JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تصف هذه الدراسة طريقة لبناء المجاميع بناء على التجميع الذاتي للخلايا الجذعية الوسيطة البشرية وتحدد الخصائص المورفولوجية والنسيجية للعلاج التجديدي لعيوب العظام القحفية.

Abstract

يمكن اشتقاق الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) ، التي تتميز بقدرتها على التجديد الذاتي وإمكانية التمايز متعدد السلالات ، من مصادر مختلفة وتظهر كمرشحين واعدين للطب التجديدي ، خاصة لتجديد الأسنان والعظام والغضاريف والجلد. يسمح النهج المجمع ذاتيا لتجميع MSC ، والذي يبني بشكل خاص مجموعات الخلايا التي تحاكي التكثيف الوسيط النامي ، بتوصيل الخلايا الجذعية عالية الكثافة جنبا إلى جنب مع تفاعلات الخلايا الخلوية المحفوظة والمصفوفة خارج الخلية (ECM) كمكانة للبيئة المكروية. لقد ثبت أن هذه الطريقة تمكن من نقش الخلايا بكفاءة والبقاء على قيد الحياة ، وبالتالي تعزيز التطبيق الأمثل للخلايا الجذعية الجذعية الخارجية في هندسة الأنسجة وحماية تجديد الأعضاء السريرية. توفر هذه الورقة بروتوكولا مفصلا لبناء وتوصيف الركام ذاتي التجميع بناء على الخلايا الجذعية الوسيطة للحبل السري (UCMSCs) ، بالإضافة إلى مثال على التطبيق التجديدي للعظام القحفية. سيساعد تنفيذ هذا الإجراء في توجيه إنشاء استراتيجية فعالة لزراعة MSC لهندسة الأنسجة والطب التجديدي.

Introduction

يعد تكثيف الخلايا الجذعية الوسيطة (MSC) مرحلة أساسية لضمان النمو والتطور الطبيعي للجسم في تكوين الأعضاءالمبكر 1،2 ، خاصة في تكوين العظام والغضاريف والأسنان والجلد1،3،4. في العقود القليلة الماضية ، حققت علاجات هندسة الأنسجة باستخدام الخلايا الجذعية الجذعية المستنبتة بعد الولادة جنبا إلى جنب مع السقالات القابلة للتحلل تطورا مهما في التجديد العظمي5 والغضروف6. ومع ذلك ، قد يكون لاستخدام السقالات بعض العيوب ، مثل الرفض المناعي ، فضلا عن انخفاض التقارب الخلوي واللدونة7. في هذا الصدد ، قمنا بالتحقيق في جدوى تطبيق طريقة زراعة الخلايا الكروية لتوفير مجاميع ذاتية التجميع خالية من السقالات تحاكي ظاهرة التكثيف النامية ، والتي تحتوي فقط على الخلايا الجذعية الجذعية والمصفوفة خارج الخلية المترسبة (ECM) 8. يزيد تكوين الركام من اللدونة التطبيقية لتتناسب مع شكل العيب ويتجنب زرع السقالة والهضم بواسطة الإنزيمات المحللة للبروتين لحصاد الخلايا الجذعية الجذعية للزرع9.

