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요약

현재 프로토콜은 1차 조직(피부, 폐포, 기도 및 장)의 전층 장기 온칩 배양의 성공적인 확립 및 성숙을 위한 Open-Top Organ-Chip의 기능과 필수 배양 양식을 설명하여 시험관 내에서 인간 상피/중간엽 및 혈관 틈새 인터페이스의 다양한 기능적 측면을 조사할 수 있는 기회를 제공합니다.

초록

거의 모든 인간 장기에는 3차원(3D) 구조로 구성된 밀접하게 연결된 세포의 하나 또는 여러 층으로 구성된 상피 조직이 늘어서 있습니다. 상피의 주요 기능 중 하나는 밑줄 조직을 물리적 및 화학적 손상 및 감염원으로부터 보호하는 장벽을 형성하는 것입니다. 또한 상피는 영양소, 호르몬 및 기타 신호 분자의 수송을 매개하여 종종 장기 내에서 세포 위치 지정 및 구획화를 안내하는 생화학적 구배를 생성합니다. 장기 구조와 기능을 결정하는 중심적인 역할로 인해 상피는 동물 모델에 의해 항상 포착되지 않는 많은 인간 질병에 대한 중요한 치료 표적입니다. 명백한 종 간 차이 외에도 동물에서 상피의 장벽 기능 및 수송 특성에 대한 연구 연구는 살아있는 시스템에서 이러한 조직에 접근하는 것이 어렵기 때문에 더욱 복잡해집니다. 2차원(2D) 인간 세포 배양은 기본적인 과학적 질문에 답하는 데 유용하지만 생체 내 예측이 좋지 않은 경우가 많습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 지난 10년 동안 장기 온 칩(organs-on-a-chip)으로 알려진 수많은 마이크로 엔지니어링 생체 모방 플랫폼이 전통적인 체외 및 동물 실험에 대한 유망한 대안으로 부상했습니다. 여기에서는 피부, 폐 및 내장을 포함한 장기 특이적 상피 조직을 모델링하기 위해 설계된 플랫폼인 Open-Top Organ-Chip(또는 Open-Top Chip)에 대해 설명합니다. 이 칩은 기계적 활성 시스템 내에 조직 특이적 섬유아세포와 내피 세포를 통합하여 3D 기질 구성 요소를 재현하는 기능을 포함하여 상피 조직의 다세포 구조와 기능을 재구성할 수 있는 새로운 기회를 제공합니다. 이 Open-Top Chip은 단일 세포에서 다층 조직 구조에 이르기까지 여러 규모의 해상도에서 상피/중간엽 및 혈관 상호 작용을 연구하기 위한 전례 없는 도구를 제공하여 건강 및 질병에서 상피 기관의 세포 간 누화의 분자 해부를 가능하게 합니다.

서문

역사적으로 과학자들은 신약 개발을 위해 전임상 동물 실험에 의존해 왔지만, 인간 결과와의 상관관계가 낮기 때문에 이러한 방법에 의문이 제기되는 경우가 점점 늘어나고 있다1. 동물 실험을 대체, 감소 및 개선하기 위한 "3Rs" 원칙의 구현은 과학자들이 전임상 약물 및 화학 독성 위험 평가를 지원하기 위한 새로운 체외 대체 방법을 찾도록 촉구합니다2. 그러나 현재까지 개발된 많은 체외 모델에는 인간 생체 기관의 역동적인 특성을 요약하는 데 필요한 생물학적 구조, 세포 복잡성 및 기계적 환경이 부족합니다 3,4.

기존의 체외 전임상 시스템은 일반적으로 단단한 플라스틱 표면에서 성장한 인간 세포의 2D 단일 배양을 사용합니다. 이러한 방법은 간단한 기계론적 연구를 수행하고 약물 후보를 신속하게 스크리닝할 수 있는 도구를 제공합니다. 상대적으로 저렴한 비용과 높은 견고성으로 인해 2D 모델은 종종 자동 고처리량 시스템과 쌍을 이루며 약물 개발 프로세스 5,6의 초기 단계에서 잠재적인 약물 후보를 신속하게 식별하는 데 사용됩니다. 그러나 이러한 2D 모델은 개발 전임상 단계에서 약물 안전성 및 효능을 정확하게 예측하는 데 필요한 치료 후보에 대한 조직 수준, 장기 수준 또는 전신 반응을 모델링하기 위한 번역 접근 방식을 제공하지 않습니다. 편평 세포 배양은 인간 조직의 복잡한 다세포 상호작용, 생체역학적 특성 및 3차원(3D) 구조를 포함한 천연 조직 미세 환경을 재현하지 않는다7. 평평한 표면에서 자라는 세포는 종종 성숙한 표현형을 얻지 못하므로 천연 조직에서와 같이 약리학적 자극에 반응할 수 없습니다. 예를 들어, 시험관 내에서 성장한 1차 인간 폐포 상피 세포는 편평 표현형을 나타내고 계면활성제 단백질 C 및 B(SP-C 및 SP-B)8를 포함한 주요 표현형 마커를 잃습니다. 불충분한 분화와 더불어, 일차 세포는 조직 염증과 관련된 특정 생화학적 경로가 기능을 상실하기 때문에 시험관 내에서 생물학적 스트레스 요인에 둔감해지는 경우가 많다9. 이러한 세포 기능의 손실은 주로 뻣뻣한 기질의 사용뿐만 아니라 폐 섬유아세포 및 평활근 세포와 같은 조직 특이적 기질 세포에 의해 자연적으로 방출되는 가용성 인자의 부족과 관련이 있는 것으로 보인다10,11.

