Reconstitution de la cytoarchitecture et de la fonction des tissus épithéliaux humains sur une puce organique à sommet ouvert

Résumé

Le présent protocole décrit les capacités et les modalités de culture essentielles de l’Open-Top Organ-Chip pour l’établissement et la maturation réussis de cultures d’organes sur puce de pleine épaisseur de tissus primaires (peau, alvéole, voies respiratoires et intestin), offrant la possibilité d’étudier différents aspects fonctionnels de l’interface épithéliale/mésenchymateuse et vasculaire humaine in vitro.

Résumé

Presque tous les organes humains sont tapissés de tissus épithéliaux, comprenant une ou plusieurs couches de cellules étroitement connectées organisées en structures tridimensionnelles (3D). L’une des principales fonctions de l’épithélium est la formation de barrières qui protègent les tissus sous-jacents contre les agressions physiques et chimiques et les agents infectieux. En outre, l’épithélium intervient dans le transport des nutriments, des hormones et d’autres molécules de signalisation, créant souvent des gradients biochimiques qui guident le positionnement et la compartimentation des cellules dans l’organe. En raison de leur rôle central dans la détermination de la structure et de la fonction des organes, les épithéliums sont des cibles thérapeutiques importantes pour de nombreuses maladies humaines qui ne sont pas toujours capturées par les modèles animaux. Outre les différences évidentes d’une espèce à l’autre, la réalisation d’études de recherche sur la fonction barrière et les propriétés de transport de l’épithélium chez les animaux est encore aggravée par la difficulté d’accéder à ces tissus dans un système vivant. Bien que les cultures de cellules humaines bidimensionnelles (2D) soient utiles pour répondre à des questions scientifiques fondamentales, elles donnent souvent de mauvaises prédictions in vivo . Pour surmonter ces limitations, au cours de la dernière décennie, une pléthore de plates-formes biomimétiques micro-modifiées, connues sous le nom d’organes sur puce, ont émergé comme une alternative prometteuse aux tests in vitro et animaux traditionnels. Ici, nous décrivons une puce d’organe à sommet ouvert (ou puce à toit ouvert), une plate-forme conçue pour modéliser les tissus épithéliaux spécifiques aux organes, y compris la peau, les poumons et les intestins. Cette puce offre de nouvelles possibilités de reconstituer l’architecture multicellulaire et la fonction des tissus épithéliaux, y compris la capacité de recréer un composant stromal 3D en incorporant des fibroblastes et des cellules endothéliales spécifiques aux tissus dans un système mécaniquement actif. Cette puce Open-Top fournit un outil sans précédent pour étudier les interactions épithéliales/mésenchymateuses et vasculaires à plusieurs échelles de résolution, des cellules individuelles aux constructions tissulaires multicouches, permettant ainsi la dissection moléculaire de la diaphonie intercellulaire des organes épithélialisés dans la santé et la maladie.

Introduction

Historiquement, les scientifiques se sont appuyés sur des tests précliniques sur des animaux pour la découverte de médicaments, mais un nombre croissant de ces méthodes ont été remises en question en raison d’une faible corrélation avec les résultats humains¹. La mise en œuvre des principes des « 3R » pour remplacer, réduire et affiner l’expérimentation animale incite les scientifiques à trouver de nouvelles méthodes alternatives in vitro pour soutenir l’évaluation préclinique des risques toxicologiques et chimiques². Cependant, de nombreux modèles in vitro développés à ce jour n’ont pas l’architecture biologique, la complexité cellulaire et l’environnement mécanique nécessaires pour récapituler la nature dynamique des organes vivants humains ^3,4.

Les systèmes précliniques in vitro conventionnels utilisent généralement des monocultures 2D de cellules humaines cultivées sur une surface en plastique rigide. Ces méthodes fournissent un outil pour mener des études mécanistiques simples et permettent un dépistage rapide des candidats médicaments. En raison de leur coût relativement faible et de leur grande robustesse, les modèles 2D sont souvent associés à des systèmes automatiques à haut débit et utilisés pour l’identification rapide de candidats médicaments potentiels au début du processus de développement de médicaments ^5,6. Cependant, de tels modèles 2D ne fournissent pas d’approche translationnelle pour modéliser les réponses tissulaires, organiques ou systémiques aux candidats thérapeutiques, ce qui est nécessaire pour prédire avec précision l’innocuité et l’efficacité des médicaments au cours de la phase préclinique de leur développement. Les cultures de cellules plates ne récapitulent pas le microenvironnement tissulaire natif, y compris l’interaction multicellulaire complexe, les propriétés biomécaniques et l’architecture tridimensionnelle (3D) des tissus humains⁷. Les cellules qui se développent sur une surface plane n’acquièrent souvent pas de phénotype mature et, par conséquent, ne peuvent pas répondre aux stimuli pharmacologiques comme elles le feraient dans le tissu natif. Par exemple, les cellules épithéliales alvéolaires humaines primaires cultivées in vitro présentent un phénotype épidermoïde et perdent des marqueurs phénotypiques clés, y compris les protéines surfactantes C et B (SP-C et SP-B)⁸. En plus d’une différenciation insuffisante, les cellules primaires deviennent souvent insensibles aux facteurs de stress biologiques in vitro, car certaines voies biochimiques associées à l’inflammation tissulaire deviennent non fonctionnelles⁹. Une telle perte de fonction cellulaire semble être principalement associée à l’utilisation de substrats rigides ainsi qu’à l’absence de facteurs solubles naturellement libérés par les cellules stromales spécifiques aux tissus telles que les fibroblastes pulmonaires et les cellules musculaires lisses^10,11.