تم استخدام مجاميع MSC على نطاق واسع لتجديد العظام ولب الأسنان واللثة واللثة والجلد10 ، من بين الأنسجة والأعضاء الأخرى. يمكن اختيار العديد من الأنواع المختلفة من الخلايا الجذعية الوسيطة كمرشحة لخلايا البذور ، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر الخلايا الجذعية الوسيطة لنخاع العظم (BMMSCs) ، والخلايا الجذعية الوسيطة للحبل السري (UCMSCs) ، والخلايا اللحمية المشتقة من الأنسجة الدهنية (ADSCs) ، والخلايا الجذعية الوسيطة للأسنان (على سبيل المثال ، الخلايا الجذعية الوسيطة للبوب الأسنان [DPSCs] ، والخلايا الجذعية الوسيطة من الأسنان اللبنية [SHED] 11 ، والخلايا الجذعية الوسيطة اللثوية [PDLSCs])12. تم تطوير العديد من التقنيات لمجموعات الخلايا ثلاثية الأبعاد في العقد الماضي ، بما في ذلك التجميع المساعد والتجميع الذاتي. ومع ذلك ، غالبا ما تكون مناهج التجميع المساعدة ضعيفة في إنتاج ECMs وتشكيل مجاميع متجانسة وضيقة ، وبالتالي فهي غير مناسبة لتقليد الظروف الفسيولوجية13،14،15. علاوة على ذلك ، تتطلب بعض طرق التجميع المساعد تفاعلات بين الخلايا والمواد لتشكيل هياكل مستقرة16،17،18،19 ، في حين أن طريقة التجميع ذاتية التجميع هذه متاحة بشكل عام لمجموعة واسعة من الخلايا الجذعية الجذعية الجذعية والجدير بالذكر أنه في تجاربنا السريرية الأخيرة ، تم استخدام مجاميع MSC بنجاح لتجديد مركب لب العاج واللثة بعد الزرع في أسنان القاطعة البشرية المصابة ، التي حققت تجديد الأنسجة من جديد مع الهيكل الفسيولوجي والوظيفة20،21.

توفر هذه الورقة إجراء شاملا لبناء وتوصيف الركام MSC ، وكذلك الزرع في الجسم الحي . سيجذب هذا النهج انتباه الباحثين عندما يهدفون إلى إصلاح العيوب في الأنسجة ، مثل الأسنان والعظام والغضاريف والجلد ، بناء على تطبيقات الخلايا الجذعية. هذه الطريقة بسيطة ومريحة وتتكون بالكامل من خلايا و ECM بدون سقالات إضافية ، والتي يمكن زراعتها لفترة طويلة للحصول على مجاميع كثيفةومستقرة 22. وفي الوقت نفسه ، فإن الركام المزروع بهذه الطريقة غنية ب ECM ، والذي يحاكي مكانة التطوير لهذه الخلايا عالية الكثافة وبالتالي يعزز تجديد الأنسجة23. يمكن تقسيم عملية البناء إلى مرحلتين: تحضير الخلايا وثقافتها ، والتكوين الذاتي وحصاد مجاميع الخلايا. يشمل توصيف الركام التحديد المورفولوجي عبر مجهر بصري مقلوب ومجهر إلكتروني ماسح (SEM) ، والتحليل النسيجي عبر الهيماتوكسيلين والأيوزين (HE) وتلوين ماسون. تم عرض الركام المشكل للزرع التجديدي لإصلاح عيب عظم الجمجمة. سيساعد تنفيذ هذا الإجراء في توجيه إنشاء استراتيجية فعالة لزراعة MSC لهندسة الأنسجة والطب التجديدي.

Protocol

ملاحظة: تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من قبل لجنة رعاية واستخدامه في الجامعة الطبية العسكرية الرابعة وتم إجراؤها وفقا لدليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبر. تم استخدام UCMSCs البشرية المحفوظة بالتبريد التي تم الحصول عليها من مصدر تجاري في هذه الدراسة (انظر جدول المواد). تمت الموافقة على استخدام الخلايا البشرية من قبل لجنة الأخلاقيات التابعة للجامعة الطبية العسكرية الرابعة. تم أخذ UCMSCs كمثال لوصف الإجراء. تم أخذ عيب الجمجمة كمثال لإظهار الحاجة إلى الإصلاح لوصف إجراء الزرع. تكررت جميع التجارب ثلاث مرات.

