Ricostituzione della citoarchitettura e della funzione dei tessuti epiteliali umani su un chip d'organo open-top

Riepilogo

Il presente protocollo descrive le capacità e le modalità di coltura essenziali dell'Open-Top Organ-Chip per il successo della creazione e della maturazione di colture organo-on-chip a tutto spessore di tessuti primari (pelle, alveolo, vie aeree e intestino), fornendo l'opportunità di indagare diversi aspetti funzionali dell'interfaccia di nicchia epiteliale/mesenchimale e vascolare umana in vitro.

Abstract

Quasi tutti gli organi umani sono rivestiti con tessuti epiteliali, comprendenti uno o più strati di cellule strettamente collegate organizzate in strutture tridimensionali (3D). Una delle funzioni principali degli epiteli è la formazione di barriere che proteggono i tessuti sottostanti da insulti fisici e chimici e agenti infettivi. Inoltre, gli epiteli mediano il trasporto di nutrienti, ormoni e altre molecole di segnalazione, spesso creando gradienti biochimici che guidano il posizionamento cellulare e la compartimentazione all'interno dell'organo. A causa del loro ruolo centrale nel determinare la struttura e la funzione degli organi, gli epiteli sono importanti bersagli terapeutici per molte malattie umane che non sono sempre catturate dai modelli animali. Oltre alle ovvie differenze tra specie, condurre studi di ricerca sulla funzione barriera e sulle proprietà di trasporto degli epiteli negli animali è ulteriormente aggravato dalla difficoltà di accedere a questi tessuti in un sistema vivente. Mentre le colture cellulari umane bidimensionali (2D) sono utili per rispondere a domande scientifiche di base, spesso producono scarse previsioni in vivo . Per superare questi limiti, nell'ultimo decennio, una pletora di piattaforme biomimetiche microingegnerizzate, note come organs-on-a-chip, sono emerse come una promettente alternativa ai tradizionali test in vitro e sugli animali. Qui, descriviamo un Open-Top Organ-Chip (o Open-Top Chip), una piattaforma progettata per modellare tessuti epiteliali specifici dell'organo, tra cui pelle, polmoni e intestino. Questo chip offre nuove opportunità per ricostituire l'architettura multicellulare e la funzione dei tessuti epiteliali, compresa la capacità di ricreare una componente stromale 3D incorporando fibroblasti tessuto-specifici e cellule endoteliali all'interno di un sistema meccanicamente attivo. Questo Open-Top Chip fornisce uno strumento senza precedenti per studiare le interazioni epiteliali/mesenchimali e vascolari a più scale di risoluzione, dalle singole cellule ai costrutti tissutali multistrato, consentendo così la dissezione molecolare della diafonia intercellulare degli organi epitelializzati in salute e malattia.

Introduzione

Storicamente, gli scienziati hanno fatto affidamento sulla sperimentazione animale preclinica per la scoperta di farmaci, ma un numero crescente di questi metodi è stato messo in discussione a causa della scarsa correlazione con il risultato umano¹. L'attuazione dei principi delle "3R" per sostituire, ridurre e perfezionare la sperimentazione animale esorta gli scienziati a trovare nuovi metodi alternativi in vitro per supportare la valutazione preclinica del rischio tossicologico e chimicologico². Tuttavia, molti modelli in vitro sviluppati fino ad oggi mancano dell'architettura biologica, della complessità cellulare e dell'ambiente meccanico necessari per ricapitolare la natura dinamica degli organi viventi umani ^3,4.

I sistemi preclinici convenzionali in vitro impiegano tipicamente monocolture 2D di cellule umane coltivate su una superficie plastica rigida. Questi metodi forniscono uno strumento per condurre semplici studi meccanicistici e consentono un rapido screening dei farmaci candidati. A causa del loro costo relativamente basso e dell'elevata robustezza, i modelli 2D sono spesso abbinati a sistemi automatici ad alta produttività e utilizzati per la rapida identificazione di potenziali candidati farmaci durante la fase iniziale del processo di sviluppo del farmaco ^5,6. Tuttavia, tali modelli 2D non forniscono un approccio traslazionale per la modellazione delle risposte a livello tissutale, a livello di organo o sistemiche ai candidati terapeutici, che è necessario per previsioni accurate della sicurezza e dell'efficacia dei farmaci durante la fase preclinica del loro sviluppo. Le colture cellulari piatte non ricapitolano il microambiente tissutale nativo, compresa la complessa interazione multicellulare, le proprietà biomeccaniche e l'architettura tridimensionale (3D) dei tessuti umani⁷. Le cellule che crescono su una superficie piana spesso non acquisiscono un fenotipo maturo e, quindi, non possono rispondere agli stimoli farmacologici come farebbero nel tessuto nativo. Ad esempio, le cellule epiteliali alveolari umane primarie coltivate in vitro mostrano un fenotipo squamoso e perdono marcatori fenotipici chiave, comprese le proteine tensioattive C e B (SP-C e SP-B)⁸. Oltre all'insufficiente differenziazione, le cellule primarie diventano spesso insensibili ai fattori di stress biologici in vitro, poiché alcuni percorsi biochimici associati all'infiammazione dei tessuti diventano non funzionali⁹. Tale perdita della funzione cellulare sembra essere principalmente associata all'uso di substrati rigidi e alla mancanza di fattori solubili rilasciati naturalmente dalle cellule stromali tessuto-specifiche come i fibroblasti polmonari e le cellule muscolari lisce^10,11.