Comprendre que l’absence de complexité chimio-physique et biologique limite le comportement physiologique des cellules in vitro a favorisé le développement de modèles multicellulaires plus sophistiqués, qui se sont avérés mieux saisir la complexité des tissus humains à l’extérieur du corps^12,13. Depuis la création des premiers modèles de co-culture au début des années^{1970 14}, l’introduction d’hydrogels synthétiques et naturels a considérablement amélioré la capacité d’imiter les microenvironnements tissulaires natifs et est devenue un outil inestimable pour stimuler la différenciation cellulaire, guider l’auto-organisation des cellules dans des structures tissulaires et restaurer les fonctions tissulaires natives^15,16. Par exemple, lorsqu’elles sont cultivées dans l’échafaudage 3D approprié, les cellules humaines peuvent s’auto-organiser en structures fonctionnelles telles que des sphéroïdes ou des organoïdes, exprimant des marqueurs de cellules souches, et sont capables de s’auto-renouveler¹⁷. En revanche, les cellules humaines (y compris les cellules souches), lorsqu’elles sont cultivées sur des substrats 2D traditionnels, vieillissent rapidement et subissent une sénescence après quelques passages¹⁸. En outre, les hydrogels peuvent être « adaptés » pour correspondre à des propriétés tissulaires spécifiques telles que la porosité, la taille des pores, l’épaisseur des fibres, la viscoélasticité, la topographie et la rigidité, ou modifiés avec des composants cellulaires dérivés de tissus et/ou des molécules bioactives permettant l’émulation des conditions physiologiques ou pathologiques^19,20. Malgré leur énorme potentiel pour les tests de médicaments, les modèles 3D à base d’hydrogel utilisés dans la recherche pharmaceutique ne récapitulent pas complètement la cytoarchitecture complexe des tissus in vivo et manquent de stimuli hémodynamiques et mécaniques importants normalement présents dans le corps humain, y compris la pression hydrostatique, l’étirement cyclique et le cisaillement des fluides²¹.

Les systèmes microphysiologiques (MPS) tels que les organes sur puce (OOC) sont récemment apparus comme des outils capables de capturer des réponses physiologiques complexes in vitro^22,23. Ces modèles utilisent souvent l’utilisation de plates-formes microfluidiques, qui permettent de modéliser le microenvironnement dynamique des organes vivants.

Nous avons combiné les principes de la bio-ingénierie tissulaire 3D et de la mécanobiologie pour créer un modèle de puce à toit ouvert de tissu épithélial humain complexe. Cela nous a permis de récapituler de près le microenvironnement multicellulaire et dynamique des tissus épithéliaux. Cela inclut les indices biochimiques et biomécaniques spécifiques aux tissus naturellement présents dans les organes vivants, mais souvent négligés par les modèles in vitro traditionnels²⁴. L’Open-Top Chip comprend deux compartiments : un compartiment vasculaire (Figure 1A) et un compartiment stromal (Figure 1B) séparés par une membrane poreuse, permettant la diffusion des nutriments entre les deux chambres (Figure 1C). Le compartiment vasculaire est exposé à un écoulement continu de fluide pour récapituler le stress physiologique de cisaillement, tandis que la conception extensible de la chambre stromale permet de modéliser la contrainte mécanique associée aux mouvements respiratoires ou au péristaltisme intestinal. Le compartiment stromal abrite l’échafaudage d’hydrogel 3D accordable conçu pour soutenir la croissance physiologique des fibroblastes spécifiques aux tissus. Il possède un couvercle amovible qui facilite l’établissement d’une interface air-liquide, une condition qui permet une plus grande émulation de la physiologie humaine des tissus muqueux ainsi qu’un accès direct au tissu pour administrer des médicaments directement sur la couche épithéliale. La figure supplémentaire 1 présente certains des éléments clés de la conception de la puce à toit ouvert, y compris les dimensions et les compartiments biologiques (figure supplémentaire 1A-D), ainsi que les principales étapes techniques décrites dans le présent protocole (figure supplémentaire 1E).

La perfusion de la puce Open-Top est réalisée à l’aide d’une pompe péristaltique programmable (Figure 1D). La configuration de la pompe péristaltique permet de perfuser simultanément 12 puces à toit ouvert. La plupart des incubateurs peuvent héberger deux configurations permettant la culture de jusqu’à 24 puces par incubateur. L’étirement mécanique est réalisé à l’aide d’un régulateur de pression à vide programmable sur mesure (Figure 1E). Il se compose d’un régulateur de vide électropneumatique contrôlé électroniquement par un convertisseur numérique-analogique. En d’autres termes, le régulateur de vide électropneumatique génère un profil de vide sinusoïdal avec une amplitude et une fréquence déterminées par l’utilisateur. Une déformation cyclique allant de 0% à 15% est générée en appliquant une pression négative au canal de vide de la puce Open-Top à une amplitude allant de 0 à -90 kPa et une fréquence de 0,2 Hz. Il s’agit d’un système sur mesure équivalent à l’unité de contrainte Flexcell disponible dans le commerce précédemment adoptée et décrite dans d’autres documents²⁵. Pour imiter la déformation mécanique des tissus associée, par exemple, au mouvement respiratoire du poumon ou au péristaltisme de l’intestin, l’actionneur pneumatique applique des ondes sinusoïdales de vide/déformation dont l’amplitude et l’amplitude peuvent être ajustées pour correspondre au niveau physiologique de déformation et à la fréquence que les cellules humaines subissent dans leur tissu natif.

Ici, nous décrivons une méthode efficace et reproductible pour l’ingénierie et la culture d’équivalents d’épithélium organotypiques sur un prototype de plate-forme Open-Top Chip. Il permet la génération de modèles d’organes complexes tels que la peau, l’alvéole, les voies respiratoires et le côlon tout en intégrant un écoulement de fluide vasculaire et des étirements mécaniques. Nous décrirons les aspects techniques clés qui doivent être pris en compte lors de la mise en œuvre des principes de l’ingénierie tissulaire pour générer des modèles épithéliaux complexes. Nous discuterons des avantages et des limites possibles de la conception actuelle.

Un aperçu des principales étapes utilisées pour atteindre la maturation des tissus et des organes, y compris les paramètres d’écoulement et d’étirement, est présenté dans : Figure 2 pour la peau, Figure 3 pour l’alvéole, Figure 4 pour les voies respiratoires et Figure 5 pour l’intestin. Des informations supplémentaires concernant la composition des milieux et les réactifs utilisés pour la culture des différents modèles d’organes sont incluses dans les tableaux supplémentaires (tableau supplémentaire 1 pour la peau; Tableau supplémentaire 2 pour l’alvéole; Tableau supplémentaire 3 pour les voies respiratoires et Tableau supplémentaire 4 pour l’intestin).

Protocole

Les colonoïdes humains ont été obtenus à partir de résections intestinales conformément aux directives du Comité institutionnel de biosécurité de l’hôpital pour enfants de Cincinnati (IBC 2017-2011).