1. بناء مجاميع UCMSC

  1. إعداد وثقافة UCMSCs
    1. أضف 10 مل من المحلول الملحي المخزنة بالفوسفات (PBS) في أنبوب طرد مركزي جديد سعة 15 مل في خزانة معقمة للسلامة الحيوية.
    2. قم بإزالة أنبوب التجميد الذي يحتوي على UCMSCs المجمدة من النيتروجين السائل وضعه بسرعة في حمام مائي 37 درجة مئوية. رج الأنبوب برفق لتسهيل إذابة الخلايا بسرعة وشاملة.
      تنبيه: يجب الانتهاء من الإجراء بأكمله في غضون 1 دقيقة ، لأن ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) في محلول التجميد قد يسبب السمية الخلوية.
    3. قم بتعليق الخلايا قليلا في أنبوب التجميد وانقل جميع المحتويات إلى أنبوب الطرد المركزي الذي يحتوي على 10 مل من PBS (الخطوة 1.1.1). الطرد المركزي العينة عند 100 × جم لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية واغسل الخلايا ب 10 مل من PBS.
    4. الطرد المركزي العينة عند 100 × جم لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا برفق باستخدام وسط أساسي كامل لألفا الحد الأدنى (α-MEM) يحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) ، و 1٪ بنسلين - ستربتومايسين ، و 584 مجم / لتر جلوتامين.
    5. قم بزرع الخلايا المعلقة في أطباق استزراع 10 سم (غالبا طبق أو طبقين لأنبوب واحد ، اعتمادا على الكمية الإجمالية للخلايا بعد الطرد المركزي ، بكثافة 5 × 106 خلايا لكل طبق). أضف وسيطا كاملا α-MEM في الأطباق إلى الحجم الإجمالي 10 مل.
    6. رج الأطباق برفق لتوزيع الخلايا. احتضان الأطباق عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 في غرفة رطبة. بعد الحضانة بين عشية وضحاها ، تخلص من الوسط الطافي وأضف 5 مل من PBS 1-2x لإزالة الخلايا غير الملتصقة. أضف 10 مل من وسط α-MEM الطازج الكامل. قم بتغيير وسائط الثقافة كل يومين.
    7. لمرور الخلايا ، عندما تصل الخلايا إلى التقاء 80٪ -90٪ ، تخلص من المادة الطافية واغسل الخلايا ب 5 مل من PBS لإزالة الوسط جيدا. احتضان الخلايا في 2 مل من 0.25٪ تريبسين -1 ملي مولار حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) عند 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين.
    8. عندما تصبح الخلايا مستديرة مع تقاطعات بين الخلايا مكسورة تحت المجهر ، افصل الخلايا عن الأطباق دون تعطيل الكثير من بنية الخلية. قم بتحييد التربسين عن طريق إضافة 4 مل من وسط α-MEM الكامل.
    9. اجمع الخلايا من الأطباق بشكل متكرر وبرفق عن طريق سحب العينة في أنبوب طرد مركزي جديد سعة 15 مل. الطرد المركزي العينة عند 100 × جم لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا بوسط α-MEM كامل ، وقم بزرعها في أطباق مزرعة طازجة أو أطباق جيدة. قم بتغيير وسائط الثقافة كل يومين.
      ملاحظة: وفقا لحجم منطقة العيب ، يتطلب عيب 25 مم3 استخدام بئر من خلايا صفيحة مكونة من 6 آبار مستزرعة لتشكيل مجاميع.
  2. تكوين وحصاد الركام
    1. قم بإعداد وسائط محفزة لتجميع الخلايا عن طريق إضافة 50 ميكروغرام / مل من فيتامين C إلى α-MEM مع 10٪ FBS و 1٪ بنسلين ستربتومايسين و 584 مجم / لتر جلوتامين.
      تنبيه: يجب تجنب التعرض المباشر للضوء عند استخدام فيتامين سي ، حيث يتأكسد فيتامين سي عند تعرضه للضوء ويصبح غير فعال.
    2. عندما تصل الخلايا في الخطوة 1.1.12 إلى التقاء 95٪ (الشكل التكميلي S1) ، قم بتغيير الوسائط إلى وسائط محفزة للخلية ؛ قم بتغيير الوسائط المحفزة للخلايا الجديدة كل يومين.
    3. بعد 7-10 أيام من الحث (يعتمد طول وقت الحث على أنواع الخلايا الجذعية وغالبا ما يكون ~ 7 أيام لحافة UCMSCs) ، ابحث عن الركام المشكل تحت المجهر ، مع حواف سميكة مفصولة عن قاع الطبق.
    4. تخلص من وسائط الثقافة واغسل الخلايا برفق 2x باستخدام PBS. ادفع الركام برفق من الحافة إلى المنتصف باستخدام ملقط صغير معقم ، مع طي الركام.
    5. في بعض المناسبات ، يمكن أن تتجعد UCMSCs تلقائيا نحو المركز لتشكيل تكاثف صلب. وهذا الهيكل يعادل المجموع الذي تم الحصول عليه في الخطوة 4.2.1.