Comprendere che la mancanza di complessità chemio-fisica e biologica limita il comportamento fisiologico delle cellule in vitro ha favorito lo sviluppo di modelli multicellulari più sofisticati, che hanno dimostrato di catturare meglio la complessità dei tessuti umani al di fuori del corpo^12,13. Dalla creazione dei primi modelli di co-coltura nei primi anni 1970¹⁴, l'introduzione di idrogel sintetici e naturali ha migliorato significativamente la capacità di imitare i microambienti tissutali nativi ed è diventato uno strumento inestimabile per guidare la differenziazione cellulare, guidare l'auto-organizzazione delle cellule in strutture simili ai tessuti e il ripristino delle funzioni tissutali native^15,16. Ad esempio, se coltivate nell'appropriata impalcatura 3D, le cellule umane possono auto-organizzarsi in strutture funzionali come sferoidi o organoidi, esprimendo marcatori di cellule staminali, e sono in grado di auto-rinnovarsi¹⁷. Al contrario, le cellule umane (comprese le cellule staminali), se coltivate su substrati 2D tradizionali, invecchiano rapidamente e subiscono la senescenza dopo pochi passaggi¹⁸. Inoltre, gli idrogel possono essere "personalizzati" per adattarsi a specifiche proprietà del tessuto come porosità, dimensione dei pori, spessore delle fibre, viscoelasticità, topografia e rigidità o ulteriormente ingegnerizzati con componenti cellulari derivati dai tessuti e / o molecole bioattive che consentono l'emulazione delle condizioni fisiologiche o patologiche^19,20. Nonostante il loro enorme potenziale per i test farmacologici, i modelli 3D basati sull'idrogel utilizzati nella ricerca farmaceutica non riassumono completamente la complessa citoarchitettura dei tessuti in vivo e mancano di importanti stimoli emodinamici e meccanici normalmente presenti nel corpo umano, tra cui pressione idrostatica, allungamento ciclico e taglio dei fluidi²¹.

I sistemi microfisiologici (MPS) come gli Organs-on-chip (OOC) sono recentemente emersi come strumenti in grado di catturare risposte fisiologiche complesse in vitro^22,23. Questi modelli utilizzano spesso l'uso di piattaforme microfluidiche, che consentono la modellazione del microambiente dinamico degli organi viventi.

Abbiamo combinato i principi della bioingegneria tissutale 3D e della meccanobiologia per creare un modello Open-Top Chip di tessuto epiteliale umano complesso. Questo ci ha permesso di ricapitolare da vicino il microambiente multicellulare e dinamico dei tessuti epiteliali. Ciò include segnali biochimici e biomeccanici specifici del tessuto naturalmente presenti negli organi viventi, ma spesso trascurati dai tradizionali modelli in vitro ²⁴. L'Open-Top Chip incorpora due compartimenti: un compartimento vascolare (Figura 1A) e un compartimento stromale (Figura 1B) separati da una membrana porosa, consentendo la diffusione dei nutrienti tra le due camere (Figura 1C). Il compartimento vascolare è esposto a flusso continuo di fluido per ricapitolare lo stress fisiologico di taglio, mentre il design estensibile della camera stromale consente di modellare la tensione meccanica associata ai movimenti respiratori o alla peristalsi intestinale. Il compartimento stromale ospita l'impalcatura idrogel 3D sintonizzabile progettata per supportare la crescita fisiologica dei fibroblasti tessuto-specifici. Possiede un coperchio rimovibile che facilita l'istituzione di un'interfaccia aria-liquido, una condizione che consente una maggiore emulazione della fisiologia umana dei tessuti della mucosa e l'accesso diretto al tessuto per la somministrazione di farmaci direttamente sullo strato epiteliale. La Figura 1 supplementare cattura alcuni dei componenti chiave del progetto Open-Top Chip, comprese le dimensioni e i compartimenti biologici (Figura supplementare 1A-D), nonché le principali fasi tecniche descritte in questo protocollo (Figura supplementare 1E).

La perfusione del chip Open-Top si ottiene con una pompa peristaltica programmabile (Figura 1D). La configurazione della pompa peristaltica consente di eseguire contemporaneamente 12 chip Open-Top. La maggior parte degli incubatori può ospitare due configurazioni che consentono la coltura di un massimo di 24 chip per incubatore. Lo stretching meccanico è ottenuto utilizzando un regolatore di pressione del vuoto programmabile su misura (Figura 1E). È costituito da un regolatore di vuoto elettropneumatico controllato elettronicamente da un convertitore digitale-analogico. In altre parole, il regolatore di vuoto elettropneumatico genera un profilo di vuoto sinusoidale con un'ampiezza e una frequenza determinate dall'utente. La deformazione ciclica compresa tra 0% e 15% viene generata applicando una pressione negativa al canale del vuoto del chip Open-Top ad un'ampiezza compresa tra 0 e -90 kPa e una frequenza di 0,2 Hz. Si tratta di un sistema su misura equivalente all'unità di deformazione Flexcell disponibile in commercio precedentemente adottata e descritta in altri documenti²⁵. Per imitare la deformazione meccanica del tessuto associata, ad esempio, al movimento respiratorio del polmone o alla peristalsi dell'intestino, l'attuatore pneumatico applica onde sinusoidali di vuoto/deformazione la cui grandezza e ampiezza possono essere regolate per corrispondere al livello fisiologico di deformazione e frequenza che le cellule umane sperimentano nel loro tessuto nativo.

Qui, descriviamo un metodo efficiente e riproducibile per ingegnerizzare e coltivare equivalenti di epitelio organotipico su una piattaforma prototipo Open-Top Chip. Consente la generazione di modelli di organi complessi come pelle, alveolo, vie aeree e colon, integrando un flusso di fluido vascolare e uno stretching meccanico. Descriveremo gli aspetti tecnici chiave che devono essere considerati durante l'implementazione dei principi dell'ingegneria tissutale per la generazione di modelli epiteliali complessi. Discuteremo i vantaggi e le possibili limitazioni del design attuale.

Una panoramica delle principali fasi utilizzate per ottenere la maturazione dei tessuti e degli organi, compresi i parametri di flusso e allungamento, è riportata in: Figura 2 per la pelle, Figura 3 per l'alveolo, Figura 4 per le vie aeree e Figura 5 per l'intestino. Ulteriori informazioni sulla composizione dei mezzi e sui reagenti utilizzati per la coltura dei diversi modelli di organi sono incluse nelle tabelle supplementari (Tabella supplementare 1 per la pelle; Tabella supplementare 2 per l'alveolo; Tabella supplementare 3 per le vie aeree e Tabella supplementare 4 per l'intestino).

Protocollo

I colonoidi umani sono stati ottenuti da resezioni intestinali in conformità con le linee guida del Comitato istituzionale per la biosicurezza dell'ospedale pediatrico di Cincinnati (IBC 2017-2011).