1. Activation de Surface

1. Préparation du tampon d’activation
   1. Placer les réactifs tampons de réticulation et de solvant sous l’enceinte de biosécurité (ESB) et les laisser s’équilibrer à température ambiante (RT) pendant 10 minutes avant utilisation.
   2. Reconstituer 5 mg de réticulant dans 5 mL du tampon solvant à l’aide d’un contenant stérile imperméable à la lumière ou d’un tube conique transparent de 15 ml enveloppé dans une feuille d’aluminium pour protéger la solution de réticulation de l’exposition directe à la lumière.
   3. Vortex la solution pendant 1 min pour éliminer tous les touffes, puis pipeter 50 μL de la solution de réticulation directement dans le canal inférieur de la puce et 150 μL dans la chambre ouverte.
   4. Retirez tout excès de solution de réticulation de la surface de la puce à l’aide d’un aspirateur. Ensuite, pipeter 50 μL supplémentaires de la solution de réticulation directement dans le canal inférieur de la puce et 150 μL dans la chambre à dessus ouvert pour éliminer toute bulle d’air restante.
2. Activation avec machine de réticulation UV
   1. Retirez délicatement le couvercle de la puce sous l’ESB et conservez-le dans un récipient stérile.
   2. Transférer les copeaux contenant la solution de réticulation dans une boîte de Pétri, fermer la boîte de Petri pour éviter toute contamination et placer la boîte avec les copeaux sous la réticulation UV.
      REMARQUE: Retirez le couvercle de la boîte de Petri pour maximiser l’exposition aux UV.
   3. Réglez la machine de réticulation UV avec une longueur d’onde maximale de 365 nm à une intensité de 100 μJ/^cm2 et allumez la lumière UV pendant 20 min.
      REMARQUE: Après 20 min de traitement UV, la solution de réticulation aura l’air plus foncée (brune).
   4. Ramener les copeaux sous l’ESB et aspirer la solution de réticulation oxydée. Ensuite, rincez tous les copeaux trois fois avec le tampon solvant et laissez sécher les copeaux sous l’ESB pendant 5 à 10 minutes pour terminer la fonctionnalisation chimique de la surface du polydiméthylsiloxane (PDMS).

2. Préparation de l’équivalent stroma

1. Préparation du tampon de reconstruction 10x (100 mL)
   1. Dissoudre 2,2 g de bicarbonate de sodium dans 75 mL de NaOH 0,067 M dans de l’eau bidistillée.
   2. Ajouter 4,76 g d’HEPES et porter le volume à 100 mL en utilisant de l’eau bidistillée.
   3. Filtrer stérile la solution sous l’ESB à l’aide d’un filtre stérile jetable à dessus de bouteille avec une membrane de 0,22 μm.
      REMARQUE: La solution est stable pendant environ 6 mois lorsqu’elle est stockée à 4 ° C.
2. Estimation du volume de la solution de prégel
   1. Multipliez le nombre de copeaux nécessaires à l’expérience par 150 μL (volume intérieur de la chambre centrale ouverte) pour estimer la quantité de solution de prégel requise pour l’expérience :
      Volume nécessaire = (Nombre de puces x 150) μL
   2. Préparer la solution de prégel de collagène sur glace en mélangeant : 1 volume de 10x EMEM contenant les cellules au choix, 1 volume de tampon de reconstruction 10x (voir étape 2.1), 8 volumes de solution de collagène I (10 mg/mL) et 1 μL de solution 1 N NaOH pour chaque mg de collagène I.
      NOTE: Il est recommandé de préparer un volume supplémentaire de +15% pour tenir compte des erreurs expérimentales; L’exemple décrit à la section 2.2 fournit une procédure détaillée étape par étape pour préparer suffisamment de solution de prégel pour 12 copeaux et un volume supplémentaire de 15%.
3. Préparation de la solution de pré-gel pour l’équivalent stroma (pour 12 copeaux)
   1. Apportez les solutions suivantes sous le BSC sur la glace : 10x EMEM; 10x Tampon de reconstruction (voir étape 2.1); Solution de collagène I (10 mg/mL); et solution stérile de NaOH 1 N.
   2. Cultivez des cellules mésenchymateuses spécifiques aux tissus selon les directives des fournisseurs jusqu’à ce que 80% à 90% confluentes, puis dissociez les cellules à l’aide de trypsine ou d’autres méthodes recommandées par le fournisseur de cellules. Recueillir les cellules dans une pastille par centrifugation à 250 x g pendant 5 min à 24 °C.
   3. Remettez en suspension la pastille de la cellule dans 225 μL d’EMEM 10x glacé et ajoutez 225 μL de tampon de reconstruction 10x glacé (voir étape 2.1). Mélanger la solution en pipetant doucement de haut en bas, puis ajouter 1 800 μL de solution de collagène I glacée.
   4. Pipeter de haut en bas 5-6 fois, en évitant les bulles pour mélanger la solution de prégel sur la glace.
4. Incorporation de l’équivalent stroma sur puce (pour 12 puces)
   1. Neutraliser la solution de prégel avec 18 μL de NaOH 1 N. Mélanger doucement en pipetant de haut en bas 5-6 fois, puis pipeter 150 μL d’hydrogel chargé de cellules dans la chambre centrale de la puce Open-Top en évitant les bulles.
      REMARQUE : Si un micropatronage est nécessaire, veuillez passer à l’étape suivante (section 3).
   2. Regroupez les copeaux dans des boîtes de Petri distinctes, y compris un bouchon de tube de centrifugation rempli de 2 ml de ddH 2 O stérile dans chaque boîte de Pétri, et incuber la ou les boîtes de Petri dans l’incubateur à 37 °C, 5% CO₂.
      REMARQUE: Après 90 min, l’hydrogel chargé de cellules sera complètement polymérisé.