2. التحديد المورفولوجي للركام

  1. الملاحظة العامة والمجهرية
    1. لاحظ أن الركام كثيف ومتكامل ولا يتضرر بسهولة بسبب القوى الميكانيكية ، مثل السحب أثناء الانفصال والزرع.
    2. تحت المجهر ، ابحث عن هيكل يشبه الغشاء بسماكة معينة بنمط منسوج.
  2. تلطيخ الخلايا الحية / الميتة
    1. زرع الخلايا في صفيحة من 6 آبار بكثافة 1 × 106 خلايا لكل بئر.
    2. قم بإعداد محلول عمل 2 ميكرومتر من الكالسين AM و 4 ميكرومتر EthD-1 وباستخدام PBS.
    3. أضف 0.3٪ تريتون إلى الخلايا لمدة 5 دقائق ، واغسلها باستخدام PBS ثلاث مرات للحث على موت الخلايا ، كعنصر تحكم في التلوين.
    4. اغسل الخلايا والركام والخلايا المسببة للموت باستخدام PBS مرتين.
    5. أضف 100 ميكرولتر من PBS و 100 ميكرولتر من محلول التلوين المحضر في الخطوة 2.2.2 لكل بئر.
    6. احتضان العينة لمدة 30 دقيقة في RT. اغسل العينة باستخدام PBS مرتين.
    7. أضف 200 ميكرولتر من 10 ميكروغرام / مل Hoechst إلى كل بئر واحتضان العينة لمدة 5 دقائق في RT. واه العينة مع PBS مرتين.
    8. راقب تحت المجهر الفلوري.
  3. مراقبة SEM
    1. بذر وخلية تحفيز الركام التي تم الحصول عليها في الخطوة 1.2.4 أو 1.2.5. اغسل الخلايا باستخدام PBS بعد تكوين الركام في الخطوة 1.2.4. أو 1.2.5.
    2. قم بإصلاح الخلايا باستخدام الجلوتارالديهايد لمدة 4 ساعات على الأقل.
    3. اغسل العينات باستخدام PBS ، ثم جففها من خلال تركيز متدرج من الإيثانول من 30٪ ، 50٪ ، 70٪ ، 80٪ ، 90٪ إلى 100٪ ، كل منها لمدة 5 دقائق. عالج 2x بالإيثانول اللامائي
    4. اغمر الركام في 3 مل من سداسي ميثيل ديسيلازان لمدة 30 دقيقة. استنشق كل السوائل وجفف العينات جيدا بشكل طبيعي.
      تنبيه: يجب تنفيذ العملية برمتها في غطاء الدخان لأن hexamethyldisilazane متطاير وشديد السمية.
    5. قم بلصق العينات المجففة على طاولة العينات بشريط كربوني على الوجهين وقم بتغطية السطح بالمعدن. قم بتخزين العينة في درجة حرارة الغرفة (RT) لعدة أيام.
    6. المراقبة تحت SEM.
      1. استبدل العينة داخل الجهاز. اضبط جهد الماكينة على 5 كيلو ، والبعد البؤري إلى ~ 12 مم. اضبط شريط التركيز البؤري حتى تظهر صورة واضحة.
      2. التقط الصور بتكبير منخفض. اضبط التكبير وأعد التركيز للحصول على صورة تكبير أعلى.
        تنبيه: لا يمكن لمس سطح الركام قبل المراقبة لتجنب تدمير مورفولوجيا السطح.