1. Attivazione della superficie

1. Preparazione del buffer di attivazione
   1. Posizionare il reticolante e i reagenti tampone solvente sotto l'armadio di biosicurezza (BSC) e lasciarli equilibrare a temperatura ambiente (RT) per 10 minuti prima dell'uso.
   2. Ricostituire 5 mg di reticolante in 5 mL del tampone solvente utilizzando un contenitore sterile impermeabile alla luce o un tubo conico trasparente da 15 mL avvolto in un foglio di alluminio per proteggere la soluzione reticolante dall'esposizione diretta alla luce.
   3. Vortice la soluzione per 1 minuto per rimuovere tutti i grumi, quindi pipettare 50 μL della soluzione reticolante direttamente nel canale inferiore del chip e 150 μL nella camera aperta.
   4. Rimuovere qualsiasi eccesso di soluzione reticolante dalla superficie del chip utilizzando un aspiratore. Quindi pipettare ulteriori 50 μL della soluzione reticolante direttamente nel canale inferiore del chip e 150 μL nella camera aperta per rimuovere eventuali bolle d'aria rimanenti.
2. Attivazione con macchina reticolante UV
   1. Rimuovere delicatamente il coperchio dal chip sotto il BSC e conservarlo in un contenitore sterile.
   2. Trasferire i trucioli contenenti la soluzione reticolante in una capsula di Petri, chiudere la capsula di Petri per evitare la contaminazione e posizionare la capsula con i trucioli sotto la macchina reticolante UV.
      NOTA: rimuovere il coperchio della piastra di Petri per massimizzare l'esposizione ai raggi UV.
   3. Impostare la reticolatrice UV con una lunghezza d'onda di picco di 365 nm ad un'intensità di 100 μJ/cm² e accendere la luce UV per 20 minuti.
      NOTA: Dopo 20 minuti di trattamento UV, la soluzione reticolante apparirà più scura (marrone).
   4. Riportare i trucioli sotto il BSC e aspirare la soluzione reticolante ossidata. Quindi, sciacquare tutti i trucioli tre volte con il tampone solvente e lasciare asciugare i trucioli sotto il BSC per 5-10 minuti per completare la funzionalizzazione chimica della superficie del polidimetilsilossano (PDMS).

2. Preparazione dello stroma equivalente

1. Preparazione del tampone di ricostruzione 10x (100 ml)
   1. Sciogliere 2,2 g di bicarbonato di sodio in 75 mL di 0,067 M NaOH in acqua bidistillata.
   2. Aggiungere 4,76 g di HEPES e portare il volume a 100 ml utilizzando acqua distillata doppiamente.
   3. Filtrare sterile la soluzione sotto la BSC utilizzando un filtro monouso sterile a bottiglia con membrana da 0,22 μm.
      NOTA: La soluzione è stabile per circa 6 mesi se conservata a 4 °C.
2. Stima del volume della soluzione pre-gel
   1. Moltiplicare il numero di chip necessari per l'esperimento per 150 μL (volume interno della camera centrale aperta) per stimare la quantità di soluzione pre-gel necessaria per l'esperimento:
      Volume necessario = (Numero di chip x 150) μL
   2. Preparare la soluzione di collagene pre-gel su ghiaccio mescolando: 1 volume di 10x EMEM contenente le cellule di scelta, 1 volume di tampone di ricostruzione 10x (vedere punto 2.1), 8 volumi di soluzione di collagene I (10 mg/ml) e 1 μL di soluzione 1 N NaOH per ogni mg di collagene I.
      NOTA: Si consiglia di preparare un volume extra +15% per tenere conto degli errori sperimentali; L'esempio descritto nella sezione 2.2 fornisce una procedura dettagliata passo-passo per preparare una soluzione pre-gel sufficiente per 12 chip e un volume extra del 15%.
3. Preparazione della soluzione pre-gel per lo stroma equivalente (per 12 chip)
   1. Portare le seguenti soluzioni sotto il BSC su ghiaccio: 10x EMEM; 10x Buffer di ricostruzione (vedere il punto 2.1); Soluzione di collagene I (10 mg/ml); e soluzione sterile 1 N NaOH.
   2. Colture di cellule mesenchimali tessuto-specifiche come indicato dai fornitori fino all'80% -90% confluente, quindi dissociare le cellule usando tripsina o altri metodi come raccomandato dal fornitore di cellule. Raccogliere le celle in un pellet mediante centrifugazione a 250 x g per 5 minuti a 24 °C.
   3. Risospendere il pellet cellulare in 225 μL di EMEM 10x ghiacciato e aggiungere 225 μL di tampone di ricostruzione 10x ghiacciato (vedere punto 2.1). Mescolare la soluzione pipettando delicatamente su e giù, quindi aggiungere 1.800 μL di soluzione di collagene I ghiacciata.
   4. Pipettare su e giù 5-6 volte, evitando bolle per mescolare la soluzione pre-gel mentre si è sul ghiaccio.
4. Incorporazione dello stroma equivalente su chip (per 12 chip)
   1. Neutralizzare la soluzione pre-gel con 18 μL di 1 N NaOH. Mescolare delicatamente pipettando su e giù 5-6 volte, quindi pipettare 150 μL di idrogel carico di cellule nella camera centrale del chip Open-Top evitando bolle.
      NOTA: se è necessaria la micropatterning, passare al passaggio successivo (sezione 3).
   2. Raggruppare i trucioli in piastre di Petri separate, compreso un tappo a tubo da centrifuga riempito con 2 ml di_{ddH 2}O sterile in ciascuna capsula di Petri, e incubare le piastre di Petri nell'incubatore a 37 °C, 5% CO₂.
      NOTA: Dopo 90 minuti, l'idrogel carico di cellule sarà completamente polimerizzato.