화학-물리적 및 생물학적 복잡성의 부족이 시험관 내 세포의 생리적 거동을 제한한다는 것을 이해함으로써 보다 정교한 다세포 모델의 개발을 촉진했으며, 이는 신체 외부의 인간 조직의 복잡성을 더 잘 포착하는 것으로 입증되었습니다12,13. 1970년대 초에 최초의 공동 배양 모델이 만들어진 이래14, 합성 및 천연 하이드로겔의 도입은 천연 조직 미세 환경을 모방하는 능력을 크게 향상시켰고, 세포 분화를 유도하고, 세포의 자가 조직을 조직과 유사한 구조로 유도하며, 천연 조직 기능의 회복을 위한 귀중한 도구가 되었다15,16. 예를 들어, 적절한 3D 스캐폴드에서 성장할 때, 인간 세포는 스페로이드 또는 오가노이드와 같은 기능적 구조로 자가 배열되어 줄기 세포 마커를 발현할 수 있으며, 자가 재생이 가능하다17. 대조적으로, 인간 세포(줄기 세포 포함)는 전통적인 2D 기질에서 성장할 때 몇 번의 계대 후에 빠르게 노화되고 노화를 겪습니다18. 또한, 하이드로겔은 다공성, 공극 크기, 섬유 두께, 점탄성, 지형 및 강성과 같은 특정 조직 특성에 맞게 "맞춤형"으로 제작되거나 생리학적 또는 병리학적 상태를 에뮬레이션할 수 있는 조직 유래 세포 성분 및/또는 생리활성 분자로 추가로 조작될 수 있습니다19,20. 약물 검사에 대한 엄청난 잠재력에도 불구하고, 제약 연구에 사용되는 3D 하이드로겔 기반 모델은 생체 내 조직의 복잡한 세포 구조를 완전히 재현하지 못하며, 정수압, 순환 스트레칭 및 유체 전단을 포함하여 인체에 일반적으로 존재하는 중요한 혈역학적 및 기계적 자극이 부족합니다21.

장기 온 칩(Organs-on-chip, OOC)과 같은 미세생리학적 시스템(Microphysiological systems, MPS)은 최근 시험관 내에서 복잡한 생리학적 반응을 포착할 수 있는 도구로 등장했다 22,23. 이러한 모델은 종종 생체 기관의 동적 미세 환경을 모델링할 수 있는 미세 유체 플랫폼을 사용합니다.

우리는 3D 조직 생명 공학과 기계 생물학의 원리를 결합하여 복잡한 인간 상피 조직의 Open-Top Chip 모델을 만들었습니다. 이를 통해 우리는 상피 조직의 다세포 및 동적 미세 환경을 면밀히 요약할 수 있었습니다. 여기에는 생체 장기에 자연적으로 존재하지만 전통적인 체외 모델에서는 종종 무시되는 조직 특이적 생화학적 및 생체역학적 단서가 포함된다 24. Open-Top Chip은 다공성 멤브레인으로 분리된 혈관 구획(그림 1A)과 기질 구획(그림 1B)의 두 구획을 통합하여 두 챔버 사이에 영양분을 확산시킬 수 있습니다(그림 1C). 혈관 구획은 생리학적 전단 응력을 재현하기 위해 지속적인 유체 흐름에 노출되는 반면, 기질 챔버의 신축성 있는 설계는 호흡 운동 또는 장 연동 운동과 관련된 기계적 변형을 모델링할 수 있습니다. 기질 구획에는 조직 특이적 섬유아세포의 생리학적 성장을 지원하도록 설계된 조정 가능한 3D 하이드로겔 스캐폴드가 있습니다. 그것은 점막 조직의 인간 생리학을 더 잘 에뮬레이션 할 수있을뿐만 아니라 상피층에 직접 약물을 투여하기 위해 조직에 직접 접근 할 수있는 상태 인 공기 - 액체 계면의 확립을 용이하게하는 탈착식 뚜껑을 가지고 있습니다. 보충 그림 1은 치수 및 생물학적 구획(보충 그림 1A-D)과 이 프로토콜에 설명된 주요 기술 단계(보충 그림 1E)를 포함하여 Open-Top Chip 설계의 주요 구성 요소 중 일부를 캡처합니다.

Open-Top 칩의 관류는 프로그래밍 가능한 연동 펌프를 통해 이루어집니다(그림 1D). 연동 펌프 설정을 통해 12개의 Open-Top 칩을 동시에 관류할 수 있습니다. 대부분의 인큐베이터는 인큐베이터당 최대 24개의 칩을 배양할 수 있는 두 가지 설정을 수용할 수 있습니다. 기계적 스트레칭은 맞춤형 프로그래밍 가능한 진공 압력 조절기를 사용하여 이루어집니다(그림 1E). 디지털-아날로그 변환기에 의해 전자적으로 제어되는 전기 공압식 진공 조절기로 구성됩니다. 즉, 전기 공압식 진공 조절기는 사용자가 결정한 진폭과 주파수를 가진 정현파 진공 프로파일을 생성합니다. 0%에서 15% 범위의 주기적 변형률은 0에서 -90kPa 범위의 진폭과 0.2Hz의 주파수에서 Open-Top Chip의 진공 채널에 부압을 가하여 생성됩니다. 이는 이전에 채택되어 다른 논문25에서 기술된 상업적으로 이용 가능한 Flexcell Strain Unit과 동등한 맞춤형 시스템입니다. 예를 들어, 폐의 호흡 운동 또는 장의 연동 운동과 관련된 기계적 조직 변형을 모방하기 위해 공압 액추에이터는 인간 세포가 천연 조직에서 경험하는 변형률 및 빈도의 생리학적 수준과 일치하도록 크기와 진폭을 조정할 수 있는 정현파 진공/변형파를 적용합니다.

여기에서는 프로토타입 Open-Top Chip 플랫폼에서 유기형 상피 등가물을 엔지니어링하고 배양하기 위한 효율적이고 재현 가능한 방법을 설명합니다. 이를 통해 피부, 폐포, 기도 및 결장과 같은 복잡한 장기 모델을 생성할 수 있으며 혈관액 흐름과 기계적 스트레칭을 통합할 수 있습니다. 복잡한 상피 모델을 생성하기 위한 조직 공학 원리를 구현하는 동안 고려해야 하는 주요 기술적 측면을 간략하게 설명합니다. 우리는 현재 디자인의 장점과 가능한 한계에 대해 논의할 것입니다.

흐름 및 스트레칭 매개변수를 포함하여 조직 및 장기 성숙을 달성하는 데 사용되는 주요 단계에 대한 개요는 피부의 경우 그림 2, 폐포의 경우 그림 3, 기도의 경우 그림 4, 장의 경우 그림 5에 보고됩니다. 상이한 장기 모델을 배양하는 데 사용되는 배지 조성 및 시약에 관한 추가 정보는 보충 표에 포함되어 있습니다(피부에 대한 보충 표 1; 폐포에 대한 보충 표 2; 기도에 대한 보충 표 3 및 장에 대한 보충 표 4).

