänzenden Tabellen angegeben, und übertragen Sie die Chips dann für 2 h (oder über Nacht für Kolonoide) zurück in den Inkubator.
    4. Spülen Sie die Hydrogeloberfläche zweimal vorsichtig mit dem Zellkulturmedium ab, um Zellreste zu entfernen. Zum Schluss wird das Medium durch Autoklavieren in versiegelten autoklavierbaren Behältern aufgefrischt und die Chips an die Peristaltikpumpe angeschlossen.

6. Verbinden von Spänen mit dem Fluss

  1. Vorbereitung der fluidischen Teile
    1. Schneiden Sie 2 Zoll biokompatiblen Transferschlauch aus thermoplastischem Elastomer (TPE) auf Polypropylenbasis (TPE) (Materialtabelle) zu, um den kurzen mikrofluidischen Schlauch vorzubereiten, der für den Anschluss der Chips an die Medienbehälter erforderlich ist.
    2. Schneiden Sie 7,5 Zoll biokompatiblen TPE-Transferschlauch zu, um den langen mikrofluidischen Schlauch herzustellen.
    3. Bereiten Sie genügend 18-G- und 19-G-Metallverbinder vor (Materialtabelle).
      Anmerkungen: Es wird empfohlen, die in den Schritten 6.1.1 und 6.1.2 beschriebenen Schläuche und Anschlüsse mindestens 1 Tag vor dem Anschließen der Open-Top-Chips an die Peristaltikpumpen vorzubereiten und zu sterilisieren.
    4. Durchstechen Sie den Deckel jedes mittleren Reservoirs mit einer 4-Zoll-Injektionsnadel (Materialtabelle).
  2. Mittlere Entgasung
    1. Lassen Sie das Zellkulturmedium auf Raumtemperatur (RT) ausgleichen.
    2. Fördern Sie das benötigte Medium in ein konisches Filterrohr.
    3. Wenden Sie einen Unterdruck von -20 PSI an, um das Medium zu entgasen (vakuumgetriebene Filtration).
      Anmerkungen: Wenn kein Vakuum zur Verfügung steht, kann das Zellkulturmedium über Nacht im Inkubator im Gleichgewicht gelassen werden, um ähnliche Ergebnisse zu erzielen.
  3. Bereiten Sie den Open-Top-Chip für den Flüssigkeitsfluss vor
    1. Bringen Sie die Chips und die sterilen fluidischen Teile unter den BSC und richten Sie den Deckel (oberer Teil) des Open-Top-Chips aus, um den Open-Top-Chip-Prototyp abzudichten, bevor Sie den Flüssigkeitsfluss starten.
    2. Pipettieren Sie 200 μl des entgasten Zellkulturmediums (siehe organspezifische Tabellen) in die Einlassöffnung des oberen und unteren Kanals des Chips und achten Sie dabei auf die Vermeidung von Blasenbildung.
    3. Pipettieren Sie 300 μl des Nährmediums in den kurzen mikrofluidischen Schlauch, um die Innenfläche der Röhrchen zu grundieren, und verbinden Sie den kurzen Schlauch mit den Einlässen des oberen und unteren Kanals des Chips.
  4. Verbinden und grundieren Sie die mikrofluidischen Oberflächen
    1. Positionieren Sie die Mediumreservoirs im Farm-Rack, verbinden Sie die Injektionsnadel mit dem unteren Einlass der Chips und nehmen Sie schließlich alle Chips in den Gehäuseträgern im Inkubator auf.
    2. Schließen Sie die Chips an die Peristaltikpumpe an und überprüfen Sie dann alle Anschlüsse, um sicherzustellen, dass alle Chips richtig angeschlossen sind und keine sichtbaren Leckagen von Zellkulturmedien auftreten.
    3. Verwenden Sie die Spültaste an der Pumpe und halten Sie sie etwa 15 Sekunden lang gedrückt oder bis die Tröpfchen des Zellkulturmediums am Ende des Auslassschlauchs erscheinen.
    4. Verwenden Sie das Steuerungssystem an der Pumpe, um die entsprechende Durchflussrate zwischen Organchip und Chip einzustellen (Abbildung 2, Abbildung 3, Abbildung 4 und Abbildung 5).