3. Micropatterning de surface (facultatif)

1. Effectuer un micromodelage de surface de l’hydrogel stromal après avoir pipeté l’hydrogel de collagène neutralisé (encore à l’état liquide) à l’aide de tampons imprimés en 3D.
   REMARQUE: Les timbres imprimés en 3D peuvent être obtenus dans divers modèles personnalisables, comme décrit précédemment ailleurs²⁴.
2. Pipeter 20 μL de la solution de pré-gel de collagène I neutralisée sur la surface à motifs d’un tampon stérile imprimé en 3D et insérer le tampon à l’intérieur (sur le dessus) de la chambre ouverte pendant que l’hydrogel stromal est encore sous forme liquide.
3. Enlevez tout résidu d’hydrogel qui pourrait se répandre du haut de la chambre ouverte à l’aide d’un aspirateur (ou d’une pipette). Regroupez toutes les copeaux dans des boîtes de Petri distinctes et incluez un bouchon de tube conique centrifuge de 15 ml rempli de 2 ml de ddH₂O stérile dans chaque boîte de Poutri.
4. Incuber toutes les boîtes de Petri à 37 °C, 5 % de CO₂ pendant 90 min, puis ramener les copeaux sous l’ESB et retirer délicatement les tampons à l’aide d’une pince à épiler de précision pour réduire le risque d’endommager l’hydrogel.

4. Recouvrir la surface épithéliale et vasculaire de protéines ECM spécifiques aux tissus

1. Recouvrir la chambre microfluidique vasculaire de protéines de matrice extracellulaire
   1. Multipliez le nombre de puces nécessaires à l’expérience par 20 μL (volume du canal vasculaire) pour estimer le volume de solution de revêtement ECM vasculaire requis pour l’expérience :
      Volume nécessaire = (Nombre de puces x 20) μL
      REMARQUE : Il est recommandé de préparer un volume supplémentaire de 15 % pour tenir compte des erreurs expérimentales.
   2. Préparez la solution de revêtement ECM vasculaire pour toutes les puces (par exemple, 300 μL pour 12 puces) en utilisant du PBS ou du HBSS glacé.
      NOTA : Reportez-vous au tableau spécifique du protocole d’organe dans la section des matériaux supplémentaires (Tableau supplémentaire 1 pour la peau; Tableau supplémentaire 2 pour l’alvéole; Tableau supplémentaire 2 pour les voies respiratoires et Tableau supplémentaire 4 pour l’intestin) pour identifier les réactifs spécifiques et la composition ECM recommandée.
   3. Pipeter 20 μL de solution de revêtement ECM vasculaire dans le canal vasculaire de chaque puce.
2. Recouvrir la surface apicale de l’équivalent stromal de protéines de matrice extracellulaire
   1. Multipliez le nombre de puces nécessaires à l’expérience par 50 μL (volume du canal vasculaire) pour estimer le volume de solution de revêtement ECM épithéliale nécessaire à l’expérience :
      Volume nécessaire = (Nombre de puces x 50) μL
      REMARQUE: il est recommandé de préparer un volume supplémentaire de 15% pour tenir compte des erreurs expérimentales.
   2. Préparez suffisamment de solution de revêtement ECM pour toutes les puces (par exemple, 750 μL par 12 puces) dans du PBS ou du HBSS glacé et transférez 50 μL de solution de revêtement ECM épithéliale directement sur la surface de l’hydrogel.
      NOTA : Reportez-vous au tableau spécifique du protocole d’organe dans la section des matériaux supplémentaires (Tableau supplémentaire 1 pour la peau; Tableau supplémentaire 2 pour l’alvéole; Tableau supplémentaire 2 pour les voies respiratoires et Tableau supplémentaire 4 pour l’intestin) pour identifier les réactifs spécifiques et la composition ECM recommandée.
   3. Regroupez les copeaux dans des boîtes de Petri distinctes, y compris un capuchon de tube conique centrifuge de 15 ml rempli de 2 ml de ddH 2 O stérile dans chaque boîte de Pétri, et incuber la ou les boîtes de Petri dans l’incubateur à 37 °C, 5% de CO 2 pendant₂h avant de procéder à l’ensemencement des cellules épithéliales.

5. Ensemencement des cellules épithéliales sur l’équivalent stromal

1. Culture de cellules épithéliales
   1. Culture de cellules épithéliales spécifiques aux tissus selon les directives des fournisseurs jusqu’à 80% à 90% confluents.
   2. Dissocier les cellules en utilisant des procédures enzymatiques protéolytiques recommandées par le fournisseur de cellules.
      REMARQUE: Pour de meilleurs résultats, récoltez les cellules épithéliales à faible passage (P1-P2) pendant la phase de croissance active lorsqu’elles atteignent entre 70% et 90% de confluence.
   3. Une fois dissociées, centrifuger les cellules et les recueillir sous forme de pastille.
   4. Remettez les cellules épithéliales en suspension à la densité de cellules/fragments appropriée indiquée dans le tableau du protocole spécifique des organes.
      REMARQUE : Dans cette étude, une solution cellulaire a été utilisée à une densité de 3 x 10 6 cellules/mL pour la peau, 1 x 10 6 cellules/mL pour l’alvéole, 6 x 10 6 cellules/mL pour les voies respiratoires et 8 x 10 ⁶ fragments/mL pour l’intestin.
2. Ensemencement des cellules épithéliales
   1. Transférer les puces de l’incubateur dans l’ESB. Aspirer la solution d’enrobage du canal vasculaire et rincer le canal microfluidique vasculaire trois fois avec 50 μL de milieu de culture de cellules endothéliales fraîches.
   2. Aspirer la solution d’enrobage de la surface de l’hydrogel et rincer la surface stromale trois fois avec 100 μL de milieu de culture cellulaire épithéliale frais pour éliminer tout excès de solution de revêtement.
   3. Aspirer le milieu ascendant et ensemencer la surface de l’hydrogel avec 50 μL de la suspension de cellules épithéliales en utilisant la densité cellulaire appropriée, comme indiqué dans les tableaux supplémentaires, puis transférer les copeaux dans l’incubateur pendant 2 h (ou toute la nuit pour les colonoïdes).
   4. Rincez doucement la surface de l’hydrogel avec le milieu de culture cellulaire deux fois pour éliminer les débris cellulaires. Enfin, rafraîchissez le milieu en l’autoclavant dans des récipients autoclavables scellés et connectez les copeaux à la pompe péristaltique.