3. Micropatterning superficiale (opzionale)

1. Eseguire la micromodellazione superficiale dell'idrogel stromale dopo il pipettaggio dell'idrogel di collagene neutralizzato (ancora allo stato liquido) utilizzando timbri stampati in 3D.
   NOTA: I francobolli stampati in 3D possono essere ottenuti in vari disegni personalizzabili, come precedentemente descritto altrove²⁴.
2. Pipettare 20 μL della soluzione di collagene neutralizzato I pre-gel sulla superficie modellata di un timbro sterile stampato in 3D e inserire il timbro all'interno (in alto) della camera aperta mentre l'idrogel stromale è ancora in forma liquida.
3. Rimuovere qualsiasi residuo di idrogel che potrebbe fuoriuscire dalla parte superiore della camera aperta utilizzando un aspiratore (o una pipetta). Raggruppare tutti i trucioli in piastre di Petri separate e includere un tappo a tubo conico da 15 mL da 15 mL riempito con 2 mL di_{ddH 2}O sterile in ciascuna capsula di Petri.
4. Incubare tutte le piastre di Petri a 37 °C, 5% CO₂ per 90 minuti, quindi riportare i trucioli sotto la BSC e rimuovere delicatamente i timbri usando una pinzetta di precisione per ridurre il rischio di danneggiare l'idrogel.

4. Rivestimento della superficie epiteliale e vascolare con proteine ECM tessuto-specifiche

1. Rivestimento della camera microfluidica vascolare con proteine della matrice extracellulare
   1. Moltiplicare il numero di chip necessari per l'esperimento per 20 μL (volume del canale vascolare) per stimare il volume della soluzione di rivestimento ECM vascolare richiesta per l'esperimento:
      Volume necessario = (Numero di chip x 20) μL
      NOTA: si consiglia di preparare un volume aggiuntivo del 15% per tenere conto degli errori sperimentali.
   2. Preparare la soluzione di rivestimento ECM vascolare per tutti i chip (ad esempio, 300 μL per 12 chip) utilizzando PBS o HBSS ghiacciati.
      NOTA: Fare riferimento alla tabella specifica organo-protocollo nella sezione materiali supplementari (Tabella supplementare 1 per la pelle; Tabella supplementare 2 per l'alveolo; Tabella supplementare 2 per le vie aeree e Tabella supplementare 4 per l'intestino) per identificare i reagenti specifici e la composizione ECM raccomandata.
   3. Pipettare 20 μL di soluzione di rivestimento ECM vascolare nel canale vascolare di ciascun chip.
2. Rivestimento della superficie apicale dell'equivalente stromale con proteine della matrice extracellulare
   1. Moltiplicare il numero di chip necessari per l'esperimento per 50 μL (volume del canale vascolare) per stimare il volume della soluzione di rivestimento ECM epiteliale necessaria per l'esperimento:
      Volume necessario = (Numero di chip x 50) μL
      NOTA: si consiglia di preparare un volume extra del 15% per tenere conto degli errori sperimentali.
   2. Preparare una soluzione di rivestimento ECM sufficiente per tutti i chip (ad esempio, 750 μL per 12 chip) in PBS o HBSS ghiacciato e trasferire 50 μL di soluzione di rivestimento ECM epiteliale direttamente sulla superficie dell'idrogel.
      NOTA: Fare riferimento alla tabella specifica organo-protocollo nella sezione materiali supplementari (Tabella supplementare 1 per la pelle; Tabella supplementare 2 per l'alveolo; Tabella supplementare 2 per le vie aeree e Tabella supplementare 4 per l'intestino) per identificare i reagenti specifici e la composizione ECM raccomandata.
   3. Raggruppare i trucioli in piastre di Petri separate, compresa una centrifuga da 15 mL di tappo conico riempito con 2 mL di ddH₂O sterile in ciascuna capsula di Petri, e incubare le piastre di Petri nell'incubatore a 37 °C, 5% CO 2 per₂ ore prima di procedere con la semina delle cellule epiteliali.

5. Seminare cellule epiteliali sull'equivalente stromale

1. Coltura cellulare epiteliale
   1. Colture di cellule epiteliali tessuto-specifiche come indicato dai fornitori fino all'80% -90% confluente.
   2. Dissociare le cellule utilizzando procedure enzimatiche proteolitiche come raccomandato dal fornitore di cellule.
      NOTA: Per ottenere i migliori risultati, raccogliere cellule epiteliali a basso passaggio (P1-P2) durante la fase di crescita attiva quando raggiungono tra il 70% e il 90% di confluenza.
   3. Una volta dissociate, centrifugare le cellule e raccoglierle come pellet.
   4. Risospendere le cellule epiteliali alla densità appropriata di cellula/frammento come indicato nella tabella specifica del protocollo d'organo.
      NOTA: In questo studio, la soluzione cellulare è stata utilizzata a una densità di 3 x 10 6 cellule / ml per la pelle, 1 x 10 6 cellule / ml per l'alveolo, 6 x 10 6 cellule / ml per le vie aeree e 8 x 10 ⁶ frammenti / ml per l'intestino.
2. Semina delle cellule epiteliali
   1. Trasferire i chip dall'incubatore al BSC. Aspirare la soluzione di rivestimento dal canale vascolare e sciacquare il canale microfluidico vascolare tre volte con 50 μL di terreno di coltura cellulare endoteliale fresco.
   2. Aspirare la soluzione di rivestimento dalla superficie dell'idrogel e sciacquare la superficie stromale tre volte con 100 μL di terreno di coltura cellulare epiteliale fresco per rimuovere qualsiasi soluzione di rivestimento in eccesso.
   3. Aspirare il terreno ascendente e seminare la superficie dell'idrogel con 50 μL della sospensione cellulare epiteliale utilizzando la densità cellulare appropriata, come indicato nelle tabelle supplementari, quindi trasferire nuovamente i trucioli nell'incubatore per 2 ore (o durante la notte per i colonoidi).
   4. Risciacquare delicatamente la superficie dell'idrogel con il terreno di coltura cellulare due volte per rimuovere i detriti cellulari. Infine, rinfrescare il mezzo mediante autoclave in contenitori autoclavabili sigillati e collegare i trucioli alla pompa peristaltica.