7. Wartung der Späne

  1. Instandhaltung von Organchips
    1. Bereiten Sie frisches Zellkulturmedium für das Epithel und/oder Endothel vor und führen Sie die Entgasungsschritte durch (wie zuvor in Schritt 6.2 beschrieben).
    2. Halten Sie die Peristaltikpumpe an, trennen Sie die Späne vorsichtig von der Pumpe und entnehmen Sie den/die Chipgehäuseträger. Übertragen Sie die Späne aus dem Inkubator in den BSC und entfernen Sie das in den Behältern verbleibende Medienvolumen.
    3. Ersetzen Sie die Zellkulturmedien in den oberen und unteren Einlassbehältern durch 5 ml frisches Zellkulturmedium und setzen Sie den/die Chipgehäuseträger wieder in den Inkubator ein. Schließen Sie die Chips an die Peristaltikpumpe an und starten Sie den Durchfluss neu.
      Anmerkungen: Es wird empfohlen, die Spülfunktion zu verwenden, um das Medium schnell in das Gefäßkompartiment einzuspeisen und das Risiko von Luftblasen zu verringern.
    4. Wiederholen Sie die Schritte 7.1.1 bis 7.1.3 jeden zweiten Tag gemäß Abbildung 2, Abbildung 3, Abbildung 4 und Abbildung 5.
  2. Etablierung der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche (ALI)
    1. Halten Sie die Peristaltikpumpe an, trennen Sie die Späne vorsichtig von der Pumpe und entnehmen Sie den/die Chipgehäuseträger. Übertragen Sie die Chips aus dem Inkubator in die Biosicherheitswerkbank und entfernen Sie das verbleibende Volumen des Mediums in den oberen Behälter.
    2. Saugen Sie vorsichtig das gesamte Medium aus dem oberen mikrofluidischen Kanal ab und klemmen Sie den kurzen mikrofluidischen Schlauch, der mit den oberen Einlässen verbunden ist, mit Binderklammern fest, um die Verdunstung des Mediums und die Aufrechterhaltung von ALI zu reduzieren.
    3. Setzen Sie den Open-Top-Chip auf den/die Gehäuseträger(n) wieder in den Inkubator ein und schließen Sie die Chips wieder an die Peristaltikpumpe an.
      Anmerkungen: Es wird empfohlen, die Spülfunktion zu verwenden, um das Medium schnell in das Gefäßkompartiment einzuspeisen und das Risiko von Luftblasen zu verringern.
    4. Setzen Sie den Durchfluss fort, indem Sie die Peristaltikpumpe starten.
  3. Dehnen (optional)
    1. Halten Sie die Peristaltikpumpe an und verbinden Sie die Vakuumanschlüsse der Chips mit zwei langen Mikrofluidikschläuchen pro Chip mit dem Vakuummodul.
    2. Verwenden Sie das Vakuummodul, um die Dehnungseinstellung an die für jedes Organ empfohlene Bedingung anzupassen, wie in den Organprotokolltabellen angegeben: Ergänzende Tabelle 1 für die Haut; Ergänzende Tabelle 2 für die Alveole; Ergänzende Tabelle 2 für die Atemwege; und Ergänzungstabelle 4 für den Darm.
    3. Überprüfen Sie die Schlauchverbindungen visuell, um sicherzustellen, dass alle Chips richtig angeschlossen sind und keine sichtbaren Tropfen des Mediums tropfen.
    4. Setzen Sie den Durchfluss fort, indem Sie die Peristaltikpumpe starten.