프로토콜

인간 콜로노이드는 신시내티 아동 병원의 기관 생물 안전위원회 (IBC 2017-2011)의 지침에 따라 장 절제술에서 얻었습니다.

1. 표면 활성화

  1. 활성화 완충액의 제조
    1. 가교제와 용매 완충 시약을 생물안전 캐비닛(BSC) 아래에 놓고 사용하기 전에 실온(RT)에서 10분 동안 평형을 이루도록 합니다.
    2. 가교제 용액을 직사광선 노출로부터 보호하기 위해 멸균 광 불투과성 용기 또는 알루미늄 호일로 싸인 투명한 15mL 원뿔형 튜브를 사용하여 용매 완충액 5mL에 가교제 5mg을 재구성합니다.
    3. 용액을 1분 동안 와동시켜 모든 덩어리를 제거한 다음, 50 μL의 가교결합제 용액을 칩의 하단 채널에 직접 피펫팅하고 150 μL를 개방된 상단 챔버 내로 피펫팅한다.
    4. 흡열기를 사용하여 칩 표면에서 과도한 가교 용액을 제거합니다. 그런 다음 추가로 50 μL의 가교 용액을 칩의 하단 채널에 직접 피펫하고 150 μL를 개방형 상단 챔버에 넣어 남아 있는 기포를 제거합니다.
  2. UV 가교 기계로 활성화
    1. BSC 아래의 칩에서 뚜껑을 부드럽게 제거하고 멸균 용기에 보관하십시오.
    2. 가교제 용액이 들어있는 칩을 페트리 접시에 옮기고 오염을 피하기 위해 페트리 접시를 닫은 다음 칩이 있는 접시를 UV 가교 기계 아래에 놓습니다.
      알림: UV 노출을 최대화하기 위해 페트리 접시 뚜껑을 제거합니다.
    3. 피크 파장 365nm의 UV 가교기를 100μJ/cm2의 강도로 설정하고 UV 광선을 20분 동안 켭니다.
      알림: UV 처리 20분 후 가교제 용액이 더 어두워집니다(갈색).
    4. 칩을 BSC 아래로 다시 가져오고 산화된 가교제 용액을 흡인합니다. 그런 다음 모든 칩을 용매 버퍼로 세 번 헹구고 칩을 BSC 아래에서 5-10분 동안 건조시켜 폴리디메틸실록산(PDMS) 표면의 화학적 기능화를 완료합니다.

2. 기질 등가물 준비

  1. 10x 재구성 완충액(100 mL)의 제조
    1. 중탄산나트륨 2.2g을 이중 증류수에 0.067M NaOH 75mL에 녹입니다.
    2. 4.76g의 hepes를 넣고 이중 증류수를 사용하여 부피를 100mL로 가져옵니다.
    3. 0.22 μm 멤브레인이 있는 일회용 멸균 병탑 필터를 사용하여 BSC 하에서 용액을 멸균 필터합니다.
      참고: 용액은 4°C에서 보관할 때 약 6개월 동안 안정적입니다.
  2. pre-gel 용액 부피의 추정
    1. 실험에 필요한 칩 수에 150μL(중앙 오픈 탑 챔버의 내부 부피)를 곱하여 실험에 필요한 프리겔 용액의 양을 추정합니다.
      필요한 부피 = (칩 수 x 150) μL
    2. 선택한 세포를 포함하는 10x EMEM 1 부피, 10x 재구성 완충액 1 부피 (2.1 단계 참조), 8 부피의 콜라겐 I 용액 (10 mg / mL) 및 1 μL의 1 N NaOH 용액 각 mg에 대해 혼합하여 얼음 위에서 콜라겐 프리 겔 용액을 준비합니다.
      알림: 실험 오류를 설명하기 위해 추가 +15% 볼륨을 준비하는 것이 좋습니다. 섹션 2.2에 설명된 예는 12개의 칩 및 추가 15% 부피에 대해 충분한 프리겔 용액을 준비하기 위한 상세한 단계별 절차를 제공합니다.
  3. 기질 당량에 대한 프리겔 용액의 제조(12칩용)
    1. 얼음 위의 BSC 아래에 다음 솔루션을 가져옵니다: 10x EMEM; 10x 재구성 버퍼 (단계 2.1 참조); 콜라겐 I 용액(10mg/mL); 및 멸균 1N NaOH 용액.
    2. 제공자의 지시에 따라 조직 특이적 중간엽 세포를 80%-90% 합류할 때까지 배양한 다음 트립신 또는 세포 제공자가 권장하는 다른 방법을 사용하여 세포를 해리합니다. 24°C에서 5분 동안 250 x g 에서 원심분리하여 펠릿에 세포를 수집합니다.
    3. 225 μL의 얼음처럼 차가운 10x EMEM에 세포 펠릿을 재현탁하고 225 μL의 얼음처럼 차가운 10x 재구성 완충액을 추가합니다 (2.1 단계 참조). 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 용액을 혼합한 다음 1,800μL의 얼음처럼 차가운 콜라겐 I 용액을 추가합니다.
    4. 얼음 위에서 프리젤 용액을 혼합하기 위해 기포를 피하면서 위아래로 5-6회 피펫을 합니다.
  4. 칩에 등가된 기질의 통합(12개 칩용)
    1. 프리겔 용액을 1N NaOH 18μL로 중화합니다. 5-6회 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 혼합한 다음 150μL의 세포가 함유된 하이드로겔을 기포를 피핑하여 Open-Top Chip의 중앙 챔버에 넣습니다.
      알림: 마이크로패터닝이 필요한 경우 다음 단계(섹션 3)로 이동하십시오.
    2. 칩을 각 페트리 접시에 2mL의 멸균ddH2O로 채워진 원심분리기 튜브 캡을 포함하여 별도의 페트리 접시로 그룹화하고 37°C, 5%CO2의 인큐베이터에서 페트리 접시를 배양합니다.
      참고: 90분 후 세포가 함유된 하이드로겔이 완전히 중합됩니다.