6. Collegamento dei chip al flusso

1. Preparazione delle parti fluidiche
   1. Tagliare 2 pollici di tubo di trasferimento in elastomero termoplastico (TPE) a base di polipropilene biocompatibile (Table of Materials) per preparare il tubo microfluidico corto necessario per collegare i chip ai serbatoi dei fluidi.
   2. Tagliare 7,5 pollici di tubi di trasferimento TPE biocompatibili per produrre il lungo tubo microfluidico.
   3. Preparare abbastanza connettori metallici da 18 G e 19 G (tabella dei materiali).
      NOTA: Si raccomanda di preparare e sterilizzare i tubi e i connettori descritti nei punti 6.1.1 e 6.1.2 almeno 1 giorno prima di collegare i chip aperti alle pompe peristaltiche.
   4. Forare il coperchio di ciascun serbatoio medio con un ago ipodermico da 4 pollici (tabella dei materiali).
2. Degasaggio medio
   1. Lasciare che il terreno di coltura cellulare si equilibri a temperatura ambiente (RT).
   2. Trasferire il volume del mezzo necessario in un tubo filtrante conico.
   3. Applicare una pressione di vuoto negativa di -20 PSI per degassare il fluido (filtrazione guidata dal vuoto).
      NOTA: Se non è disponibile un vuoto, il terreno di coltura cellulare può essere lasciato equilibrare nell'incubatore durante la notte per ottenere risultati simili.
3. Preparare il chip Open-Top per il flusso del fluido
   1. Portare i trucioli e le parti fluidiche sterili sotto il BSC e allineare il coperchio (parte superiore) del chip Open-Top per sigillare il prototipo di chip Open-Top prima di iniziare il flusso del fluido.
   2. Pipettare 200 μL del terreno di coltura cellulare degassato (vedere tabelle organo-specifiche) nella porta di ingresso di entrambi i canali superiore e inferiore del chip prestando attenzione per evitare bolle.
   3. Pipettare 300 μL del terreno di coltura nel tubo microfluidico corto per innescare la superficie interna dei tubi e collegare il tubo corto agli ingressi dei canali superiore e inferiore del chip.
4. Collegare e innescare le superfici microfluidiche
   1. Posizionare i serbatoi medi nel rack dell'azienda, collegare l'ago ipodermico all'ingresso inferiore dei trucioli e, infine, ospitare tutti i trucioli nei supporti dell'alloggiamento all'interno dell'incubatore.
   2. Collegare i chip alla pompa peristaltica, quindi ispezionare tutti i connettori per assicurarsi che tutti i chip siano collegati correttamente e che non vi siano perdite visibili di terreni di coltura cellulare.
   3. Utilizzare il pulsante di spurgo sulla pompa e tenerlo premuto per circa 15 secondi o fino a quando le goccioline del terreno di coltura cellulare appaiono alla fine del tubo di deflusso.
   4. Utilizzare il sistema di controllo sulla pompa per impostare la portata organo-chip appropriata (Figura 2, Figura 3, Figura 4 e Figura 5).

7. Manutenzione dei chip

1. Manutenzione del chip dell'organo
   1. Preparare un terreno di coltura cellulare fresco per l'epitelio e/o l'endotelio ed eseguire le fasi di degasaggio (come precedentemente descritto al punto 6.2).
   2. Mettere in pausa la pompa peristaltica, scollegare con attenzione i chip dalla pompa ed estrarre i supporti dell'alloggiamento del chip. Trasferire i trucioli dall'incubatore al BSC e rimuovere il volume di fluido rimasto nei serbatoi.
   3. Sostituire i terreni di coltura cellulare nei serbatoi di ingresso superiore e inferiore con 5 ml di terreno di coltura cellulare fresco e riposizionare i supporti dell'alloggiamento del chip nell'incubatore. Collegare i chip alla pompa peristaltica e riavviare il flusso.
      NOTA: Si consiglia di utilizzare la funzione Purge per aggiornare rapidamente il mezzo al compartimento vascolare e ridurre il rischio di bolle d'aria.
   4. Ripetere i passaggi 7.1.1-7.1.3 a giorni alterni, come da Figura 2, Figura 3, Figura 4 e Figura 5.
2. Creazione di un'interfaccia aria-liquido (ALI)
   1. Mettere in pausa la pompa peristaltica, scollegare con attenzione i chip dalla pompa ed estrarre i supporti dell'alloggiamento del chip. Trasferire i trucioli dall'incubatore all'armadio di biosicurezza e rimuovere il volume di mezzo rimasto nel serbatoio superiore.
   2. Aspirare delicatamente tutto il fluido dal canale microfluidico superiore e bloccare il tubo microfluidico corto collegato agli ingressi superiori utilizzando clip leganti per ridurre l'evaporazione del fluido e il mantenimento di ALI.
   3. Posizionare il chip Open-Top sui supporti dell'alloggiamento nell'incubatore e ricollegare i chip alla pompa peristaltica.
      NOTA: Si consiglia di utilizzare la funzione Purge per aggiornare rapidamente il mezzo al compartimento vascolare e ridurre il rischio di bolle d'aria.
   4. Riprendere il flusso avviando la pompa peristaltica.
3. Stretching (opzionale)
   1. Mettere in pausa la pompa peristaltica e collegare le porte del vuoto dei chip al modulo del vuoto utilizzando due lunghi tubi microfluidici per chip.
   2. Utilizzare il modulo vuoto per regolare l'impostazione di allungamento in base alla condizione raccomandata per ciascun organo, come specificato all'interno delle tabelle di protocollo degli organi: Tabella supplementare 1 per la pelle; Tabella supplementare 2 per l'alveolo; Tabella supplementare 2 per le vie aeree; e Tabella supplementare 4 per l'intestino.
   3. Ispezionare visivamente le connessioni dei tubi per assicurarsi che tutti i chip siano collegati correttamente e che non vi siano goccioline visibili di gocciolamento medio.
   4. Riprendere il flusso avviando la pompa peristaltica.