8. Aussaat von Endothelzellen im Gefäßkompartiment

  1. Vorbereiten von Zellen und Chips für die Aussaat von Gefäßzellen
    1. Kultivieren Sie die gewebespezifischen Endothelzellen nach Anweisung der Anbieter, bis sie zu 80%-90% konfluieren. Dissoziieren Sie die Zellen mit einem proteolytischen Enzymverfahren (wie vom Anbieter empfohlen) und resuspendieren Sie schließlich die Endothelzellen in einer Lösung von 3 x 106 Zellen/ml.
      Anmerkungen: Die besten Ergebnisse erzielen Sie, wenn Sie die Endothelzellen während der aktiven Wachstumsphase bei niedriger Passage (P2-P4) ernten, wenn sie zwischen 70 % und 90 % Konfluenz erreichen.
    2. Halten Sie die Peristaltikpumpe an. Übertragen Sie die Chips aus dem Inkubator in den BSC, trennen Sie die Chips von den Medienbehältern und allen angeschlossenen Schläuchen und gruppieren Sie die Chips dann in separate Petrischalen .
    3. Das Zellkulturmedium des Epithelkompartiments wird mit frischem Epithelzellkulturmedium aufgefrischt. Spülen Sie den Gefäßkanal zweimal mit frischem Endothelzellkulturmedium und saugen Sie das Medium dann aus dem Gefäßkompartiment ab.
  2. Aussaat von Endothelzellen
    1. Besiedeln Sie den unteren (vaskulären) Kanal mit 25 μl Endothelzellsuspension (3 x 106 Zellen/ml) und drehen Sie die Chips auf den Kopf, damit sich Endothelzellen an der Oberseite der mikrofluidischen Kammer festsetzen können.
      HINWEIS: Fügen Sie 50 μl der Zellsuspension pro Chip hinzu (600 μl pro 12 Chips).
    2. Die Chips in Petrischalen gruppieren. Legen Sie sie bei 37 °C, 5 % CO2 wieder in den Inkubator und lassen Sie die Endothelzellen 1 h lang anhaften.
    3. Übertragen Sie die Chips nach 1 Stunde aus dem Inkubator in den BSC. Spülen Sie den Gefäßkanal zweimal mit Endothelzellkulturmedium, um Zelltrümmer zu entfernen.
    4. Wiederholen Sie die Schritte 8.2.1-8.2.2, um den Gefäßkanal erneut mit Endothelzellen zu besiedeln, und legen Sie die Chips flach auf, um die Adhäsion der Endothelzellen an der Unterseite des Gefäßkanals zu erleichtern.
  3. Schließen Sie den Chip wieder an den Fluss an
    1. Füllen Sie den Behälter des Gefäßmediums mit dem entgasten Gefäßzellkulturmedium unter dem BSC.
    2. Legen Sie die Chips wieder in den/die Chipgehäuseträger(s) und verbinden Sie die Chips wieder mit den Mediumbehältern an einem Ende mit der Peristaltikpumpe am anderen Ende.
      Anmerkungen: Es wird empfohlen, die Spülfunktion zu verwenden, um das Medium schnell in das Gefäßkompartiment einzuspeisen und das Risiko von Luftblasen zu verringern.
    3. Überprüfen Sie die mikrofluidischen Verbindungen visuell, um sicherzustellen, dass alle Chips richtig angeschlossen sind und keine sichtbaren Tropfen des Mediums vorhanden sind. Setzen Sie dann den Flüssigkeitsfluss wieder ein, indem Sie die Peristaltikpumpe starten.