3. التحليل النسيجي للمجاميع

  1. تثبيت العينات وتقسيمها
    1. قم بإصلاح الركام الذي تم الحصول عليه في الخطوة 1.2.4 أو 1.2.5 مع 4٪ بارافورمالدهيد عند 4 درجات مئوية لمدة 24 ساعة على الأقل. بعد التثبيت ، اغسل باستخدام PBS وضع العينة في أشرطة التضمين طوال الليل لشطفها بالماء الجاري.
    2. تجفيف العينات باستخدام آلات التجفيف الأوتوماتيكية من خلال الإيثانول المتدرج والزيلين والبارافين باتباع تعليمات الشركة المصنعة. العملية برمتها هي كما يلي: 85٪ إيثانول لمدة ساعتين في RT ، 95٪ إيثانول لمدة ساعتين في RT ، 95٪ إيثانول لمدة ساعتين في RT ، 100٪ إيثانول لمدة ساعتين في RT ، 100٪ إيثانول لمدة 1.5 ساعة في RT ، زيلين لمدة 45 دقيقة في RT ، زيلين لمدة 45 دقيقة في RT ، بارافين لمدة 30 دقيقة في RT ، البارافين لمدة 1.5 ساعة في RT ، وأخيرا البارافين لمدة ساعتين عند 60 درجة مئوية.
    3. قم بتضمين العينات مع البارافين. قم بإعداد أقسام بسمك 5 ميكرومتر تقريبا ، وألصقها بشرائح كاتيونية ، وجفف الشرائح لمدة ساعتين عند 45 درجة مئوية.
    4. قم بإزالة الشمع بالتتابع من خلال الزيلين لمدة 15 دقيقة ومرتين و 100٪ و 90٪ و 80٪ و 70٪ من الإيثانول (كل منها لمدة 5 دقائق).
    5. اشطف الشرائح ببطء 3 مرات بالماء الجاري لمدة 5 دقائق.
  2. تلطيخ
    1. وصمة عار بالهيماتوكسيلين لمدة 3-5 دقائق ، واشطفها بالماء ، وقم بإزالة السوائل الزائدة حول الأنسجة بعناية.
    2. قم بتجزئة الإيثانول الذي يحتوي على 1٪ حمض الهيدروكلوريك لمدة 3-5 ثوان ثم اشطفها بالماء الجاري ، وخلالها يصبح اللون أفتح قليلا وأزرق قم بإزالة الماء الزائد حول الأنسجة.
    3. وصمة عار باليوزين لمدة 1 دقيقة ، واشطفها بالماء الجاري ، وقم بإزالة السوائل الزائدة حول الأنسجة.
    4. جفف بنسبة 70٪ و 80٪ و 90٪ و 100٪ من الإيثانول لمدة 10 ثوان لكل منهما ، والزيلين لمدة 15 دقيقة ، مرتين ، وجفف بشكل طبيعي في غطاء الدخان قبل إغلاق الورقة.
    5. أضف قطرات الراتنج المحايدة وأغلق الشرائح بأغطية. راقب تحت المجهر الضوئي.
  3. تلطيخ ماسون ثلاثي الألوان
    1. وصمة عار باستخدام الهيماتوكسيلين الحديدي من Weigert لمدة 5 دقائق ، ثم اشطفها بالماء ، وامسحها حتى تجف.
    2. قم بتجزئة الإيثانول الذي يحتوي على 1٪ حمض الهيدروكلوريك لمدة 3-5 ثوان ثم اشطفها بالماء الجاري ، وخلالها يصبح اللون أفتح قليلا وأزرق امسح السطح حتى يجف.
    3. وصمة عار بمحلول أرجواني حمضي أحمر ليكسين لمدة 5-10 دقائق ثم اشطفه بسرعة بالماء المقطر.
    4. يعالج بمحلول مائي بحمض الفوسفوموليبديك لمدة 3-5 دقائق.
    5. أعد تلطيخ الشعر مباشرة بمحلول الأنيلين الأزرق لمدة 5 دقائق دون غسلها بالماء.
    6. عالج بحمض الخليك الجليدي 1٪ لمدة 1 دقيقة.
    7. جفف بنسبة 70٪ و 80٪ و 90٪ و 100٪ من الإيثانول لمدة 10 ثوان لكل منهما ، والزيلين لمدة 15 دقيقة ، مرتين ، وجفف بشكل طبيعي في غطاء الدخان قبل إغلاق الورقة.
    8. أضف قطرات الراتنج المحايدة وأغلق الشرائح بأغطية. راقب تحت المجهر الضوئي.