8. Semina di cellule endoteliali nel compartimento vascolare

1. Preparare cellule e chip per la semina delle cellule vascolari
   1. Coltivare le cellule endoteliali tessuto-specifiche come indicato dai fornitori fino all'80% -90% confluente. Dissociare le cellule utilizzando una procedura enzimatica proteolitica (come raccomandato dal fornitore) e, infine, risospendere le cellule endoteliali in una soluzione di 3 x 10⁶ cellule / ml.
      NOTA: Per ottenere i migliori risultati, raccogliere le cellule endoteliali a basso passaggio (P2-P4) durante la fase di crescita attiva quando raggiungono tra il 70% e il 90% di confluenza.
   2. Metti in pausa la pompa peristaltica. Trasferire i chip dall'incubatore al BSC, scollegare i chip dai serbatoi dei supporti e da qualsiasi tubo collegato, quindi raggruppare i chip in piastre di Petri separate.
   3. Rinfrescare il terreno di coltura cellulare del compartimento epiteliale con terreno di coltura cellulare epiteliale fresco. Risciacquare il canale vascolare con terreno di coltura cellulare endoteliale fresco due volte, quindi aspirare il mezzo dal compartimento vascolare.
2. Semina delle cellule endoteliali
   1. Seminare il canale inferiore (vascolare) con 25 μL di sospensione di cellule endoteliali (3 x 10⁶ cellule / ml), capovolgere i chip per consentire alle cellule endoteliali di attaccarsi alla superficie superiore della camera microfluidica.
      NOTA: Aggiungere 50 μL di sospensione cellulare per chip (600 μL per 12 chip).
   2. Raggruppare le patatine in piastre di Petri. Rimetterli nell'incubatore a 37 °C, 5% di CO_2, e lasciare che le cellule endoteliali si attacchino per 1 ora.
   3. Dopo 1 ora, trasferire i chip dall'incubatore al BSC. Risciacquare il canale vascolare con terreno di coltura cellulare endoteliale due volte per rimuovere i detriti cellulari.
   4. Ripetere i passaggi 8.2.1-8.2.2 per seminare nuovamente il canale vascolare con cellule endoteliali e posare i trucioli in piano per facilitare l'adesione delle cellule endoteliali alla superficie inferiore del canale vascolare.
3. Ricollegare il chip al flusso
   1. Riempire il serbatoio del mezzo vascolare con il terreno di coltura cellulare vascolare degassato sotto la BSC.
   2. Riposizionare i trucioli all'interno dei contenitori dell'alloggiamento del chip e ricollegare i trucioli ai serbatoi medi su un'estremità alla pompa peristaltica all'altra estremità.
      NOTA: Si consiglia di utilizzare la funzione Purge per aggiornare rapidamente il mezzo al compartimento vascolare e ridurre il rischio di bolle d'aria.
   3. Ispezionare visivamente le connessioni microfluidiche per assicurarsi che tutti i chip siano collegati correttamente e che non vi siano goccioline visibili di gocciolamento medio. Quindi, riprendere il flusso del fluido avviando la pompa peristaltica.

9. Saggi comuni degli endpoint

1. Disconnettere i chip per i test degli endpoint
   1. Mettere in pausa la pompa peristaltica, scollegare con attenzione i chip dalla pompa ed estrarre i supporti dell'alloggiamento del chip. Trasferire il/i porta-alloggiamento del chip dall'incubatore al BSC e liberare i chip.
   2. Lavare delicatamente la camera centrale dell'Open-Top Chip con il terreno di coltura cellulare epiteliale e il canale vascolare con il terreno di coltura dell'endotelio due volte per rimuovere eventuali detriti cellulari.
   3. Rimuovere il coperchio dell'Open-Top Chip per accedere al compartimento apicale del chip utilizzando una pinzetta.
2. Immunocolorazione per microscopia a fluorescenza
   1. Procedere con la fissazione, la permeabilizzazione e il blocco convenzionali del campione.
      NOTA: In questo studio, i campioni sono stati fissati in 200 μL di paraformaldeide (PFA) al 4% per 1 ora, seguito da risciacquo con PBS, permeabilizzazione in Triton X-100 allo 0,1% per 40 minuti e blocco in albumina sierica bovina all'1% per 1 ora.
   2. Incubare i trucioli con anticorpi primari (Table of Materials) a 4 °C durante la notte. e quindi lavare due volte i compartimenti epiteliali ed endoteliali dei chip con 200 μL di PBS. Quindi, procedere con gli anticorpi secondari appropriati per 2 ore.
      NOTA: Diluire gli anticorpi primari e gli anticorpi secondari in PBS + 1% BSA ad una diluizione di 1:100 (anticorpo primario) e 1:200 (anticorpo secondario).
3. Immunoistochimica
   1. Estrarre gli equivalenti stromali dalla camera principale del chip Open-Top usando una pinzetta, raccoglierli in un tubo da 1,5 ml riempito con formalina tamponata neutra al 10% e incubare per almeno 24 ore.
   2. Trasferire l'equivalente stromale fisso al processore tissutale e seguire i passaggi seguenti per ottenere una disidratazione ottimale del campione.
      1. Immergere l'idrogel in etanolo al 70% per 90 minuti.
      2. Rimuovere l'etanolo al 70% e immergere l'idrogel in etanolo all'80% per 90 minuti.
      3. Rimuovere l'etanolo all'80% e immergere l'idrogel in etanolo al 95% per 90 minuti.
      4. Rimuovere l'etanolo al 95% e immergere l'idrogel in etanolo al 100% per 90 minuti due volte.
      5. Rimuovere l'etanolo al 100% e immergere l'idrogel in una soluzione di xilene per 120 minuti due volte.
      6. Rimuovere la soluzione di xilene e infiltrare gli equivalenti stromali trattati nella cera di paraffina per 120 minuti (~ 2 h) due volte.
   3. Incorporare gli equivalenti stromali infiltrati in blocchi di paraffina sezionati.
   4. A questo punto, gli equivalenti stromali possono essere sezionati come blocchi di paraffina usando un microtomo e trattati secondo le tecniche istologiche convenzionali²⁶.