6. Connexion des puces au flux

1. Préparation des pièces fluidiques
   1. Couper 2 pouces de tube de transfert en élastomère thermoplastique (TPE) à base de polypropylène biocompatible (Table des matériaux) pour préparer le tube microfluidique court nécessaire pour connecter les copeaux aux réservoirs de support.
   2. Coupez 7,5 pouces de tube de transfert TPE biocompatible pour produire le long tube microfluidique.
   3. Préparez suffisamment de connecteurs métalliques 18 G et 19 G (Tableau des matériaux).
      NOTE: Il est recommandé de préparer et de stériliser les tubes et les connecteurs décrits aux étapes 6.1.1 et 6.1.2 au moins 1 jour avant de connecter les copeaux à toit ouvert aux pompes péristaltiques.
   4. Percez le couvercle de chaque réservoir moyen avec une aiguille hypodermique de 4 pouces (Tableau des matériaux).
2. Dégazage moyen
   1. Laisser le milieu de culture cellulaire s’équilibrer à température ambiante (RT).
   2. Transférer le volume de milieu nécessaire dans un tube filtrant conique.
   3. Appliquer une pression de vide négative de -20 PSI pour dégazer le fluide (filtration sous vide).
      REMARQUE: Si un vide n’est pas disponible, le milieu de culture cellulaire peut être laissé à équilibrer dans l’incubateur pendant la nuit pour obtenir des résultats similaires.
3. Préparez la puce à toit ouvert pour l’écoulement du fluide
   1. Amener les copeaux et les pièces fluidiques stériles sous l’ESB et aligner le couvercle (partie supérieure) de la puce à toit ouvert pour sceller le prototype de puce à toit ouvert avant de commencer l’écoulement du fluide.
   2. Pipeter 200 μL du milieu de culture cellulaire dégazé (voir les tableaux spécifiques aux organes) dans l’orifice d’entrée des canaux supérieur et inférieur de la puce tout en veillant à éviter les bulles.
   3. Pipeter 300 μL du milieu de culture dans le tube microfluidique court pour amorcer la surface interne des tubes et connecter le tube court aux entrées des canaux supérieur et inférieur de la puce.
4. Connecter et amorcer les surfaces microfluidiques
   1. Placez les réservoirs de milieu dans le rack de la ferme, connectez l’aiguille hypodermique à l’entrée inférieure des copeaux et, enfin, accueillez tous les copeaux dans le ou les supports de logement à l’intérieur de l’incubateur.
   2. Connectez les puces à la pompe péristaltique, puis inspectez tous les connecteurs pour vous assurer que toutes les puces sont correctement connectées et qu’il n’y a pas de fuite visible du milieu de culture cellulaire.
   3. Utilisez le bouton Purger de la pompe et maintenez-la enfoncée pendant environ 15 s ou jusqu’à ce que les gouttelettes du milieu de culture cellulaire apparaissent à l’extrémité du tube de sortie.
   4. Utilisez le système de commande de la pompe pour régler le débit approprié des puces d’organe (Figure 2, Figure 3, Figure 4 et Figure 5).

7. Maintenance des puces

1. Maintenance des puces d’organes
   1. Préparer le milieu de culture de cellules fraîches pour l’épithélium et/ou l’endothélium et effectuer les étapes de dégazage (comme décrit précédemment à l’étape 6.2).
   2. Mettez la pompe péristaltique en pause, débranchez soigneusement les copeaux de la pompe et extrayez le(s) support(s) du boîtier de copeaux. Transférer les copeaux de l’incubateur à l’ESB et retirer le volume de fluide restant dans les réservoirs.
   3. Remplacez le milieu de culture cellulaire dans les réservoirs d’entrée supérieur et inférieur par 5 mL de milieu de culture cellulaire frais et replacez le ou les supports de boîtier de copeaux dans l’incubateur. Connectez les copeaux à la pompe péristaltique et redémarrez le flux.
      REMARQUE: Il est recommandé d’utiliser la fonction Purge pour rafraîchir rapidement le milieu dans le compartiment vasculaire et réduire le risque de bulles d’air.
   4. Répétez les étapes 7.1.1 à 7.1.3 tous les deux jours, conformément à la figure 2, à la figure 3, à la figure 4 et à la figure 5.
2. Mise en place d’une interface air-liquide (ALI)
   1. Mettez la pompe péristaltique en pause, débranchez soigneusement les copeaux de la pompe et extrayez le(s) support(s) du boîtier de copeaux. Transférez les copeaux de l’incubateur à l’armoire de biosécurité et retirez le volume de milieu restant dans le réservoir supérieur.
   2. Aspirez doucement tout le fluide du canal microfluidique supérieur et serrez le tube microfluidique court connecté aux entrées supérieures à l’aide de clips liants pour réduire l’évaporation du média et le maintien de l’ALI.
   3. Replacez la puce à toit ouvert sur le(s) support(s) de boîtier dans l’incubateur et reconnectez les puces à la pompe péristaltique.
      REMARQUE: Il est recommandé d’utiliser la fonction Purge pour rafraîchir rapidement le milieu dans le compartiment vasculaire et réduire le risque de bulles d’air.
   4. Reprenez l’écoulement en démarrant la pompe péristaltique.
3. Étirement (facultatif)
   1. Mettez la pompe péristaltique en pause et connectez les orifices de vide des puces au module de vide à l’aide de deux longs tubes microfluidiques par puce.
   2. Utilisez le module de vide pour ajuster le réglage d’étirement à l’état recommandé pour chaque organe tel que spécifié dans les tableaux du protocole d’organes: Tableau supplémentaire 1 pour la peau; Tableau supplémentaire 2 pour l’alvéole; Tableau supplémentaire 2 pour les voies respiratoires; et le tableau supplémentaire 4 pour l’intestin.
   3. Inspectez visuellement les raccords du tube pour vous assurer que tous les copeaux sont correctement connectés et qu’il n’y a pas de gouttelettes visibles de fluide qui coule.
   4. Reprenez l’écoulement en démarrant la pompe péristaltique.