4. الزرع

  1. تخدير الفأر العاري عن طريق الحقن داخل الصفاق بمقدار 50 مجم / كجم من الصوديوم البنتوباربيتال.
    ملاحظة: تأكد من تخدير الفئران بشكل صحيح بناء على عدم وجود منعكس القرنية ورد فعل الأطراف عند ضغط وسادة القدم. ضعي مرهم العين لمنع الجفاف.
  2. اقطع شقا عرضيا (~ 3-4 سم) في الجلد خلف أذني الفأر العاري بمقص صغير معقم بعد التطهير باليودوفور.
  3. اسحب الجلد للأمام لكشف الجمجمة. ارسم حواف منطقة العيب المخطط لها برفق بشفرة 11 # وقم بإزالة جزء العظم. منطقة العيب عبارة عن منطقة دائرية يبلغ قطرها حوالي 4 مم. استخدم المحلول الملحي لتنظيف الجرح وتوفير الإرقاء الكافي.
  4. اغمس الركام الذي تم الحصول عليه في الخطوة 1.2.5 أو 1.2.6 بشاش معقم لامتصاص رطوبة السطح قبل الزرع. ضع الركام في المنطقة واضغط قليلا لملء العيب.
  5. استبدل الجلد بعد السحب للتأكد من تثبيت الغرسة. أغلق الشق ب 1/2 و 4 × 10 غرز بزاوية و 4-0 خيوط.
  6. بعد الجراحة ، ضع على بطانية إعادة التدفئة حتى تصبح نشطة ثم أعيدها إلى القفص.
    ملاحظة: يجب عدم ترك دون رقابة حتى تستعيد وعيها الكافي للحفاظ على الاستلقاء القصي. لا يتم إرجاع التي خضعت لعملية جراحية إلى صحبة الأخرى حتى تتعافى تماما.

النتائج

يمكن إنشاء المجاميع بنجاح من UCMSCs وفقا لسير العمل التجريبي (الشكل 1). يجب تقييم جودة الركام قبل الاستخدام ، من خلال الملاحظة المورفولوجية والتحليل النسيجي. يجب أن يكون الهيكل الرقائقي المتشكل كاملا وكثيفا ، مع تشابك الخلايا لتشكيل نمط منسوج عن طريق ال...

Discussion

مع تقدم التكنولوجيا الحيوية لهندسة الأنسجة ، كانت استراتيجيات بناء هيكل قابل للزرع مع مرونة عالية وتحتوي على خلايا باقية على المدى الطويل يمكنها تحقيق التجديد الأمثل محور تركيز العديد من العلماء. هناك مجموعة متنوعة من طرق الزرع الحالية للخلايا الجذعية الجذعية ، مثل طر?...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من خلال منح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81930025 و 82100969 و 82071075) والبرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2022YFA1104400 و 2021YFA1100600). نحن ممتنون للمساعدة التي قدمها المركز الوطني للتعليم التجريبي للطب الأساسي (AMFU).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% Trypsin-EDTA (1x)SigmaT4049Cell passage
Automatic Dehydration MachineLEICAASP200sDehydrate aggregate
CentrifugeEppendorf5418RCentrifugation
Centrifuge tubeThermo Nunc339650Centrifugation
Culture dishThermo150466Culture of UCMSCs
EthanolSCR10009218Dehydrate aggregate
Fatal bovine serumSijiqing11011-8611Culture of UCMSCs
ForcepJZJD1080Harvest aggregate
GlutaraldehydeProandy10217-1Fixation of aggregate
Hematoxylin and Eosin Staining KitbeyotimeC0105SHE staining
HexamethyldisilazaneSCR80068416Dry aggregate surface
Hoechst33342Sigma14533Cell nuclei stain
L-glutamineSigmaG5792Culture of UCMSCs
Live/dead Viability/Cytotoxicity Kit InvitrogenL3224Live/dead cell stain
Masson's Staining KitZHCCD069Masson Staining
Minimum Essential Medium Alpha basic (1x)GibcoC12571500BTCulture of UCMSCs
ParaffinLeica39601006Tissue embedding
ParaformaldehydeSaint-BioD16013Fixation of aggregate
PBS (1x)MeilunbioMA0015Resuspend and purify UCMSCs
Penicillin/StreptomycinProcell Life SciencePB180120Culture of UCMSCs
Pentobarbital sodiumSigmaP3761Animal anesthesia
PolysporinPfizerPrevent eye dry
Scanning Electron MicroscopeHitachis-4800SEM observation
ScissorJZY00030Animal surgical incision
Six-well plateThermo140675Culture of UCMSCs
StitchJinhuanF603Close wounds
SutureXy4-0Close wounds
Thermostatic equipmentGrantv-0001-0005Water bath
UCMSCsBai'ao UKK220201Commercially UCMSCs
Vitamin CDiyibioDY40138-25gAggregate inducing
XyleneSCR10023418Dehydrate aggregate