Risultati

Micropatterning superficiale
Il micropatterning della matrice extracellulare (ECM) può essere utilizzato per replicare la configurazione spaziale dell'interfaccia della cripta intestinale. La configurazione Open-Top Chip può essere modificata per integrare timbri microstrutturati specificamente progettati per imitare la topografia naturale dell'interfaccia epitelio-stroma del colon (Figura 6A,B) e delle cripte intestinali su scala micrometrica (Figura 6C-E

Discussione

L'Open-Top Chip rappresenta una piattaforma abilitante per studiare la complessa interazione cellulare che si verifica tra endotelio, stroma ed epitelio in un microambiente controllato, in tempo reale. Questa tecnologia offre vantaggi critici rispetto alle colture organotipiche e organoidi convenzionali, come l'integrazione di segnali fisici e biochimici rilevanti per ricostituire il microambiente del tessuto umano, tra cui taglio fluidico (flusso), allungamento ciclico e ricostruzione della topografia della superficie e...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x EMEM	Lonza	12-684F	Medium; Stroma
18 Gauge needle	MicroGroup	316H18RW	Tube stainless steel 316 welded, 18RW Full Hard
19 Gauge needle	MicroGroup	316H19RW	Tube stainless steel 316 welded, 19RW Full Hard
2-Stop PharMed BPT	Cole-Palmer	EW-95723-12	Tube, 0.25 mm, 12/pack
70% ethanol and wipes	-	-	For surface sterilization
8-Bromoadenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt (8-Br-cAMP)	Sigma	B7880	Medium supplement
A-83-01	Tocris	2939
Adenine	Sigma	A9795
Advanced DMEM/F12	Thermo	12634010
Airway Epithelial Cells	Lifeline Cell Technology	FC-0016
Aluminum foil	-	-	-
Alveolar cells	Cell Biologics	H6621
Anti-ABCA3	ABCAM	ab24751	Mouse monoclonal antibody [3C9]
Anti-Aquaporin5 Alexa Fluor 647	ABCAM	ab215225	Rabbit monoclonal antibody [EPR3747]
Anti-Aquaporin5	ABCAM	ab92320	Rabbit monoclonal antibody [EPR3747]
Anti-beta IV Tubulin	ABCAM	ab11315	Mouse monoclonal antibody [ONS.1A6]
Anti-CD31 (PECAM-1)	ABCAM	ab9498	Mouse monoclonal [JC/70A] antibody
Anti-CK5	ABCAM	ab75869	Rabbit recombinant monoclonal [AY1E6]
Anti-Cytokeratin 10	ThermoFisher	MA5-13705	Mouse monoclonal antibody (DE-K10)
Anti-Cytokeratin 14	ABCAM	ab7800	Mouse monoclonal antibody
Anti-E-Cadherin	ABCAM	ab1416	Mouse monoclonal antibody
Anti-Filaggrin	ThermoFisher	PA5-79267	Rabbit polyclonal antibody
Anti-HTI-56	Terrace Biotech	TB-29AHT1-56	Mouse monoclonal antibody (IgG1)
Anti-HTII-280	Terrace Biotech	TB-27AHT2-280	Mouse monoclonal antibody (IgM)
Anti-Involucrin	ThermoFisher	MA5-11803	Mouse monoclonal antibody (SY5)
Anti-Isoforms TA p63-α, -β, -γ	Biolengend	618902	Rabbit polyclonal antibody
Anti-Ki67	ABCAM	ab8191	Mouse monoclonal antibody [B126.1]
Anti-LAMP3	ABCAM	ab111090	Rabbit polyclonal antibody
Anti-Mature SP-B	Seven Hill	WRAB-48604	Rabbit polyclonal antibody
Anti-MUC5AC	ThermoFisher	PA5-34612	Rabbit polyclonal antibody
Anti-Mucin-2	SantaCruz Biotechnology	sc-7314	Mouse monoclonal antibody (IgG1)
Anti-p63	Dako	GA662	Mouse monoclonal antibody p63 Protein (Dako Omnis) Clone DAK-p63
Anti-PCNA	ThermoFisher	PA5-32541	Rabbit polyclonal antibody
Anti-Podoplanin (AT-1α)	ABCAM	ab128994	Rabbit polyclonal antibody
Anti-Pro + Mature Surfactant Protein B	ABCAM	ab40876	Rabbit polyclonal antibody
Anti-Surfactant C	Seven Hill	WRAB-9337	Rabbit polyclonal antibody
Anti-Uteroglobin/SCGB1A1	Hycult Biotech	HM2178	Mouse monoclonal antibody [AY1E6]
Anti-VE-cadherin	ABCAM	ab33168	Rabbit polyclonal antibody
Anti-ZO-1	ThermoFisher	33-9100	Mouse monoclonal antibody [1A12]
Ascorbic acid	Sigma	A4544
Aspirating pipettes	Corning / Falcon	357558	2 mL, polystyrene, individually wrapped
Aspirating tips	-	-	Sterile (autoclaved)
B27	Thermo	17504044
Blocker BSA (10X) in PBS solution	ThermoFisher	37525	Blocker agent
Calcium Chloride	Sigma	C7902
CHIR 99021	Tocris	4423
Collagen I	Advanced Biomatrix	5133	10 mg/mL (Stroma)
Collagen I	Advanced BioMatrix	5005	3 mg/mL (Vascular ECM)
Collagen IV	Sigma	C5533
Collagen-IV	Sigma	C5533-5MG	Collagen from human placenta, 5 mg powder, reconstitute to 1 mg/mL
Colonic Fibroblasts	Cell Biologics	H6231
Colonic microvascular endothelial cells	Cell Biologics	H6203
Conical tubes	-	-	15 mL and 50 mL polypropylene, sterile
Crosslinker (ER-1)	Emulate	10461	5 mg powder
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)	ThermoFisher	D3571	DNA probe
Dermal fibroblasts	ATCC	PCS-201-010
Dermal microvascular endothelial cells	ATCC	CRL-3243
Dexamethasone	Sigma	D4902
DMEM	ThermoFisher	11054020
DMEM/F-12	GIBCO	11320082
DMEM/F-12, GlutaMAX	GIBCO	10565-018	Basal medium for ALI medium
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488)	ABCAM	ab150105	Donkey Anti-Mouse secondary antibody
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 568)	ABCAM	ab175472	Donkey Anti-Mouse secondary antibody
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647)	ABCAM	ab150107	Donkey Anti-Mouse secondary antibody