9. Gängige Endpunkt-Assays

  1. Trennen von Chips für Endpunkt-Assays
    1. Halten Sie die Peristaltikpumpe an, trennen Sie die Späne vorsichtig von der Pumpe und entnehmen Sie den/die Chipgehäuseträger. Übertragen Sie den/die Chipgehäuseträger(s) aus dem Inkubator in den BSC und setzen Sie die Chips frei.
    2. Waschen Sie die zentrale Kammer des Open-Top-Chips vorsichtig zweimal mit dem Epithelzellkulturmedium und den Gefäßkanal mit dem Endothelkulturmedium, um Zellreste zu entfernen.
    3. Entfernen Sie den Deckel des Open-Top-Chips, um mit einer Pinzette an das apikale Fach des Chips zu gelangen.
  2. Immunfärbung für die Fluoreszenzmikroskopie
    1. Fahren Sie mit der konventionellen Probenfixierung, Permeabilisierung und Blockierung fort.
      HINWEIS: In dieser Studie wurden die Proben 1 h lang in 200 μl 4 % Paraformaldehyd (PFA) fixiert, gefolgt von einer Spülung mit PBS, einer Permeabilisierung in 0,1 % Triton X-100 für 40 min und einer Blockierung in 1 % Rinderserumalbumin für 1 h.
    2. Inkubieren Sie die Chips mit Primärantikörpern (Materialtabelle) bei 4 °C über Nacht. und waschen Sie dann sowohl die epithelialen als auch die endothelialen Kompartimente der Chips zweimal mit 200 μl PBS. Fahren Sie dann 2 h lang mit den entsprechenden Sekundärantikörpern fort.
      HINWEIS: Verdünnen Sie die Primärantikörper und Sekundärantikörper in PBS + 1% BSA in einer Verdünnung von 1:100 (Primärantikörper) und 1:200 (Sekundärantikörper).
  3. Immunhistochemie
    1. Extrahieren Sie die stromalen Äquivalente mit einer Pinzette aus der Hauptkammer des Open-Top-Chips, sammeln Sie sie in einem 1,5-ml-Röhrchen, das mit 10 % neutralem, gepuffertem Formalin gefüllt ist, und inkubieren Sie sie mindestens 24 h lang.
    2. Übertragen Sie das fixierte Stromaäquivalent auf den Gewebeprozessor und befolgen Sie die folgenden Schritte, um eine optimale Probendehydrierung zu erreichen.
      1. Tauchen Sie das Hydrogel 90 Minuten lang in 70%iges Ethanol.
      2. Entfernen Sie das 70%ige Ethanol und tauchen Sie das Hydrogel 90 Minuten lang in 80%iges Ethanol.
      3. Entfernen Sie das 80%ige Ethanol und tauchen Sie das Hydrogel 90 Minuten lang in 95%iges Ethanol.
      4. Entfernen Sie das 95%ige Ethanol und tauchen Sie das Hydrogel zweimal 90 Minuten lang in 100%iges Ethanol.
      5. Entfernen Sie das 100%ige Ethanol und tauchen Sie das Hydrogel zweimal für 120 Minuten in eine Xylollösung.
      6. Entfernen Sie die Xylollösung und infiltrieren Sie die verarbeiteten Stromaäquivalente zweimal für 120 min (~2 h) in Paraffinwachs.
    3. Betten Sie die infiltrierten Stromaäquivalente in Schnittparaffinblöcke ein.
    4. An dieser Stelle können die Stromaäquivalente mit Hilfe eines Mikrotoms als Paraffinblöcke geschnitten und nach konventionellen histologischen Techniken verarbeitet werden26.

Ergebnisse

Mikrostrukturierung von Oberflächen
Die Mikrostrukturierung der extrazellulären Matrix (EZM) kann verwendet werden, um die räumliche Konfiguration der intestinalen Kryptenschnittstelle zu replizieren. Die Open-Top-Chip-Konfiguration kann modifiziert werden, um mikrostrukturierte Stempel zu integrieren, die speziell entwickelt wurden, um die natürliche Topographie der Dickdarmepithel-Stroma-Grenzfläche (Abbildung 6A, B) und der Darmkrypten im Mikromet...

Diskussion

Der Open-Top-Chip stellt eine Plattform dar, um das komplexe zelluläre Zusammenspiel zwischen Endothel, Stroma und Epithel in einer kontrollierten Mikroumgebung in Echtzeit zu untersuchen. Diese Technologie bietet entscheidende Vorteile gegenüber herkömmlichen organotypischen und organoiden Kulturen, wie z. B. die Integration physikalischer und biochemischer Signale, die für die Rekonstruktion der Mikroumgebung des menschlichen Gewebes relevant sind, einschließlich fluidischer Scherung (Strömung), zyklischer Dehnun...