8. Ensemencement des cellules endothéliales dans le compartiment vasculaire

1. Préparer les cellules et les puces pour l’ensemencement des cellules vasculaires
   1. Culture des cellules endothéliales spécifiques aux tissus selon les directives des fournisseurs jusqu’à ce que 80% à 90% confluent. Dissocier les cellules à l’aide d’une procédure enzymatique protéolytique (recommandée par le fournisseur) et, enfin, remettre les cellules endothéliales en suspension dans une solution de 3 x 10⁶ cellules/mL.
      REMARQUE: Pour de meilleurs résultats, récoltez les cellules endothéliales à faible passage (P2-P4) pendant la phase de croissance active lorsqu’elles atteignent entre 70% et 90% de confluence.
   2. Mettez la pompe péristaltique en pause. Transférez les copeaux de l’incubateur à l’ESB, débranchez-les des réservoirs de média et de tout tube connecté, puis regroupez les copeaux dans des boîtes de Petri distinctes.
   3. Rafraîchir le milieu de culture cellulaire du compartiment épithélial avec un milieu de culture de cellules épithéliales fraîches. Rincer le canal vasculaire avec un milieu de culture de cellules d’endothélium frais deux fois, puis aspirer le milieu du compartiment vasculaire.
2. Ensemencement des cellules endothéliales
   1. Ensemencer le canal inférieur (vasculaire) avec 25 μL de suspension de cellules endothéliales (3 x 10⁶ cellules/mL), retourner les copeaux à l’envers pour permettre aux cellules endothéliales de se fixer à la surface supérieure de la chambre microfluidique.
      REMARQUE : Ajouter 50 μL de la suspension cellulaire par puce (600 μL par 12 puces).
   2. Regroupez les chips dans des boîtes de Pétri. Remettez-les dans l’incubateur à 37 °C, 5% de CO_2, et laissez les cellules endothéliales se fixer pendant 1 h.
   3. Après 1 h, transférer les copeaux de l’incubateur à l’ESB. Rincer le canal vasculaire avec le milieu de culture de cellules endothéliales deux fois pour éliminer les débris cellulaires.
   4. Répétez les étapes 8.2.1-8.2.2 pour ensemencer à nouveau le canal vasculaire avec des cellules endothéliales et poser les copeaux à plat pour faciliter l’adhésion des cellules endothéliales à la surface inférieure du canal vasculaire.
3. Reconnectez la puce à l’écoulement
   1. Remplir le réservoir du milieu vasculaire avec le milieu de culture cellulaire vasculaire dégazé sous l’ESB.
   2. Replacez les copeaux à l’intérieur du ou des supports de boîtier de puces et reconnectez les copeaux aux réservoirs de milieu à une extrémité à la pompe péristaltique à l’autre extrémité.
      REMARQUE: Il est recommandé d’utiliser la fonction Purge pour rafraîchir rapidement le milieu dans le compartiment vasculaire et réduire le risque de bulles d’air.
   3. Inspectez visuellement les connexions microfluidiques pour vous assurer que toutes les puces sont correctement connectées et qu’il n’y a pas de gouttelettes visibles de goutte moyenne. Ensuite, reprenez l’écoulement du fluide en démarrant la pompe péristaltique.

9. Tests d’évaluation communs

1. Déconnecter les puces pour les tests des points de terminaison
   1. Mettez la pompe péristaltique en pause, débranchez soigneusement les copeaux de la pompe et extrayez le(s) support(s) du boîtier de copeaux. Transférez le(s) support(s) de boîtier de puces de l’incubateur à l’ESB et libérez les copeaux.
   2. Lavez doucement la chambre centrale de la puce Open-Top avec le milieu de culture de cellules épithéliales et le canal vasculaire avec le milieu de culture endothélium deux fois pour éliminer tout débris cellulaire.
   3. Retirez le couvercle de la puce Open-Top pour accéder au compartiment apical de la puce à l’aide d’une pince à épiler.
2. Immunomarquage pour la microscopie à fluorescence
   1. Procéder à la fixation, à la perméabilisation et au blocage conventionnels des échantillons.
      NOTE: Dans cette étude, les échantillons ont été fixés dans 200 μL de paraformaldéhyde (PFA) à 4% pendant 1 h, suivis d’un rinçage au PBS, d’une perméabilisation dans du Triton X-100 à 0,1% pendant 40 min et d’un blocage dans 1% d’albumine sérique bovine pendant 1 h.
   2. Incuber les puces avec des anticorps primaires (Table of Materials) à 4 °C pendant une nuit. puis laver deux fois les compartiments épithéliaux et endothéliaux des puces avec 200 μL de PBS. Ensuite, continuez avec les anticorps secondaires appropriés pendant 2 h.
      REMARQUE: Diluer les anticorps primaires et les anticorps secondaires dans PBS + 1% BSA à une dilution de 1:100 (anticorps primaire) et 1:200 (anticorps secondaire).
3. Immunohistochimie
   1. Extraire les équivalents stromaux de la chambre principale de la puce Open-Top à l’aide d’une pince à épiler, les recueillir dans un tube de 1,5 ml rempli de formol tamponné neutre à 10% et incuber pendant au moins 24 heures.
   2. Transférez l’équivalent stromal fixe au processeur de tissu et suivez les étapes ci-dessous pour obtenir une déshydratation optimale de l’échantillon.
      1. Immerger l’hydrogel dans de l’éthanol à 70% pendant 90 min.
      2. Retirer l’éthanol à 70% et immerger l’hydrogel dans de l’éthanol à 80% pendant 90 min.
      3. Retirer l’éthanol à 80% et plonger l’hydrogel dans de l’éthanol à 95% pendant 90 min.
      4. Retirer l’éthanol à 95% et immerger l’hydrogel dans de l’éthanol à 100% pendant 90 min deux fois.
      5. Retirer l’éthanol à 100% et immerger l’hydrogel dans une solution de xylène pendant 120 min deux fois.
      6. Retirer la solution de xylène et infiltrer deux fois les équivalents stromaux traités dans de la cire de paraffine pendant 120 min (~2 h).
   3. Intégrez les équivalents stromaux infiltrés dans les blocs de paraffine sectionnants.
   4. À ce stade, les équivalents stromaux peuvent être sectionnés en blocs de paraffine à l’aide d’un microtome et traités selon les techniques histologiques conventionnelles²⁶.

Résultats

Microstructuration de surface
La microstructure de la matrice extracellulaire (ECM) peut être utilisée pour reproduire la configuration spatiale de l’interface de la crypte intestinale. La configuration de la puce Open-Top peut être modifiée pour intégrer des timbres à micromotifs spécialement conçus pour imiter la topographie naturelle de l’interface épithélium-stroma colique (Figure 6A,B) et des cryptes intestinales à l’échelle micrométrique (...