3. 표면 마이크로 패터닝 (선택 사항)

  1. 3D 프린팅 스탬프를 사용하여 중화된 콜라겐 하이드로겔(여전히 액체 상태)을 피펫팅한 후 기질 하이드로겔의 표면 마이크로패터닝을 수행합니다.
    주: 3D-프린팅된 스탬프는 이전에 다른 곳(24)에서 설명한 바와 같이, 다양한 커스터마이징 가능한 디자인으로 획득될 수 있다.
  2. 중화된 콜라겐 I 프리겔 용액 20 μL를 멸균된 3D 프린팅 스탬프의 패턴화된 표면에 피펫팅하고, 스트로마 하이드로겔이 여전히 액체 형태인 상태에서 오픈 탑 챔버의 내부(상부)에 스탬프를 삽입합니다.
  3. 흡인기(또는 피펫)를 사용하여 개방형 상단 챔버 상단에서 쏟아질 수 있는 하이드로겔의 잔류물을 제거합니다. 모든 칩을 별도의 페트리 접시로 그룹화하고 각 페트리 접시에 2mL의 멸균 ddH2O로 채워진 원추형 튜브 캡 15mL를 포함합니다.
  4. 모든 페트리 접시를 37°C, 5%CO2 에서 90분 동안 배양한 다음 칩을 BSC 아래로 다시 가져오고 정밀 핀셋을 사용하여 스탬프를 부드럽게 제거하여 하이드로겔 손상 위험을 줄입니다.

4. 조직 특이적 ECM 단백질로 상피 및 혈관 표면 코팅

  1. 혈관 미세유체 챔버를 세포외 기질 단백질로 코팅하는 단계;
    1. 실험에 필요한 칩 수에 20μL(혈관 채널의 부피)를 곱하여 실험에 필요한 혈관 ECM 코팅 용액의 부피를 추정합니다.
      필요한 부피 = (칩 수 x 20) μL
      알림: 실험 오류를 설명하기 위해 추가로 15%의 볼륨을 준비하는 것이 좋습니다.
    2. 얼음처럼 차가운 PBS 또는 HBSS를 사용하여 모든 칩에 대한 혈관 ECM 코팅 용액(예: 12개 칩당 300μL)을 준비합니다.
      참고: 보충 자료 섹션의 특정 장기 프로토콜 표를 참조하십시오(피부에 대한 보충 표 1 ; 폐포에 대한 보충 표 2 ; 기도에 대한 보충표 2 및 장에 대한 보충표 4 )에 대한 구체적인 시약 및 권장 ECM 조성을 확인할 수 있다.
    3. 20 μL의 혈관 ECM 코팅 용액을 각 칩의 혈관 채널에 피펫팅한다.
  2. 기질 등가물의 정점 표면을 세포외 기질 단백질로 코팅하는 단계; Coating the apical surface of the stromal equivalent, with the extracellular matrix proteins;
    1. 실험에 필요한 칩 수에 50μL(혈관 채널의 부피)를 곱하여 실험에 필요한 상피 ECM 코팅 용액의 부피를 추정합니다.
      필요한 부피 = (칩 수 x 50) μL
      참고: 실험 오류를 설명하기 위해 추가로 15%의 볼륨을 준비하는 것이 좋습니다.
    2. 얼음처럼 차가운 PBS 또는 HBSS에서 모든 칩에 대해 충분한 ECM 코팅 용액(예: 12개 칩당 750μL)을 준비하고 50μL의 상피 ECM 코팅 용액을 하이드로겔 표면 위에 직접 옮깁니다.
      참고: 보충 자료 섹션의 특정 장기 프로토콜 표를 참조하십시오(피부에 대한 보충 표 1 ; 폐포에 대한 보충 표 2 ; 기도에 대한 보충표 2 및 장에 대한 보충표 4 )에 대한 구체적인 시약 및 권장 ECM 조성을 확인할 수 있다.
    3. 칩을 각 페트리 접시에 2mL의 멸균ddH2O로 채워진 원심분리기 15mL 원추형 튜브 캡을 포함하여 별도의 페트리 접시로 그룹화하고 상피 세포 파종을 진행하기 전에 37°C, 5%CO2 2시간 동안 배양기에서 페트리 접시를 배양합니다.

5. 기질 등가물에 상피 세포 파종

  1. 상피 세포 배양
    1. 제공자의 지시에 따라 조직 특이적 상피 세포를 80%-90% 합류할 때까지 배양합니다.
    2. 세포 제공자가 권장하는 단백질 분해 효소 절차를 사용하여 세포를 해리합니다.
      참고: 최상의 결과를 얻으려면 활성 성장 단계 동안 낮은 통로(P1-P2)에서 상피 세포가 70%-90% 밀도에 도달할 때 수확하십시오.
    3. 일단 해리되면, 세포를 원심분리하고 펠릿으로 수집합니다.
    4. 특정 장기 프로토콜 표에 표시된 대로 상피 세포를 적절한 세포/단편 밀도로 재현탁합니다.
      참고: 이 연구에서는 피부 밀도 3 x 10 6 cells/mL, 폐포의 경우 1 x 106 cells/mL, 기도의 경우 6 x 10 6 cells/mL, 장의 경우 8 x 10 6 fragments/mL.
  2. 상피 세포 파종
    1. 인큐베이터에서 BSC로 칩을 옮깁니다. 혈관 채널에서 코팅 용액을 흡인하고 50μL의 신선한 내피 세포 배양 배지로 혈관 미세유체 채널을 세 번 헹굽니다.
    2. 하이드로겔 표면에서 코팅 용액을 흡인하고 100μL의 신선한 상피 세포 배양 배지로 기질 표면을 3회 헹구어 과도한 코팅 용액을 제거합니다.
    3. 상승 배지를 흡인하고 보충 표에 표시된 대로 적절한 세포 밀도를 사용하여 상피 세포 현탁액 50μL로 하이드로겔 표면을 시딩한 다음 칩을 다시 인큐베이터로 2시간(또는 콜로노이드의 경우 하룻밤) 동안 옮깁니다.
    4. 세포 배양 배지로 하이드로겔 표면을 두 번 부드럽게 헹구어 세포 파편을 제거합니다. 마지막으로 밀봉된 오토클레이브 용기에서 오토클레이빙하여 매체를 새로 고치고 칩을 연동 펌프에 연결합니다.