References

  1. Hall, B. K., Miyake, T. Divide, accumulate, differentiate: cell condensation in skeletal development revisited. The International Journal of Developmental Biology. 39 (6), 881-893 (1995).
  2. Hall, B. K., Miyake, T. All for one and one for all: condensations and the initiation of skeletal development. Bioessays. 22 (2), 138-147 (2000).
  3. Salhotra, A., Shah, H. N., Levi, B., Longaker, M. T. Mechanisms of bone development and repair. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 21 (11), 696-711 (2020).
  4. Mammoto, T., et al. Mechanochemical control of mesenchymal condensation and embryonic tooth organ formation. Developmental Cell. 21 (4), 758-769 (2011).
  5. Khanarian, N. T., Jiang, J., Wan, L. Q., Mow, V. C., Lu, H. H. A hydrogel-mineral composite scaffold for osteochondral interface tissue engineering. Tissue Engineering. Part A. 18 (5-6), 533-545 (2012).
  6. Liu, M., et al. Injectable hydrogels for cartilage and bone tissue engineering. Bone Research. 5, 17014 (2017).
  7. Ai, C., et al. Osteochondral tissue engineering: Perspectives for clinical application and preclinical development. Journal of Orthopaedic Translatation. 30, 93-102 (2021).
  8. Huang, X., et al. Microenvironment influences odontogenic mesenchymal stem cells mediated dental pulp regeneration. Frontiers in Physiology. 12, 656588 (2021).
  9. Li, M., Ma, J., Gao, Y., Yang, L. Cell sheet technology: a promising strategy in regenerative medicine. Cytotherapy. 21 (1), 3-16 (2019).
  10. An, Y., et al. marrow mesenchymal stem cell aggregate: an optimal cell therapy for full-layer cutaneous wound vascularization and regeneration. Scientific Reports. 5, 17036 (2015).
  11. Miura, M., et al. SHED: stem cells from human exfoliated deciduous teeth. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (10), 5807-5812 (2003).
  12. Gronthos, S., et al. Stem cell properties of human dental pulp stem cells. Journal of Dental Research. 81 (8), 531-535 (2002).
  13. Chen, H., et al. Regeneration of pulpo-dentinal-like complex by a group of unique multipotent CD24a(+) stem cells. Science Advances. 6 (15), (2020).
  14. Yang, T., et al. hDPSC-laden GelMA microspheres fabricated using electrostatic microdroplet method for endodontic regeneration. Materials Science & Engineering. C: Materials for Biological Applications. 121, 111850 (2021).
  15. Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments. (51), 2720 (2011).
  16. Nakao, K., et al. The development of a bioengineered organ germ method. Nature Methods. 4 (3), 227-230 (2007).
  17. Hasani-Sadrabadi, M. M., et al. An engineered cell-laden adhesive hydrogel promotes craniofacial bone tissue regeneration in rats. Science Translational Medicine. 12 (534), (2020).
  18. Fan, L., et al. Gravitational sedimentation-based approach for ultra-simple and flexible cell patterning coculture on microfluidic device. Biofabrication. 12 (3), 035005 (2020).
  19. Singh, R., et al. Cell specificity of magnetic cell seeding approach to hydrogel colonization. Journal of Biomedical Materials Research: Part A. 105 (11), 2948-2957 (2017).
  20. Guo, H., et al. Odontogenesis-related developmental microenvironment facilitates deciduous dental pulp stem cell aggregates to revitalize an avulsed tooth. Biomaterials. 279, 121223 (2021).
  21. Xuan, K., et al. Deciduous autologous tooth stem cells regenerate dental pulp after implantation into injured teeth. Science Translational Medicine. 10 (455), (2018).