Discussion

La puce Open-Top représente une plate-forme habilitante pour étudier l’interaction cellulaire complexe qui se produit entre l’endothélium, le stroma et l’épithélium dans un microenvironnement contrôlé, en temps réel. Cette technologie offre des avantages essentiels par rapport aux cultures organotypiques et organoïdes conventionnelles, tels que l’intégration de signaux physiques et biochimiques pertinents pour reconstituer le microenvironnement tissulaire humain, y compris le cisaillement fluidique (éc...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x EMEM	Lonza	12-684F	Medium; Stroma
18 Gauge needle	MicroGroup	316H18RW	Tube stainless steel 316 welded, 18RW Full Hard
19 Gauge needle	MicroGroup	316H19RW	Tube stainless steel 316 welded, 19RW Full Hard
2-Stop PharMed BPT	Cole-Palmer	EW-95723-12	Tube, 0.25 mm, 12/pack
70% ethanol and wipes	-	-	For surface sterilization
8-Bromoadenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt (8-Br-cAMP)	Sigma	B7880	Medium supplement
A-83-01	Tocris	2939
Adenine	Sigma	A9795
Advanced DMEM/F12	Thermo	12634010
Airway Epithelial Cells	Lifeline Cell Technology	FC-0016
Aluminum foil	-	-	-
Alveolar cells	Cell Biologics	H6621
Anti-ABCA3	ABCAM	ab24751	Mouse monoclonal antibody [3C9]
Anti-Aquaporin5 Alexa Fluor 647	ABCAM	ab215225	Rabbit monoclonal antibody [EPR3747]
Anti-Aquaporin5	ABCAM	ab92320	Rabbit monoclonal antibody [EPR3747]
Anti-beta IV Tubulin	ABCAM	ab11315	Mouse monoclonal antibody [ONS.1A6]
Anti-CD31 (PECAM-1)	ABCAM	ab9498	Mouse monoclonal [JC/70A] antibody
Anti-CK5	ABCAM	ab75869	Rabbit recombinant monoclonal [AY1E6]
Anti-Cytokeratin 10	ThermoFisher	MA5-13705	Mouse monoclonal antibody (DE-K10)
Anti-Cytokeratin 14	ABCAM	ab7800	Mouse monoclonal antibody
Anti-E-Cadherin	ABCAM	ab1416	Mouse monoclonal antibody
Anti-Filaggrin	ThermoFisher	PA5-79267	Rabbit polyclonal antibody
Anti-HTI-56	Terrace Biotech	TB-29AHT1-56	Mouse monoclonal antibody (IgG1)
Anti-HTII-280	Terrace Biotech	TB-27AHT2-280	Mouse monoclonal antibody (IgM)
Anti-Involucrin	ThermoFisher	MA5-11803	Mouse monoclonal antibody (SY5)
Anti-Isoforms TA p63-α, -β, -γ	Biolengend	618902	Rabbit polyclonal antibody
Anti-Ki67	ABCAM	ab8191	Mouse monoclonal antibody [B126.1]
Anti-LAMP3	ABCAM	ab111090	Rabbit polyclonal antibody
Anti-Mature SP-B	Seven Hill	WRAB-48604	Rabbit polyclonal antibody
Anti-MUC5AC	ThermoFisher	PA5-34612	Rabbit polyclonal antibody
Anti-Mucin-2	SantaCruz Biotechnology	sc-7314	Mouse monoclonal antibody (IgG1)
Anti-p63	Dako	GA662	Mouse monoclonal antibody p63 Protein (Dako Omnis) Clone DAK-p63
Anti-PCNA	ThermoFisher	PA5-32541	Rabbit polyclonal antibody
Anti-Podoplanin (AT-1α)	ABCAM	ab128994	Rabbit polyclonal antibody
Anti-Pro + Mature Surfactant Protein B	ABCAM	ab40876	Rabbit polyclonal antibody
Anti-Surfactant C	Seven Hill	WRAB-9337	Rabbit polyclonal antibody
Anti-Uteroglobin/SCGB1A1	Hycult Biotech	HM2178	Mouse monoclonal antibody [AY1E6]
Anti-VE-cadherin	ABCAM	ab33168	Rabbit polyclonal antibody
Anti-ZO-1	ThermoFisher	33-9100	Mouse monoclonal antibody [1A12]
Ascorbic acid	Sigma	A4544
Aspirating pipettes	Corning / Falcon	357558	2 mL, polystyrene, individually wrapped
Aspirating tips	-	-	Sterile (autoclaved)
B27	Thermo	17504044
Blocker BSA (10X) in PBS solution	ThermoFisher	37525	Blocker agent
Calcium Chloride	Sigma	C7902
CHIR 99021	Tocris	4423
Collagen I	Advanced Biomatrix	5133	10 mg/mL (Stroma)
Collagen I	Advanced BioMatrix	5005	3 mg/mL (Vascular ECM)
Collagen IV	Sigma	C5533
Collagen-IV	Sigma	C5533-5MG	Collagen from human placenta, 5 mg powder, reconstitute to 1 mg/mL
Colonic Fibroblasts	Cell Biologics	H6231
Colonic microvascular endothelial cells	Cell Biologics	H6203
Conical tubes	-	-	15 mL and 50 mL polypropylene, sterile
Crosslinker (ER-1)	Emulate	10461	5 mg powder
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)	ThermoFisher	D3571	DNA probe
Dermal fibroblasts	ATCC	PCS-201-010
Dermal microvascular endothelial cells	ATCC	CRL-3243
Dexamethasone	Sigma	D4902
DMEM	ThermoFisher	11054020
DMEM/F-12	GIBCO	11320082
DMEM/F-12, GlutaMAX	GIBCO	10565-018	Basal medium for ALI medium
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488)	ABCAM	ab150105	Donkey Anti-Mouse secondary antibody
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 568)	ABCAM	ab175472	Donkey Anti-Mouse secondary antibody
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647)	ABCAM	ab150107	Donkey Anti-Mouse secondary antibody
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488)	ABCAM	ab150073	Donkey Anti-Mouse secondary antibody
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 568)	ABCAM	ab175470	Donkey Anti-Mouse secondary antibody
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 647)	ABCAM	ab150075	Donkey Anti-Mouse secondary antibody