Offenlegungen

Die Autoren geben die folgenden finanziellen Interessen/persönlichen Beziehungen an, die als potenzielle Interessenkonflikte angesehen werden können: Varone Antonio ist ein ehemaliger Mitarbeiter von Emulate Inc. und kann eine Kapitalbeteiligung an Emulate halten.

Danksagungen

Nichts

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
10x EMEM Lonza12-684FMedium; Stroma
18 Gauge needleMicroGroup316H18RWTube stainless steel 316 welded, 18RW Full Hard 
19 Gauge needleMicroGroup316H19RWTube stainless steel 316 welded, 19RW Full Hard
2-Stop PharMed BPT Cole-Palmer EW-95723-12Tube, 0.25 mm, 12/pack
70% ethanol and wipes  -  - For surface sterilization 
8-Bromoadenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt (8-Br-cAMP)SigmaB7880Medium supplement 
A-83-01 Tocris 2939
AdenineSigmaA9795
Advanced DMEM/F12 Thermo12634010
Airway Epithelial CellsLifeline Cell TechnologyFC-0016
Aluminum foil  -  -  -
Alveolar cellsCell BiologicsH6621
Anti-ABCA3  ABCAM ab24751 Mouse monoclonal antibody [3C9] 
Anti-Aquaporin5 Alexa Fluor 647 ABCAM ab215225  Rabbit monoclonal antibody [EPR3747]  
Anti-Aquaporin5 ABCAM ab92320 Rabbit monoclonal antibody [EPR3747] 
Anti-beta IV Tubulin  ABCAM ab11315 Mouse monoclonal antibody [ONS.1A6] 
Anti-CD31 (PECAM-1) ABCAM ab9498 Mouse monoclonal [JC/70A] antibody  
Anti-CK5  ABCAM ab75869 Rabbit recombinant monoclonal [AY1E6] 
Anti-Cytokeratin 10  ThermoFisher MA5-13705 Mouse monoclonal antibody (DE-K10) 
Anti-Cytokeratin 14  ABCAM ab7800 Mouse monoclonal antibody 
Anti-E-Cadherin  ABCAM ab1416  Mouse monoclonal antibody 
Anti-Filaggrin  ThermoFisher PA5-79267 Rabbit polyclonal antibody  
Anti-HTI-56 Terrace Biotech TB-29AHT1-56  Mouse monoclonal antibody (IgG1) 
Anti-HTII-280 Terrace Biotech TB-27AHT2-280 Mouse monoclonal antibody (IgM) 
Anti-Involucrin  ThermoFisher MA5-11803 Mouse monoclonal antibody (SY5) 
Anti-Isoforms TA p63-α, -β, -γ  Biolengend 618902 Rabbit polyclonal antibody  
Anti-Ki67  ABCAM ab8191 Mouse monoclonal antibody [B126.1] 
Anti-LAMP3  ABCAM ab111090 Rabbit polyclonal antibody 
Anti-Mature SP-B Seven Hill WRAB-48604 Rabbit polyclonal antibody 
Anti-MUC5AC  ThermoFisher PA5-34612 Rabbit polyclonal antibody  
Anti-Mucin-2 SantaCruz Biotechnologysc-7314Mouse monoclonal antibody (IgG1) 
Anti-p63  Dako GA662 Mouse monoclonal antibody p63 Protein (Dako Omnis) Clone DAK-p63 
Anti-PCNA  ThermoFisher PA5-32541 Rabbit polyclonal antibody  
Anti-Podoplanin (AT-1α)  ABCAM ab128994 Rabbit polyclonal antibody 
Anti-Pro + Mature Surfactant Protein B ABCAM ab40876 Rabbit polyclonal antibody 
Anti-Surfactant C   Seven Hill  WRAB-9337  Rabbit polyclonal antibody 
Anti-Uteroglobin/SCGB1A1 Hycult Biotech HM2178 Mouse monoclonal antibody [AY1E6] 
Anti-VE-cadherin  ABCAM ab33168 Rabbit polyclonal antibody  
Anti-ZO-1  ThermoFisher 33-9100 Mouse monoclonal antibody [1A12] 
Ascorbic acidSigmaA4544
Aspirating pipettes Corning / Falcon 357558 2 mL, polystyrene, individually wrapped 
Aspirating tips  -  - Sterile (autoclaved) 
B27Thermo17504044
Blocker BSA (10X) in PBS solution  ThermoFisher 37525 Blocker agent 