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488)	ABCAM	ab150073	Donkey Anti-Mouse secondary antibody
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 568)	ABCAM	ab175470	Donkey Anti-Mouse secondary antibody
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 647)	ABCAM	ab150075	Donkey Anti-Mouse secondary antibody
Dulbecco’s PBS (DPBS-/-) (without Ca2+, Mg2+)	Corning	21-031-CV	1x
Epidermal Growth Factor (EGF) human, recombinant in E. coli	PromoCell	C-60170	Medium supplement
F-12 Ham’s	Invitrogen	21700-108	For vascular ECM
FibriCol	Advanced BioMatrix	5133-20ML	Collagen-I solution (10 mg/mL)
Fibronectin	Corning	356008
Fibronectin, Human, Natural,	Corning	47743-654	human plasma fibronectin
Fine-tip precision tweezers	Aven	18056USA	Technik Style 5B-SA Precision Stainless Steel Tweezers
Glutamax	Invitrogen	21700-108
Glutamax	Invitrogen	35050061
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 594)	ABCAM	ab150080	Goat Anti-Mouse secondary antibody
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647)	ABCAM	ab150115	Goat Anti-Mouse secondary antibody
Goat Anti-Mouse IgG H&L (FITC)	ABCAM	ab6785	Goat Anti-Mouse secondary antibody
Goat Anti-Mouse IgG1 Alexa Fluor 568	ThermoFisher	A-21124	Goat Anti-Mouse IgG1 secondary antibody
Goat Anti-Mouse IgM Alexa Fluor 488	ThermoFisher	A-21042	Goat Anti-Mouse IgM secondary antibody
Handheld vacuum aspirator	Corning	4930	-
Heat Inactivated HyClone FetalClone II Serum (FCS)	GE Healthcare Life Sciences	SH30066.03
Hemocytometer	-	-	-
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa	Sigma	H3149
HEPES	Thermo	15630080
Human [Leu15] - Gastrin	Sigma	G9145
Human colonoids	Obtained from clinical resections		Obtained from clinical resections
Human EGF Recombinant Protein	Thermo	PHG0311L
human epithelial growth factor	Thermo	PHG0311
HyClone FetalClone II Serum (U.S.)	GE Healthcare	SH30066.02HI	Sterile FBS heat-inactivated
Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt	Sigma	H4881
Hydrocortisone	PromoCell	C-64420	Medium supplement
Ice bucket	-	-	-
Ismatec IPC-N	Cole-Palmer	EW-78000-41	Low-Speed Digital Peristaltic Pump; q24-Channel (1 per 12 Chips)
ITES	BioWhittaker	17-839Z
Keratinocyte Growth Factor (KGF), also known as Basic Fibroblast Growth Factor 7 (FGF-7), human, recombinant in HEK	PromoCell	C-63821
Keratinocytes	ATCC	PCS-200-010
Laminin	Biolamina	CT521-0501
Laminin, 521 CTG (CT521)	Biolamina	CT521-0501	human recombinant laminin 521
Lung Fibroblast	Cell Biologics	H6013
Lung Fibroblast	Lifeline Cell Technology	FC-0049
Lung microvascular endothelial cells	Lonza	CC-2527
Lung smooth muscle cells	Lifeline Cell Technology	FC-0046
Manual counter	-	-	-
Masterflex (TPE) Transfer Tubing	Cole-Palmer	FV-96880-02	PharMed BPT, 1/32" ID x 5/32" OD
Medium 199, no phenol red	Thermo	11043023
Microcentrifuge tube	-	-	1.5 mL, sterile
Microscope (with camera)	-	-	For bright-field imaging
N2	Sigma	17502001
N-acetyl cysteine	Sigma	A5099
Noggin (HEK293T conditioned medium)	Sigma	N17001
Normal Goat Serum	ThermoFisher	50062Z	Blocking solution
O-phosphosrylethanolamine	Sigma	P0503
Paraformaldehyde (4% wt/vol)	EMS	15710	Fixing agent
Penicillin Streptomycin	GIBCO	15140122
Penicillin-streptomycin	Sigma	P4333	10,000 U/mL; 10 mg/mL
Pipette tips	-	-	P20, P200, and P1000 sterile, low adhesion
Pipette	Gilson	F167380	P20, P200, and P1000
PluriQ Serum Replacement (or alternatively KO Serum replacement)	AMSBIO (or Thermo)	N/A (or C1910828010)
Poly-L-Lysine coated microscope glass slides	Sigma	P0425	Glass slides
Primocin	InvivoGen	ant-pm-1
Progesterone	Sigma	P8783
ProLong Gold	ThermoFisher	P36931	Antifade Mountant with DAPI
Retinoic Acid	Sigma	R2625
ROCK inhibitor (Y27632)	Tocris	TB1254-GMP/10
R-spondin (HEK293T conditioned medium)	Sigma	SCC111
SAGM SingleQuots supplements	Lonza	CC-4124
SAGMTM Small Airway Epithelial Cell Growth medium BulletKitTM	Lonza	CC-4124	Medium supplements
SB2001190	Tocris	1264/10
Serological pipettes	-	-	2 mL, 5 mL, 10 mL, and 25 mL low endotoxin, sterile
Small Airway Epithelial Cell Growth medium (SAGM)	Lonza	CC-4124
Solvent Buffer (ER-2)	Emulate	10462	25 mL bottle
Steriflip-HV	Millipore	SE1M003M00	Sterile filtering conical tube
Sterilin 100 mm Square Petri Dishes	Thermo	103	Sterile, 1 per 6 chips
T25 flasks	-	-	-
T75 flasks	-	-	-
Tri-iodothyronine	Sigma	T5516
Triton X-100 (0.3% (vol/vol)	Sigma	T8787	Permeabilization agent
Trypan blue	Sigma	93595	0.4% solution
TrypEE solution	Sigma	12604013	Cell detaching solution
TWEEN-20	Sigma	P2287	Permeabilization agent
UV Light Oven (peak frequency 365nm, intensity of 100 µJ/cm2)	VWR	21474-598	UVP, Long Range UV, 365 nm 60Hz Model CL-1000L
Vacuum set-up	-	-	Minimum pressure: -70 kPa
Vascular Endothelial Growth Factor 165 (VEGF-165) human, recombinant in E. coli	PromoCell	C-64420
VEGF-165	PromoCell	C-64420	Medium supplement
Von Willebrand Factor conjugated FITC	ABCAM	ab8822	Sheep polyclonal antibody
Water bath (or beads)	-	-	Set to 37 °C
Wnt3A (L-Wnt3A conditioned medium)	ATCC	CRL-2647