6. 칩을 흐름에 연결

  1. 유체 부품 준비
    1. 2인치의 생체적합성 폴리프로필렌계 열가소성 엘라스토머(TPE) 이송 튜브(재료 표)를 절단하여 칩을 미디어 저장소에 연결하는 데 필요한 짧은 미세유체 튜브를 준비합니다.
    2. 7.5인치의 생체적합성 TPE 이송 튜브를 절단하여 긴 미세유체 튜브를 만듭니다.
    3. 18G 및 19G 금속 커넥터 (재료 표)를 충분히 준비하십시오.
      알림: Open-Top 칩을 연동 펌프에 연결하기 최소 6.1.1일 전에 6.1.2단계 및 1단계에 설명된 튜브와 커넥터를 준비하고 멸균하는 것이 좋습니다.
    4. 4인치 피하 주사 바늘로 각 중간 저장소의 뚜껑을 뚫습니다(재료 표).
  2. 중간 탈기
    1. 세포 배양 배지가 실온(RT)으로 평형을 이루도록 합니다.
    2. 필요한 매체의 양을 원추형 여과 튜브로 옮깁니다.
    3. -20 PSI의 음의 진공 압력을 적용하여 매체의 가스를 제거합니다(진공 구동 여과).
      참고: 진공을 사용할 수 없는 경우 세포 배양 배지를 인큐베이터에서 밤새 평형을 유지하여 유사한 결과를 얻을 수 있습니다.
  3. 유체 흐름을 위한 Open-Top 칩 준비
    1. 칩과 멸균 유체 부품을 BSC 아래로 가져오고 유체 흐름을 시작하기 전에 Open-Top Chip 프로토타입을 밀봉하기 위해 Open-Top Chip의 뚜껑(상단 부분)을 정렬합니다.
    2. 기포를 피하기 위해 주의를 기울이면서 탈기된 세포 배양 배지(기관별 표 참조)의 200 μL를 칩의 상단 및 하단 채널의 입구 포트에 피펫팅합니다.
    3. 배양 배지 300 μL를 짧은 미세유체 튜브 내로 피펫팅하여 튜브의 내부 표면을 프라이밍하고, 짧은 튜브를 칩의 상부 및 하부 채널의 입구에 연결한다.
  4. 미세 유체 표면을 연결하고 프라이밍합니다
    1. 중간 저장소를 농장 랙에 배치하고, 피하 주사 바늘을 칩의 하단 입구에 연결하고, 마지막으로 인큐베이터 내부의 하우징 캐리어에 모든 칩을 수용합니다.
    2. 칩을 연동 펌프에 연결한 다음 모든 커넥터를 검사하여 모든 칩이 제대로 연결되어 있고 세포 배양 배지의 눈에 띄는 누출이 없는지 확인합니다.
    3. 펌프의 퍼지 버튼을 사용하여 약 15초 동안 또는 세포 배양 배지의 물방울이 유출 튜브 끝에 나타날 때까지 유지합니다.
    4. 펌프의 제어 시스템을 사용하여 적절한 오르간 칩 유량을 설정합니다(그림 2, 그림 3, 그림 4 및 그림 5).

7. 칩의 유지 보수

  1. 장기 칩 유지 관리
    1. 상피 및/또는 내피에 대한 새로운 세포 배양 배지를 준비하고 탈기 단계를 수행합니다(앞서 6.2단계에서 설명한 대로).
    2. 연동 펌프를 일시 중지하고 펌프에서 칩을 조심스럽게 분리한 다음 칩 하우징 캐리어를 빼냅니다. 칩을 인큐베이터에서 BSC로 옮기고 저장소에 남아있는 매체를 제거합니다.
    3. 상단 및 하단 입구 저장소에 있는 세포 배양 배지를 5mL의 신선한 세포 배양 배지로 교체하고 칩 하우징 캐리어를 다시 인큐베이터에 넣습니다. 칩을 연동 펌프에 연결하고 흐름을 다시 시작하십시오.
      알림: 퍼지 기능을 사용하여 매체를 혈관 구획으로 빠르게 새로 고치고 기포의 위험을 줄이는 것이 좋습니다.
    4. 그림 7.1.1, 그림 7.1.3, 그림 2 및 그림 3에 따라 격일로 4-4-5 단계를 반복합니다.
  2. 공기-액체 인터페이스(ALI) 구축
    1. 연동 펌프를 일시 중지하고 펌프에서 칩을 조심스럽게 분리한 다음 칩 하우징 캐리어를 빼냅니다. 칩을 인큐베이터에서 생물 안전 캐비닛으로 옮기고 상단 저장소에 남아있는 배지의 부피를 제거합니다.
    2. 상단 미세유체 채널에서 모든 배지를 부드럽게 흡인하고 clamp 바인더 클립을 사용하여 상단 입구에 연결된 짧은 미세유체 튜브를 사용하여 배지 증발 및 ALI 유지를 줄입니다.
    3. 하우징 캐리어의 Open-Top Chip을 인큐베이터에 다시 놓고 칩을 연동 펌프에 다시 연결합니다.
      알림: 퍼지 기능을 사용하여 매체를 혈관 구획으로 빠르게 새로 고치고 기포의 위험을 줄이는 것이 좋습니다.
    4. 연동 펌프를 시작하여 흐름을 재개합니다.
  3. 스트레칭 (선택 사항)
    1. 연동 펌프를 일시 중지하고 칩당 두 개의 긴 미세유체 튜브를 사용하여 칩의 진공 포트를 진공 모듈에 연결합니다.
    2. 진공 모듈을 사용하여 장기 프로토콜 표 내부에 지정된 대로 각 장기에 권장되는 조건으로 스트레칭 설정을 조정합니다. 폐포에 대한 보충 표 2 ; 기도에 대한 보충 표 2 ; 및 장에 대한 보충 표 4 .
    3. 튜브 연결부를 육안으로 검사하여 모든 칩이 제대로 연결되어 있고 중간 물방울이 보이지 않는지 확인하십시오.
    4. 연동 펌프를 시작하여 흐름을 재개합니다.