Calcium ChlorideSigmaC7902
CHIR 99021Tocris4423
Collagen IAdvanced Biomatrix513310 mg/mL (Stroma)
Collagen I Advanced BioMatrix50053 mg/mL (Vascular ECM)
Collagen IVSigma C5533
Collagen-IVSigma C5533-5MG Collagen from human placenta, 5 mg powder, reconstitute to 1 mg/mL 
Colonic Fibroblasts Cell Biologics H6231
Colonic microvascular endothelial cells Cell BiologicsH6203 
Conical tubes   -  - 15 mL and 50 mL polypropylene, sterile 
Crosslinker (ER-1) Emulate 104615 mg powder 
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)  ThermoFisher D3571 DNA probe 
Dermal fibroblastsATCCPCS-201-010
Dermal microvascular endothelial cellsATCCCRL-3243
DexamethasoneSigmaD4902
DMEMThermoFisher11054020
DMEM/F-12 GIBCO 11320082
DMEM/F-12, GlutaMAX  GIBCO 10565-018 Basal medium for ALI medium 
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488)  ABCAM ab150105 Donkey Anti-Mouse secondary antibody  
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 568)  ABCAM ab175472 Donkey Anti-Mouse secondary antibody 
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647)  ABCAM ab150107 Donkey Anti-Mouse secondary antibody 
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488)  ABCAM  ab150073 Donkey Anti-Mouse secondary antibody 
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 568)  ABCAM ab175470 Donkey Anti-Mouse secondary antibody 
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 647)  ABCAM ab150075 Donkey Anti-Mouse secondary antibody 
Dulbecco’s PBS (DPBS-/-) (without Ca2+, Mg2+) Corning 21-031-CV 1x 
Epidermal Growth Factor (EGF) human, recombinant in E. coliPromoCellC-60170Medium supplement 
F-12 Ham’sInvitrogen 21700-108For vascular ECM
FibriCol Advanced BioMatrix 5133-20ML Collagen-I solution (10 mg/mL)
FibronectinCorning356008
Fibronectin, Human, Natural,  Corning 47743-654 human plasma fibronectin 
Fine-tip precision tweezers Aven18056USA Technik Style 5B-SA Precision Stainless Steel Tweezers
GlutamaxInvitrogen 21700-108
Glutamax Invitrogen 35050061
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 594)  ABCAM ab150080 Goat Anti-Mouse secondary antibody  
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647)  ABCAM ab150115 Goat Anti-Mouse secondary antibody  
Goat Anti-Mouse IgG H&L (FITC)  ABCAM ab6785 Goat Anti-Mouse secondary antibody  
Goat Anti-Mouse IgG1 Alexa Fluor 568  ThermoFisher A-21124 Goat Anti-Mouse IgG1 secondary antibody 
Goat Anti-Mouse IgM Alexa Fluor 488  ThermoFisher A-21042 Goat Anti-Mouse IgM secondary antibody 
Handheld vacuum aspirator Corning 4930  - 
Heat Inactivated HyClone FetalClone II Serum (FCS) GE Healthcare Life SciencesSH30066.03
Hemocytometer  -  - - 
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosaSigmaH3149
HEPESThermo15630080
Human [Leu15] - Gastrin SigmaG9145
Human colonoidsObtained from clinical resectionsObtained from clinical resections
Human EGF Recombinant Protein ThermoPHG0311L
human epithelial growth factor Thermo PHG0311
HyClone FetalClone II Serum (U.S.)  GE Healthcare SH30066.02HI  Sterile FBS heat-inactivated 
Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium saltSigmaH4881