Dulbecco’s PBS (DPBS-/-) (without Ca2+, Mg2+)	Corning	21-031-CV	1x
Epidermal Growth Factor (EGF) human, recombinant in E. coli	PromoCell	C-60170	Medium supplement
F-12 Ham’s	Invitrogen	21700-108	For vascular ECM
FibriCol	Advanced BioMatrix	5133-20ML	Collagen-I solution (10 mg/mL)
Fibronectin	Corning	356008
Fibronectin, Human, Natural,	Corning	47743-654	human plasma fibronectin
Fine-tip precision tweezers	Aven	18056USA	Technik Style 5B-SA Precision Stainless Steel Tweezers
Glutamax	Invitrogen	21700-108
Glutamax	Invitrogen	35050061
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 594)	ABCAM	ab150080	Goat Anti-Mouse secondary antibody
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647)	ABCAM	ab150115	Goat Anti-Mouse secondary antibody
Goat Anti-Mouse IgG H&L (FITC)	ABCAM	ab6785	Goat Anti-Mouse secondary antibody
Goat Anti-Mouse IgG1 Alexa Fluor 568	ThermoFisher	A-21124	Goat Anti-Mouse IgG1 secondary antibody
Goat Anti-Mouse IgM Alexa Fluor 488	ThermoFisher	A-21042	Goat Anti-Mouse IgM secondary antibody
Handheld vacuum aspirator	Corning	4930	-
Heat Inactivated HyClone FetalClone II Serum (FCS)	GE Healthcare Life Sciences	SH30066.03
Hemocytometer	-	-	-
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa	Sigma	H3149
HEPES	Thermo	15630080
Human [Leu15] - Gastrin	Sigma	G9145
Human colonoids	Obtained from clinical resections		Obtained from clinical resections
Human EGF Recombinant Protein	Thermo	PHG0311L
human epithelial growth factor	Thermo	PHG0311
HyClone FetalClone II Serum (U.S.)	GE Healthcare	SH30066.02HI	Sterile FBS heat-inactivated
Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt	Sigma	H4881
Hydrocortisone	PromoCell	C-64420	Medium supplement
Ice bucket	-	-	-
Ismatec IPC-N	Cole-Palmer	EW-78000-41	Low-Speed Digital Peristaltic Pump; q24-Channel (1 per 12 Chips)
ITES	BioWhittaker	17-839Z
Keratinocyte Growth Factor (KGF), also known as Basic Fibroblast Growth Factor 7 (FGF-7), human, recombinant in HEK	PromoCell	C-63821
Keratinocytes	ATCC	PCS-200-010
Laminin	Biolamina	CT521-0501
Laminin, 521 CTG (CT521)	Biolamina	CT521-0501	human recombinant laminin 521
Lung Fibroblast	Cell Biologics	H6013
Lung Fibroblast	Lifeline Cell Technology	FC-0049
Lung microvascular endothelial cells	Lonza	CC-2527
Lung smooth muscle cells	Lifeline Cell Technology	FC-0046
Manual counter	-	-	-
Masterflex (TPE) Transfer Tubing	Cole-Palmer	FV-96880-02	PharMed BPT, 1/32" ID x 5/32" OD
Medium 199, no phenol red	Thermo	11043023
Microcentrifuge tube	-	-	1.5 mL, sterile
Microscope (with camera)	-	-	For bright-field imaging
N2	Sigma	17502001
N-acetyl cysteine	Sigma	A5099
Noggin (HEK293T conditioned medium)	Sigma	N17001
Normal Goat Serum	ThermoFisher	50062Z	Blocking solution
O-phosphosrylethanolamine	Sigma	P0503
Paraformaldehyde (4% wt/vol)	EMS	15710	Fixing agent
Penicillin Streptomycin	GIBCO	15140122
Penicillin-streptomycin	Sigma	P4333	10,000 U/mL; 10 mg/mL
Pipette tips	-	-	P20, P200, and P1000 sterile, low adhesion
Pipette	Gilson	F167380	P20, P200, and P1000
PluriQ Serum Replacement (or alternatively KO Serum replacement)	AMSBIO (or Thermo)	N/A (or C1910828010)
Poly-L-Lysine coated microscope glass slides	Sigma	P0425	Glass slides
Primocin	InvivoGen	ant-pm-1
Progesterone	Sigma	P8783
ProLong Gold	ThermoFisher	P36931	Antifade Mountant with DAPI
Retinoic Acid	Sigma	R2625
ROCK inhibitor (Y27632)	Tocris	TB1254-GMP/10
R-spondin (HEK293T conditioned medium)	Sigma	SCC111
SAGM SingleQuots supplements	Lonza	CC-4124
SAGMTM Small Airway Epithelial Cell Growth medium BulletKitTM	Lonza	CC-4124	Medium supplements
SB2001190	Tocris	1264/10
Serological pipettes	-	-	2 mL, 5 mL, 10 mL, and 25 mL low endotoxin, sterile
Small Airway Epithelial Cell Growth medium (SAGM)	Lonza	CC-4124
Solvent Buffer (ER-2)	Emulate	10462	25 mL bottle
Steriflip-HV	Millipore	SE1M003M00	Sterile filtering conical tube
Sterilin 100 mm Square Petri Dishes	Thermo	103	Sterile, 1 per 6 chips
T25 flasks	-	-	-
T75 flasks	-	-	-
Tri-iodothyronine	Sigma	T5516
Triton X-100 (0.3% (vol/vol)	Sigma	T8787	Permeabilization agent
Trypan blue	Sigma	93595	0.4% solution
TrypEE solution	Sigma	12604013	Cell detaching solution
TWEEN-20	Sigma	P2287	Permeabilization agent
UV Light Oven (peak frequency 365nm, intensity of 100 µJ/cm2)	VWR	21474-598	UVP, Long Range UV, 365 nm 60Hz Model CL-1000L
Vacuum set-up	-	-	Minimum pressure: -70 kPa
Vascular Endothelial Growth Factor 165 (VEGF-165) human, recombinant in E. coli	PromoCell	C-64420
VEGF-165	PromoCell	C-64420	Medium supplement
Von Willebrand Factor conjugated FITC	ABCAM	ab8822	Sheep polyclonal antibody
Water bath (or beads)	-	-	Set to 37 °C
Wnt3A (L-Wnt3A conditioned medium)	ATCC	CRL-2647