8. 혈관 구획의 내피 세포 파종

  1. 혈관 세포 파종을 위한 세포 및 칩 준비
    1. 제공자의 지시에 따라 조직 특이적 내피 세포를 80%-90% 합류할 때까지 배양합니다. 단백질 분해 효소 절차(공급자가 권장하는 대로)를 사용하여 세포를 해리하고 마지막으로 내피 세포를 3 x 106 cells/mL의 용액에 재현탁합니다.
      참고: 최상의 결과를 얻으려면 활성 성장 단계 동안 낮은 통로(P2-P4)에서 내피 세포가 70%-90% 밀도에 도달할 때 수확합니다.
    2. 연동 펌프를 일시 중지합니다. 인큐베이터에서 BSC로 칩을 옮기고 미디어 저장소와 연결된 튜브에서 칩을 분리한 다음 칩을 별도의 페트리 접시로 그룹화합니다.
    3. 상피구획의 세포 배양 배지를 신선한 상피 세포 배양 배지로 리프레시한다. 신선한 내피 세포 배양 배지로 혈관 채널을 두 번 헹구고 혈관 구획에서 배지를 흡인합니다.
  2. 내피 세포 파종
    1. 25μL의 내피 세포 현탁액(3 x 106 cells/mL)으로 하단(혈관) 채널에 시드하고 칩을 거꾸로 뒤집어 내피 세포가 미세유체 챔버의 상단 표면에 부착되도록 합니다.
      참고: 칩당 50μL의 세포 현탁액을 추가합니다(600개 칩당 12μL).
    2. 칩을 페트리 접시로 그룹화하십시오. 이들을 다시 37°C, 5%CO2 의 인큐베이터에 넣고, 내피 세포가 1시간 동안 부착되도록 한다.
    3. 1 시간 후, 칩을 인큐베이터에서 BSC로 옮깁니다. 혈관 채널을 내피 세포 배양 배지로 두 번 헹구어 세포 파편을 제거합니다.
    4. 8.2.1-8.2.2 단계를 반복하여 혈관 채널을 내피 세포로 다시 한 번 시딩하고 칩을 평평하게 놓아 혈관 채널의 바닥 표면에 내피 세포의 부착을 촉진합니다.
  3. 칩을 흐름에 다시 연결
    1. BSC 하에서 탈기된 혈관 세포 배양 배지로 혈관 배지 저장소를 채웁니다.
    2. 칩을 칩 하우징 캐리어 내부에 다시 넣고 칩을 한쪽 끝의 중간 저장소에 다시 연결하고 다른 쪽 끝의 연동 펌프에 칩을 다시 연결합니다.
      알림: 퍼지 기능을 사용하여 매체를 혈관 구획으로 빠르게 새로 고치고 기포의 위험을 줄이는 것이 좋습니다.
    3. 미세 유체 연결을 육안으로 검사하여 모든 칩이 제대로 연결되어 있고 중간 물방울이 보이지 않는지 확인합니다. 그런 다음 연동 펌프를 시작하여 유체 흐름을 재개합니다.

9. 일반적인 종말점 분석

  1. 종말점 분석을 위한 칩 분리
    1. 연동 펌프를 일시 중지하고 펌프에서 칩을 조심스럽게 분리한 다음 칩 하우징 캐리어를 빼냅니다. 칩 하우징 캐리어를 인큐베이터에서 BSC로 옮기고 칩을 자유롭게 설정합니다.
    2. Open-Top Chip의 중앙 챔버를 상피 세포 배양 배지로 부드럽게 세척하고 혈관 채널을 내피 배양 배지로 두 번 세척하여 세포 파편을 제거합니다.
    3. Open-Top Chip의 뚜껑을 제거하여 핀셋을 사용하여 칩의 정점 구획에 접근합니다.
  2. 형광 현미경을 위한 면역염색
    1. 기존의 샘플 고정, 투과화 및 차단을 진행합니다.
      참고: 이 연구에서, 샘플은 200 μL의 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)에 1 시간 동안 고정 된 후 PBS로 헹구고, 0.1 % Triton X-100에서 40 분 동안 투과시키고, 1 % 소 혈청 알부민에서 1 시간 동안 차단했습니다.
    2. 칩을 1차 항체(Table of Materials)와 함께 4°C에서 밤새 인큐베이션한다. 그런 다음 칩의 상피 및 내피 구획을 모두 200 μL의 PBS로 2회 세척합니다. 그런 다음 2 시간 동안 적절한 2 차 항체를 진행합니다.
      참고: 1차 항체와 2차 항체를 PBS + 1% BSA에 1:100(1차 항체) 및 1:200(2차 항체)으로 희석합니다.
  3. 면역조직화학
    1. 핀셋을 사용하여 Open-Top Chip의 메인 챔버에서 기질 등가물을 추출하고 10% 중성 완충 포르말린으로 채워진 1.5mL 튜브에 수집하고 최소 24시간 동안 배양합니다.
    2. 고정된 기질을 조직 프로세서에 해당하는 상태로 옮기고 아래 단계에 따라 최적의 샘플 탈수를 달성하십시오.
      1. 하이드로겔을 70% 에탄올에 90분 동안 담그십시오.
      2. 70% 에탄올을 제거하고 하이드로겔을 80% 에탄올에 90분 동안 담근다.
      3. 80% 에탄올을 제거하고 90분 동안 95% 에탄올에 하이드로겔을 담근다.
      4. 95% 에탄올을 제거하고 하이드로겔을 100% 에탄올에 90분 동안 2회 침지시킨다.
      5. 100% 에탄올을 제거하고 하이드로겔을 자일렌 용액에 120분 동안 2회 침지시킨다.
      6. 크실렌 용액을 제거하고 처리된 기질 등가물을 파라핀 왁스에 120분(~2시간) 동안 두 번 침투시킵니다.
    3. 침투된 기질 등가물을 절단 파라핀 블록에 포함합니다.
    4. 이 시점에서, 기질 등가물은 마이크로톰을 사용하여 파라핀 블록으로서 절편될 수 있고, 통상적인 조직학적 기술(26)에 따라 처리될 수 있다.

결과

표면 마이크로패터닝
세포외 기질(ECM)의 마이크로패터닝은 장 음와 인터페이스의 공간 구성을 복제하는 데 사용할 수 있습니다. Open-Top Chip 구성은 결장 상피-기질 경계면(그림 6A,B)과 마이크로미터 규모의 장 선와(그림 6C-E)의 자연 지형을 모방하도록 특별히 설계된 미세 패턴 스탬프를 통합하도록 수정할 수 있?...

토론

Open-Top Chip은 제어된 미세 환경에서 내피, 간질 및 상피 사이에서 발생하는 복잡한 세포 상호작용을 실시간으로 조사할 수 있는 플랫폼을 나타냅니다. 이 기술은 유체 전단(흐름), 순환 스트레칭 및 마이크로패터닝을 통해 달성된 상피 표면 지형의 재구성을 포함하여 인체 조직 미세 환경을 재구성하는 것과 관련된 물리적 및 생화학적 단서의 통합과 같은 기존의 기관형 및 오가노이드 배양?...

공개

저자는 잠재적인 경쟁 이익으로 간주될 수 있는 다음과 같은 재정적 이해관계/개인적 관계를 선언합니다. Varone Antonio는 Emulate Inc.의 전 직원이며 Emulate의 지분을 보유할 수 있습니다.

감사의 말

없음

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
10x EMEM Lonza12-684FMedium; Stroma
18 Gauge needleMicroGroup316H18RWTube stainless steel 316 welded, 18RW Full Hard 
19 Gauge needleMicroGroup316H19RWTube stainless steel 316 welded, 19RW Full Hard
2-Stop PharMed BPT Cole-Palmer EW-95723-12Tube, 0.25 mm, 12/pack
70% ethanol and wipes  -  - For surface sterilization 
8-Bromoadenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt (8-Br-cAMP)SigmaB7880Medium supplement 
A-83-01 Tocris 2939
AdenineSigmaA9795
Advanced DMEM/F12 Thermo12634010
Airway Epithelial CellsLifeline Cell TechnologyFC-0016
Aluminum foil  -  -  -
Alveolar cellsCell BiologicsH6621
Anti-ABCA3  ABCAM ab24751 Mouse monoclonal antibody [3C9] 
Anti-Aquaporin5 Alexa Fluor 647 ABCAM ab215225  Rabbit monoclonal antibody [EPR3747]  
Anti-Aquaporin5 ABCAM ab92320 Rabbit monoclonal antibody [EPR3747] 
Anti-beta IV Tubulin  ABCAM ab11315 Mouse monoclonal antibody [ONS.1A6] 
Anti-CD31 (PECAM-1) ABCAM ab9498 Mouse monoclonal [JC/70A] antibody  
Anti-CK5  ABCAM ab75869 Rabbit recombinant monoclonal [AY1E6] 
Anti-Cytokeratin 10  ThermoFisher MA5-13705 Mouse monoclonal antibody (DE-K10) 
Anti-Cytokeratin 14  ABCAM ab7800 Mouse monoclonal antibody 
Anti-E-Cadherin  ABCAM ab1416  Mouse monoclonal antibody 
Anti-Filaggrin  ThermoFisher PA5-79267 Rabbit polyclonal antibody  
Anti-HTI-56 Terrace Biotech TB-29AHT1-56  Mouse monoclonal antibody (IgG1) 
Anti-HTII-280 Terrace Biotech TB-27AHT2-280 Mouse monoclonal antibody (IgM) 
Anti-Involucrin  ThermoFisher MA5-11803 Mouse monoclonal antibody (SY5) 
Anti-Isoforms TA p63-α, -β, -γ  Biolengend 618902 Rabbit polyclonal antibody  
Anti-Ki67  ABCAM ab8191 Mouse monoclonal antibody [B126.1] 
Anti-LAMP3  ABCAM ab111090 Rabbit polyclonal antibody 
Anti-Mature SP-B Seven Hill WRAB-48604 Rabbit polyclonal antibody 
Anti-MUC5AC  ThermoFisher PA5-34612 Rabbit polyclonal antibody  
Anti-Mucin-2 SantaCruz Biotechnologysc-7314Mouse monoclonal antibody (IgG1) 
Anti-p63  Dako GA662 Mouse monoclonal antibody p63 Protein (Dako Omnis) Clone DAK-p63 
Anti-PCNA  ThermoFisher PA5-32541 Rabbit polyclonal antibody  
Anti-Podoplanin (AT-1α)  ABCAM ab128994 Rabbit polyclonal antibody 
Anti-Pro + Mature Surfactant Protein B ABCAM ab40876 Rabbit polyclonal antibody 
Anti-Surfactant C   Seven Hill  WRAB-9337  Rabbit polyclonal antibody 
Anti-Uteroglobin/SCGB1A1 Hycult Biotech HM2178 Mouse monoclonal antibody [AY1E6] 
Anti-VE-cadherin  ABCAM ab33168 Rabbit polyclonal antibody  
Anti-ZO-1  ThermoFisher 33-9100 Mouse monoclonal antibody [1A12] 
Ascorbic acidSigmaA4544
Aspirating pipettes Corning / Falcon 357558 2 mL, polystyrene, individually wrapped 
Aspirating tips  -  - Sterile (autoclaved) 
B27Thermo17504044
Blocker BSA (10X) in PBS solution  ThermoFisher 37525 Blocker agent 
Calcium ChlorideSigmaC7902
CHIR 99021Tocris4423
Collagen IAdvanced Biomatrix513310 mg/mL (Stroma)
Collagen I Advanced BioMatrix50053 mg/mL (Vascular ECM)
Collagen IVSigma C5533
Collagen-IVSigma C5533-5MG Collagen from human placenta, 5 mg powder, reconstitute to 1 mg/mL 
Colonic Fibroblasts Cell Biologics H6231
Colonic microvascular endothelial cells Cell BiologicsH6203 
Conical tubes   -  - 15 mL and 50 mL polypropylene, sterile 
Crosslinker (ER-1) Emulate 104615 mg powder 
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)  ThermoFisher D3571 DNA probe 
Dermal fibroblastsATCCPCS-201-010
Dermal microvascular endothelial cellsATCCCRL-3243
DexamethasoneSigmaD4902
DMEMThermoFisher11054020
DMEM/F-12 GIBCO 11320082
DMEM/F-12, GlutaMAX  GIBCO 10565-018 Basal medium for ALI medium 
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488)  ABCAM ab150105 Donkey Anti-Mouse secondary antibody  
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 568)  ABCAM ab175472 Donkey Anti-Mouse secondary antibody 
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647)  ABCAM ab150107 Donkey Anti-Mouse secondary antibody 
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488)  ABCAM  ab150073 Donkey Anti-Mouse secondary antibody 
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 568)  ABCAM ab175470 Donkey Anti-Mouse secondary antibody 
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 647)  ABCAM ab150075 Donkey Anti-Mouse secondary antibody 
Dulbecco’s PBS (DPBS-/-) (without Ca2+, Mg2+) Corning 21-031-CV 1x 
Epidermal Growth Factor (EGF) human, recombinant in E. coliPromoCellC-60170Medium supplement 
F-12 Ham’sInvitrogen 21700-108For vascular ECM
FibriCol Advanced BioMatrix 5133-20ML Collagen-I solution (10 mg/mL)
FibronectinCorning356008
Fibronectin, Human, Natural,  Corning 47743-654 human plasma fibronectin 
Fine-tip precision tweezers Aven18056USA Technik Style 5B-SA Precision Stainless Steel Tweezers
GlutamaxInvitrogen 21700-108
Glutamax Invitrogen 35050061
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 594)  ABCAM ab150080 Goat Anti-Mouse secondary antibody  
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647)  ABCAM ab150115 Goat Anti-Mouse secondary antibody  
Goat Anti-Mouse IgG H&L (FITC)  ABCAM ab6785 Goat Anti-Mouse secondary antibody  
Goat Anti-Mouse IgG1 Alexa Fluor 568  ThermoFisher A-21124 Goat Anti-Mouse IgG1 secondary antibody 
Goat Anti-Mouse IgM Alexa Fluor 488  ThermoFisher A-21042 Goat Anti-Mouse IgM secondary antibody 
Handheld vacuum aspirator Corning 4930  - 
Heat Inactivated HyClone FetalClone II Serum (FCS) GE Healthcare Life SciencesSH30066.03
Hemocytometer  -  - - 
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosaSigmaH3149
HEPESThermo15630080
Human [Leu15] - Gastrin SigmaG9145
Human colonoidsObtained from clinical resectionsObtained from clinical resections
Human EGF Recombinant Protein ThermoPHG0311L
human epithelial growth factor Thermo PHG0311
HyClone FetalClone II Serum (U.S.)  GE Healthcare SH30066.02HI  Sterile FBS heat-inactivated 
Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium saltSigmaH4881
Hydrocortisone PromoCell  C-64420 Medium supplement  
Ice bucket  -  -  - 
Ismatec IPC-N Cole-PalmerEW-78000-41Low-Speed Digital Peristaltic Pump; q24-Channel (1 per 12 Chips)
ITESBioWhittaker17-839Z
Keratinocyte Growth Factor (KGF), also known as Basic Fibroblast Growth Factor 7 (FGF-7), human, recombinant in HEKPromoCellC-63821
KeratinocytesATCCPCS-200-010
Laminin BiolaminaCT521-0501 
Laminin, 521 CTG (CT521) Biolamina  CT521-0501 human recombinant laminin 521    
Lung FibroblastCell BiologicsH6013
Lung FibroblastLifeline Cell TechnologyFC-0049
Lung microvascular endothelial cellsLonzaCC-2527
Lung smooth muscle cellsLifeline Cell TechnologyFC-0046
Manual counter  -  -  -
Masterflex (TPE) Transfer Tubing Cole-PalmerFV-96880-02PharMed BPT, 1/32" ID x 5/32" OD
Medium 199, no phenol redThermo 11043023
Microcentrifuge tube  -   -  1.5 mL, sterile 
Microscope (with camera)  -  - For bright-field imaging 
N2Sigma17502001
N-acetyl cysteineSigmaA5099
Noggin (HEK293T conditioned medium)SigmaN17001
Normal Goat Serum  ThermoFisher 50062Z Blocking solution  
O-phosphosrylethanolamine SigmaP0503
Paraformaldehyde (4% wt/vol)  EMS 15710 Fixing agent 
Penicillin StreptomycinGIBCO15140122
Penicillin-streptomycin Sigma P4333 10,000 U/mL; 10 mg/mL 
Pipette tips   -  - P20, P200, and P1000 sterile, low adhesion
Pipette Gilson  F167380 P20, P200, and P1000 
PluriQ Serum Replacement (or alternatively KO Serum replacement)AMSBIO (or Thermo)N/A (or C1910828010)
Poly-L-Lysine coated microscope glass slides  Sigma P0425 Glass slides 
PrimocinInvivoGenant-pm-1
ProgesteroneSigmaP8783
ProLong Gold  ThermoFisher P36931 Antifade Mountant with DAPI 
Retinoic Acid SigmaR2625
ROCK inhibitor (Y27632)TocrisTB1254-GMP/10
R-spondin (HEK293T conditioned medium)SigmaSCC111
SAGM SingleQuots supplements LonzaCC-4124
SAGMTM Small Airway Epithelial Cell Growth medium BulletKitTM Lonza CC-4124 Medium supplements 
SB2001190 Tocris 1264/10
Serological pipettes  -  - 2 mL, 5 mL, 10 mL, and 25 mL low endotoxin, sterile 
Small Airway Epithelial Cell Growth medium (SAGM)Lonza CC-4124 
Solvent Buffer (ER-2) Emulate 1046225 mL bottle 
Steriflip-HV MilliporeSE1M003M00Sterile filtering conical tube
Sterilin 100 mm Square Petri DishesThermo103Sterile, 1 per 6 chips 
T25 flasks  -  -  -
T75 flasks  -  -  - 
Tri-iodothyronineSigmaT5516
Triton X-100 (0.3% (vol/vol)  Sigma T8787 Permeabilization agent 
Trypan blue Sigma 93595 0.4% solution 
TrypEE solution Sigma 12604013 Cell detaching solution 
TWEEN-20 Sigma P2287 Permeabilization agent 
UV Light Oven (peak frequency 365nm, intensity of 100 µJ/cm2)VWR21474-598UVP, Long Range UV, 365 nm 60Hz Model CL-1000L
Vacuum set-up  -  - Minimum pressure: -70 kPa 
Vascular Endothelial Growth Factor 165 (VEGF-165) human, recombinant in E. coliPromoCellC-64420
VEGF-165  PromoCell  C-64420 Medium supplement 
Von Willebrand Factor conjugated FITC  ABCAM ab8822 Sheep polyclonal antibody 
Water bath (or beads)  -  - Set to 37 °C 
Wnt3A (L-Wnt3A conditioned medium)ATCCCRL-2647

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