Hydrocortisone PromoCell  C-64420 Medium supplement  
Ice bucket  -  -  - 
Ismatec IPC-N Cole-PalmerEW-78000-41Low-Speed Digital Peristaltic Pump; q24-Channel (1 per 12 Chips)
ITESBioWhittaker17-839Z
Keratinocyte Growth Factor (KGF), also known as Basic Fibroblast Growth Factor 7 (FGF-7), human, recombinant in HEKPromoCellC-63821
KeratinocytesATCCPCS-200-010
Laminin BiolaminaCT521-0501 
Laminin, 521 CTG (CT521) Biolamina  CT521-0501 human recombinant laminin 521    
Lung FibroblastCell BiologicsH6013
Lung FibroblastLifeline Cell TechnologyFC-0049
Lung microvascular endothelial cellsLonzaCC-2527
Lung smooth muscle cellsLifeline Cell TechnologyFC-0046
Manual counter  -  -  -
Masterflex (TPE) Transfer Tubing Cole-PalmerFV-96880-02PharMed BPT, 1/32" ID x 5/32" OD
Medium 199, no phenol redThermo 11043023
Microcentrifuge tube  -   -  1.5 mL, sterile 
Microscope (with camera)  -  - For bright-field imaging 
N2Sigma17502001
N-acetyl cysteineSigmaA5099
Noggin (HEK293T conditioned medium)SigmaN17001
Normal Goat Serum  ThermoFisher 50062Z Blocking solution  
O-phosphosrylethanolamine SigmaP0503
Paraformaldehyde (4% wt/vol)  EMS 15710 Fixing agent 
Penicillin StreptomycinGIBCO15140122
Penicillin-streptomycin Sigma P4333 10,000 U/mL; 10 mg/mL 
Pipette tips   -  - P20, P200, and P1000 sterile, low adhesion
Pipette Gilson  F167380 P20, P200, and P1000 
PluriQ Serum Replacement (or alternatively KO Serum replacement)AMSBIO (or Thermo)N/A (or C1910828010)
Poly-L-Lysine coated microscope glass slides  Sigma P0425 Glass slides 
PrimocinInvivoGenant-pm-1
ProgesteroneSigmaP8783
ProLong Gold  ThermoFisher P36931 Antifade Mountant with DAPI 
Retinoic Acid SigmaR2625
ROCK inhibitor (Y27632)TocrisTB1254-GMP/10
R-spondin (HEK293T conditioned medium)SigmaSCC111
SAGM SingleQuots supplements LonzaCC-4124
SAGMTM Small Airway Epithelial Cell Growth medium BulletKitTM Lonza CC-4124 Medium supplements 
SB2001190 Tocris 1264/10
Serological pipettes  -  - 2 mL, 5 mL, 10 mL, and 25 mL low endotoxin, sterile 
Small Airway Epithelial Cell Growth medium (SAGM)Lonza CC-4124 
Solvent Buffer (ER-2) Emulate 1046225 mL bottle 
Steriflip-HV MilliporeSE1M003M00Sterile filtering conical tube
Sterilin 100 mm Square Petri DishesThermo103Sterile, 1 per 6 chips 
T25 flasks  -  -  -
T75 flasks  -  -  - 
Tri-iodothyronineSigmaT5516
Triton X-100 (0.3% (vol/vol)  Sigma T8787 Permeabilization agent 
Trypan blue Sigma 93595 0.4% solution 
TrypEE solution Sigma 12604013 Cell detaching solution 
TWEEN-20 Sigma P2287 Permeabilization agent 
UV Light Oven (peak frequency 365nm, intensity of 100 µJ/cm2)VWR21474-598UVP, Long Range UV, 365 nm 60Hz Model CL-1000L
Vacuum set-up  -  - Minimum pressure: -70 kPa 
Vascular Endothelial Growth Factor 165 (VEGF-165) human, recombinant in E. coliPromoCellC-64420
VEGF-165  PromoCell  C-64420 Medium supplement 
Von Willebrand Factor conjugated FITC  ABCAM ab8822 Sheep polyclonal antibody 
Water bath (or beads)  -  - Set to 37 °C 
Wnt3A (L-Wnt3A conditioned medium)ATCCCRL-2647

Referenzen

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