  22. Sui, B. D., et al. Stem cell-based bone regeneration in diseased microenvironments: Challenges and solutions. Biomaterials. 196, 18-30 (2019).
  23. Shang, F., et al. Human umbilical cord MSCs as new cell sources for promoting periodontal regeneration in inflammatory periodontal defect. Theranostics. 7 (18), 4370-4382 (2017).
  24. Arnold, A. M., Holt, B. D., Daneshmandi, L., Laurencin, C. T., Sydlik, S. A. Phosphate graphene as an intrinsically osteoinductive scaffold for stem cell-driven bone regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (11), 4855-4860 (2019).
  25. Wu, M., et al. SHED aggregate exosomes shuttled miR-26a promote angiogenesis in pulp regeneration via TGF-beta/SMAD2/3 signalling. Cell Proliferation. 54 (7), e13074 (2021).
  26. Li, Z., et al. Apoptotic vesicles activate autophagy in recipient cells to induce angiogenesis and dental pulp regeneration. Molecular Therapy. 30 (10), 3193-3208 (2022).
  27. Vogel, V. Unraveling the mechanobiology of extracellular matrix. Annual Review of Physiology. 80, 353-387 (2018).
  28. Huebsch, N., et al. Harnessing traction-mediated manipulation of the cell/matrix interface to control stem-cell fate. Nature Materials. 9 (6), 518-526 (2010).
  29. Shuai, Y., et al. Melatonin treatment improves mesenchymal stem cells therapy by preserving stemness during long-term in vitro expansion. Theranostics. 6 (11), 1899-1917 (2016).
  30. Sui, B. D., Zhu, B., Hu, C. H., Zhao, P., Jin, Y. Reconstruction of regenerative stem cell niche by cell aggregate engineering. Methods in Molecular Biology. 2002, 87-99 (2019).
  31. Wei, F., et al. Vitamin C treatment promotes mesenchymal stem cell sheet formation and tissue regeneration by elevating telomerase activity. Journal of Cellular Physiology. 227 (9), 3216-3224 (2012).
  32. de Clerck, Y. A., Jones, P. A. The effect of ascorbic acid on the nature and production of collagen and elastin by rat smooth-muscle cells. The Biochemical Journal. 186 (1), 217-225 (1980).
  33. Fujisawa, K., et al. Evaluation of the effects of ascorbic acid on metabolism of human mesenchymal stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 93 (2018).
  34. Wang, T., et al. The histone demethylases Jhdm1a/1b enhance somatic cell reprogramming in a vitamin-C-dependent manner. Cell Stem Cell. 9 (6), 575-587 (2011).
  35. Sun, J., et al. Osthole improves function of periodontitis periodontal ligament stem cells via epigenetic modification in cell sheets engineering. Scientific Reports. 7 (1), 5254 (2017).
  36. Wang, Y. J., et al. Resveratrol enhances the functionality and improves the regeneration of mesenchymal stem cell aggregates. Experimental and Molecular. 50 (6), 1-15 (2018).
  37. Shang, F., et al. The effect of licochalcone A on cell-aggregates ECM secretion and osteogenic differentiation during bone formation in metaphyseal defects in ovariectomized rats. Biomaterials. 35 (9), 2789-2797 (2014).
  38. Dissanayaka, W. L., Zhu, L., Hargreaves, K. M., Jin, L., Zhang, C. Scaffold-free prevascularized microtissue spheroids for pulp regeneration. Journal of Dental Research. 93 (12), 1296-1303 (2014).
  39. Dissanayaka, W. L., Zhu, L., Hargreaves, K. M., Jin, L., Zhang, C. In vitro analysis of scaffold-free prevascularized microtissue spheroids containing human dental pulp cells and endothelial cells. Journal of Endodontics. 41 (5), 663-670 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

MSC

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved