Konstruktion, Charakterisierung und regenerative Anwendung von selbstorganisierten humanen mesenchymalen Stammzellaggregaten

Zusammenfassung

Diese Arbeit beschreibt eine Methode zur Konstruktion von Aggregaten, die auf der Selbstorganisation humaner mesenchymaler Stammzellen basiert, und identifiziert die morphologischen und histologischen Merkmale für die regenerative Behandlung von kranialen Knochendefekten.

Zusammenfassung

Mesenchymale Stammzellen (MSCs), die sich durch ihre Selbsterneuerungsfähigkeit und ihr Potenzial zur Differenzierung mehrerer Linien auszeichnen, können aus verschiedenen Quellen gewonnen werden und entwickeln sich zu vielversprechenden Kandidaten für die regenerative Medizin, insbesondere für die Regeneration von Zahn, Knochen, Knorpel und Haut. Der selbstorganisierte Ansatz der MSC-Aggregation, bei dem insbesondere Zellcluster konstruiert werden, die die sich entwickelnde mesenchymale Kondensation nachahmen, ermöglicht die Abgabe von Stammzellen mit hoher Dichte zusammen mit konservierten Zell-Zell-Interaktionen und extrazellulärer Matrix (ECM) als Nische in der Mikroumgebung. Es hat sich gezeigt, dass diese Methode eine effiziente Zelltransplantation und ein effizientes Überleben ermöglicht und somit die optimierte Anwendung exogener MSCs im Tissue Engineering fördert und die klinische Organregeneration sicherstellt. Dieser Artikel enthält ein detailliertes Protokoll für die Konstruktion und Charakterisierung von selbstorganisierten Aggregaten auf der Basis von mesenchymalen Stammzellen (UCMSCs) der Nabelschnur sowie ein Beispiel für die Anwendung zur regenerativen Schädelknochenbildung. Die Implementierung dieses Verfahrens wird dazu beitragen, eine effiziente MSC-Transplantationsstrategie für das Tissue Engineering und die regenerative Medizin zu etablieren.

Einleitung

Die Kondensation von mesenchymalen Stammzellen (MSC) ist ein wesentliches Stadium, um das normale Wachstum und die Entwicklung des Körpers in der frühen Organogenese^{zu gewährleisten 1,2}, insbesondere bei der Bildung von Knochen, Knorpel, Zähnen und Haut ^1,3,4. In den letzten Jahrzehnten haben Tissue-Engineering-Therapien mit kultivierten postnatalen MSCs in Kombination mit biologisch abbaubaren Gerüsten wichtige Fortschritte bei der osteogenen⁵ und knorpeligen Regeneration^{erzielt 6}. Die Verwendung von Gerüsten kann jedoch einige Nachteile mit sich bringen, wie z. B. Immunabstoßung sowie eine geringe zelluläre Affinität und Plastizität⁷. In diesem Zusammenhang haben wir die Machbarkeit der Anwendung einer Sphäroid-Zellkulturmethode untersucht, um gerüstfreie, selbstorganisierte Aggregate bereitzustellen, die das sich entwickelnde Kondensationsphänomen nachahmen und nur MSCs und die abgelagerte extrazelluläre Matrix (ECM) ^enthalten8. Die Bildung von Aggregaten erhöht die applikative Plastizität, um sie an die Defektform anzupassen, und vermeidet die Gerüstimplantation und die Verdauung durch proteolytische Enzyme zur Gewinnung von MSCs für die Transplantation⁹.

MSC-Aggregate werden unter anderem häufig zur Regeneration von Knochen, Zahnpulpa, Parodont und Haut¹⁰ verwendet. Viele verschiedene Arten von MSCs können als Kandidaten für Samenzellen ausgewählt werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Knochenmark-MSCs (BMMSCs), Nabelschnur-MSCs (UCMSCs), aus Fettgewebe gewonnene Stromazellen (ADSCs) und dentale MSCs (z. B. mesenchymale Stammzellen der Zahnpulpa [DPSCs], mesenchymale Stammzellen aus den Milchzähnen [SHED]¹¹ und parodontale mesenchymale Stammzellen [PDLSCs])¹². In den letzten zehn Jahren wurden viele Technologien für dreidimensionale Zellcluster entwickelt, darunter auch die assistierte und selbstorganisierte Aggregation. Assistierte Aggregationsansätze sind jedoch oft schwach bei der Herstellung von ECMs und der Bildung homogener und dichter Aggregate und daher nicht geeignet, physiologische Bedingungen nachzuahmen 13,14,15. Darüber hinaus erfordern einige assistierte Aggregationsmethoden Zell-Material-Interaktionen, um stabile Strukturen zu bilden 16,17,18,19, während diese selbstorganisierte Aggregationsmethode im Allgemeinen für eine breite Palette von MSCs verfügbar ist. Insbesondere in unseren jüngsten klinischen Studien wurden MSC-Aggregate erfolgreich zur Regeneration des Pulpa-Dentin-Komplexes und des Parodonts nach Implantation in verletzte menschliche Schneidezähne eingesetzt. die eine de novo Geweberegeneration mit physiologischer Struktur und Funktion erreicht haben^20,21.

Dieser Artikel bietet ein gründliches Verfahren für die Konstruktion und Charakterisierung von MSC-Aggregaten sowie für die in vivo-Transplantation . Dieser Ansatz wird die Aufmerksamkeit von Forschern auf sich ziehen, wenn sie darauf abzielen, Defekte in Geweben wie Zähnen, Knochen, Knorpel und Haut auf der Grundlage von Stammzellanwendungen zu reparieren. Dieses Verfahren ist einfach, zweckmäßig und vollständig aus Zellen und EZM ohne zusätzliche Gerüste aufgebaut, die über einen langen Zeitraum kultiviert werden können, um dichte und stabile Aggregate^{zu erhalten 22}. Gleichzeitig sind die auf diese Weise kultivierten Aggregate reich an EZM, die die Entwicklungsnische für diese Zellen mit hoher Dichte nachahmt und so die Geweberegeneration fördert²³. Der Bauprozess kann in zwei Phasen unterteilt werden: Zellvorbereitung und -kultur sowie selbstorganisierte Bildung und Ernte von Zellaggregaten. Die Charakterisierung von Aggregaten umfasst die morphologische Identifizierung mit einem inversen optischen Mikroskop und einem Rasterelektronenmikroskop (REM) sowie die histologische Analyse mit Hämatoxylin und Eosin (HE) und die Masson-Färbung. Die gebildeten Aggregate wurden für die regenerative Implantation zur Reparatur des Schädelknochendefekts demonstriert. Die Implementierung dieses Verfahrens wird dazu beitragen, eine effiziente MSC-Transplantationsstrategie für das Tissue Engineering und die regenerative Medizin zu etablieren.

Protokoll

HINWEIS: Alle Tierverfahren wurden vom Animal Care and Use Committee der Fourth Military Medical University genehmigt und in Übereinstimmung mit dem National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals durchgeführt. Für die vorliegende Studie wurden kryokonservierte humane UCMSCs verwendet, die aus einer kommerziellen Quelle gewonnen wurden (siehe Materialtabelle). Die Verwendung menschlicher Zellen wurde von der Ethikkommission der Vierten Militärmedizinischen Universität genehmigt. UCMSCs wurden als Beispiel genommen, um das Verfahren zu beschreiben. Der Schädeldefekt wurde als Beispiel genommen, um den Reparaturbedarf zur Beschreibung des Implantationsverfahrens zu zeigen. Alle Experimente wurden dreimal wiederholt.

1. Bau von UCMSC-Zuschlagstoffen

1. Vorbereitung und Kultur von UCMSCs
   1. Geben Sie 10 ml vorgewärmte phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) in ein neues 15-ml-Zentrifugalröhrchen in einer sterilen Biosicherheitswerkbank.
   2. Entfernen Sie das Gefrierröhrchen mit gefrorenen UCMSCs aus flüssigem Stickstoff und legen Sie es schnell in ein 37 °C heißes Wasserbad. Schütteln Sie das Röhrchen vorsichtig, um ein schnelles und gründliches Auftauen der Zellen zu ermöglichen.
      ACHTUNG: Der gesamte Vorgang muss innerhalb von 1 Minute abgeschlossen sein, da Dimethylsulfoxid (DMSO) in der Gefrierlösung Zytotoxizität verursachen kann.
   3. Die Zellen werden leicht im Gefrierröhrchen suspendiert und der gesamte Inhalt in das Zentrifugenröhrchen mit 10 ml PBS überführt (Schritt 1.1.1). Die Probe wird bei 100 × g 5 Minuten lang zentrifugiert. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie die Zellen mit 10 ml PBS.
   4. Die Probe wird bei 100 × g 5 Minuten lang zentrifugiert. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen vorsichtig mit vollständigem essentiellem Alpha-Minimum (α-MEM), das 10 % fötales Rinderserum (FBS), 1 % Penicillin-Streptomycin und 584 mg/l Glutamin enthält.
   5. Die resuspendierten Zellen werden in 10-cm-Kulturschalen ausgesät (oft ein bis zwei Schalen für ein Röhrchen, abhängig von der Gesamtmenge der Zellen nach der Zentrifugation, bei einer Dichte von 5 × 10⁶ Zellen pro Schale). Geben Sie vollständiges α-MEM-Medium in die Schalen bis zu einem Gesamtvolumen von 10 ml.
   6. Schütteln Sie die Schalen vorsichtig, um die Zellen zu verteilen. Die Schalen werden bei 37 °C mit 5 % CO₂ in einer befeuchteten Kammer inkubiert. Nach der Inkubation über Nacht verwerfen Sie das überstehende Medium und fügen Sie 5 ml PBS 1-2x hinzu, um die nicht anhaftenden Zellen zu entfernen. Fügen Sie 10 ml frisches vollständiges α-MEM-Medium hinzu. Wechseln Sie den Nährboden alle 2 Tage.
   7. Für die Zellpassage, wenn die Zellen eine Konfluenz von 80 % bis 90 % erreichen, verwerfen Sie den Überstand und waschen Sie die Zellen mit 5 ml PBS, um das Medium gründlich zu entfernen. Inkubieren Sie die Zellen in 2 mL 0,25 % Trypsin-1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) bei 37 °C für 2 Minuten.
   8. Wenn die Zellen unter dem Mikroskop rund werden und die interzellulären Verbindungen gebrochen sind, trennen Sie die Zellen von den Schalen, ohne die Zellstruktur zu stark zu stören. Neutralisieren Sie das Trypsin, indem Sie 4 ml vollständiges α-MEM-Medium hinzufügen.
   9. Sammeln Sie die Zellen wiederholt und vorsichtig aus den Schalen, indem Sie ein frisches 15-ml-Zentrifugenröhrchen einpipettieren. Die Probe wird bei 100 × g 5 Minuten lang zentrifugiert. Entsorgen Sie den Überstand, resuspendieren Sie die Zellen mit vollständigem α-MEM-Medium und säen Sie sie in frische Kulturschalen oder Vertiefungsplatten aus. Wechseln Sie den Nährboden alle 2 Tage.
      HINWEIS: Entsprechend der Größe des Defektbereichs erfordert ein Defekt von 25 mm³ die Verwendung einer Vertiefung mit 6-Well-Plattenzellen, die zu Aggregaten kultiviert werden.
2. Bildung und Ernte von Gesteinskörnungen
   1. Bereiten Sie zellaggregatinduzierende Medien vor, indem Sie 50 μg/ml Vitamin C in α-MEM mit 10 % FBS, 1 % Penicillin-Streptomycin und 584 mg/l Glutamin hinzufügen.
      ACHTUNG: Direkte Lichteinwirkung sollte bei der Verwendung von Vitamin C vermieden werden, da Vitamin C bei Lichteinwirkung oxidiert und unwirksam wird.
   2. Wenn die Zellen in Schritt 1.1.12 eine Konfluenz von 95 % erreichen (ergänzende Abbildung S1), wechseln Sie das Medium zu einem zellaggregatinduzierenden Medium; Wechseln Sie alle 2 Tage das frische Zellaggregat-induzierende Medium.
   3. Nach 7-10 Tagen der Induktion (die Dauer der Induktion hängt von den Stammzelltypen ab und beträgt oft ~7 Tage für den Rand von UCMSCs) suchen Sie unter dem Mikroskop nach geformten Aggregaten mit dicken Rändern, die vom Boden der Schale getrennt sind.
   4. Entsorgen Sie das Nährmedium und waschen Sie die Zellen vorsichtig 2x mit PBS. Schieben Sie die Aggregate mit einer kleinen sterilen Pinzette vorsichtig vom Rand zur Mitte und falten Sie die Aggregate.
   5. In einigen Fällen können sich UCMSCs spontan zur Mitte hin zusammenrollen, um ein festes Kondenswasser zu bilden. Diese Struktur entspricht dem in Schritt 1.2.4 ermittelten Aggregat.

2. Morphologische Identifizierung von Aggregaten

1. Allgemeine und mikroskopische Beobachtung
   1. Es ist zu beachten, dass die Aggregate dicht und integriert sind und nicht leicht durch mechanische Kräfte, wie z. B. Ziehen beim Ablösen und Umpflanzen, beschädigt werden können.
   2. Suchen Sie unter dem Mikroskop nach einer membranartigen Struktur einer bestimmten Dicke mit gewebtem Muster.
2. Färbung lebender/toter Zellen
   1. Aussaat der Zellen in einer 6-Well-Platte mit einer Dichte von 1 × 10⁶ Zellen pro Well.
   2. Bereiten Sie 2 μM Calcein AM und 4 μM EthD-1 Arbeitslösung unter Verwendung von PBS vor.
   3. Fügen Sie den Zellen 5 Minuten lang 0,3% Triton hinzu, waschen Sie sie dreimal mit PBS, um die Zellen zum Absterben zu bringen, als Kontrolle für die Färbung.
   4. Waschen Sie die Zellen, Aggregate und todauslösenden Zellen zweimal mit PBS.
   5. In jeder Vertiefung werden 100 μl PBS und 100 μl vorbereitete Färbelösung in Schritt 2.2.2 gegeben.
   6. Inkubieren Sie die Probe 30 Minuten lang bei RT. Waschen Sie die Probe zweimal mit PBS.
   7. Geben Sie 200 μl 10 μg/mL Hoechst in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Probe 5 Minuten lang bei RT. Wiederholen Sie die Probe zweimal mit PBS.
   8. Unter einem Fluoreszenzmikroskop beobachten.
3. REM-Beobachtung
   1. Die in Schritt 1.2.4 oder 1.2.5 erhaltenen Aggregate werden säen und induzieren. Waschen Sie die Zellen mit PBS, nachdem die Aggregate in Schritt 1.2.4 gebildet wurden. oder 1.2.5.
   2. Fixieren Sie die Zellen mindestens 4 h lang mit Glutaraldehyd.
   3. Waschen Sie die Proben mit PBS und dehydrieren Sie sie dann durch eine Gradientenkonzentration von Ethanol von 30 %, 50 %, 70 %, 80 %, 90 % auf 100 % jeweils für 5 Minuten. 2x mit wasserfreiem Ethanol behandeln.
   4. Tauchen Sie die Aggregate 30 Minuten lang in 3 mL Hexamethyldisilazan. Saugen Sie die gesamte Flüssigkeit ab und trocknen Sie die Proben auf natürliche Weise gründlich ab.
      ACHTUNG: Der gesamte Prozess muss in einem Abzug durchgeführt werden, da Hexamethyldisilazan flüchtig und hochgiftig ist.
   5. Kleben Sie die getrockneten Proben mit doppelseitigem Kohleband auf den Probentisch und beschichten Sie die Oberfläche mit Metall. Lagern Sie die Probe mehrere Tage lang bei Raumtemperatur (RT).
   6. Unter einem REM beobachten.
      1. Setzen Sie die Probe wieder in die Maschine ein. Stellen Sie die Maschinenspannung auf 5 k und die Brennweite auf ~12 mm ein. Passen Sie die Fokusleiste an, bis ein klares Bild angezeigt wird.
      2. Nehmen Sie die Bilder mit geringer Vergrößerung auf. Passen Sie die Vergrößerung an und fokussieren Sie neu, um ein Bild mit höherer Vergrößerung zu erhalten.
         ACHTUNG: Die Oberfläche der Zuschlagstoffe darf vor der Beobachtung nicht berührt werden, um eine Zerstörung der Oberflächenmorphologie zu vermeiden.

3. Histologische Analyse von Gesteinskörnungen

1. Fixieren und Schneiden von Proben
   1. Die in den Schritten 1.2.4 oder 1.2.5 erhaltenen Zuschlagstoffe werden mindestens 24 h lang mit 4 % Paraformaldehyd bei 4 ΰC fixiert. Nach der Fixierung mit PBS waschen und die Probe über Nacht in Einbettkassetten geben, um sie mit fließendem Wasser abzuspülen.
   2. Dehydrieren Sie die Proben mit automatischen Dehydratisierungsmaschinen durch Gradientenethanol, Xylol und Paraffin gemäß den Anweisungen des Herstellers. Der gesamte Prozess läuft wie folgt ab: 85% Ethanol für 2 h bei RT, 95% Ethanol für 2 h bei RT, 95% Ethanol für 2 h bei RT, 100% Ethanol für 2 h bei RT, 100% Ethanol für 1,5 h bei RT, Xylol für 45 min bei RT, Xylol für 45 min bei RT, Paraffin für 30 min bei RT, Paraffin für 1,5 h bei RT und schließlich Paraffin für 2 h bei 60 °C.
   3. Betten Sie die Proben mit Paraffin ein. Bereiten Sie ca. 5 μm dicke Schnitte vor, kleben Sie sie auf kationische Objektträger und trocknen Sie die Objektträger 2 h lang bei 45 °C.
   4. Nacheinander 15 min, zweimal und 100 %, 90 %, 80 % und 70 % Ethanol (jeweils 5 min) entwachsen.
   5. Spülen Sie die Rutschen 3x langsam mit fließendem Wasser für 5 min ab.
2. HE-Färbung
   1. 3-5 Minuten mit Hämatoxylin färben, mit Wasser abspülen und vorsichtig überschüssige Flüssigkeit um das Gewebe herum entfernen.
   2. Mit Ethanol mit 1% Salzsäure 3-5 s fraktionieren und unter fließendem Wasser abspülen, wobei die Farbe etwas heller und blau wird. Entferne überschüssiges Wasser um das Gewebe herum.
   3. 1 Minute lang mit Eosin färben, mit fließendem Wasser abspülen und überschüssige Flüssigkeit um das Gewebe herum entfernen.
   4. Dörren Sie mit 70 %, 80 %, 90 % und 100 % Ethanol für jeweils 10 s, Xylol für 15 min, zweimal, und trocknen Sie auf natürliche Weise im Abzug, bevor Sie die Folie versiegeln.
   5. Fügen Sie neutrale Harztropfen hinzu und versiegeln Sie die Dias mit Deckgläsern. Beobachten Sie unter einem Lichtmikroskop.
3. Massons Trichrom-Färbung
   1. Mit Weigert's Eisenhämatoxylin 5 min färben, mit Wasser abspülen und trocken wischen.
   2. Mit Ethanol mit 1% Salzsäure 3-5 s fraktionieren und unter fließendem Wasser abspülen, wobei die Farbe etwas heller und blau wird. Wischen Sie die Oberfläche trocken.
   3. Mit Lixin roter saurer Magentalösung 5-10 min beizen und schnell mit destilliertem Wasser abspülen.
   4. Mit wässriger Phosphomolybdsäurelösung für 3-5 min behandeln.
   5. Direkt 5 Minuten lang mit Anilinblaulösung erneut färben, ohne mit Wasser zu waschen.
   6. Mit 1% Eisessig 1 min behandeln.
   7. Dörren Sie mit 70 %, 80 %, 90 % und 100 % Ethanol für jeweils 10 s, Xylol für 15 min, zweimal, und trocknen Sie auf natürliche Weise im Abzug, bevor Sie die Folie versiegeln.
   8. Fügen Sie neutrale Harztropfen hinzu und versiegeln Sie die Dias mit Deckgläsern. Beobachten Sie unter einem Lichtmikroskop.

4. Implantation

1. Betäuben Sie die Nacktmaus durch eine intraperitoneale Injektion von 50 mg/kg Pentobarbital-Natrium.
   HINWEIS: Vergewissern Sie sich, dass die Mäuse ordnungsgemäß betäubt sind, da beim Einklemmen des Fußballens kein Hornhautreflex und keine Reaktion der Gliedmaßen auftritt. Tragen Sie Augensalbe auf, um Trockenheit zu verhindern.
2. Schneiden Sie mit einer sterilen kleinen Schere nach der Desinfektion mit Jodophor einen Querschnitt (~3-4 cm) in die Haut hinter den Ohren der Nacktmaus aus.
3. Ziehe die Haut nach vorne, um den Schädel freizulegen. Zeichnen Sie die Ränder des geplanten Defektbereichs mit einer 11#-Klinge leicht nach und entfernen Sie das Knochenfragment. Der Defektbereich ist ein kreisförmiger Bereich mit einem Durchmesser von ca. 4 mm. Verwenden Sie Kochsalzlösung, um die Wunde zu spülen und für eine ausreichende Blutstillung zu sorgen.
4. Die in Schritt 1.2.5 oder 1.2.6 erhaltenen Aggregate werden vor der Implantation mit steriler Gaze getaucht, um die Oberflächenfeuchtigkeit aufzunehmen. Platzieren Sie die Aggregate in den Bereich und setzen Sie sie leicht unter Druck, um den Defekt zu füllen.
5. Ersetzen Sie die Haut nach dem Ziehen, um sicherzustellen, dass das Implantat fixiert ist. Schließen Sie den Schnitt mit 1/2, 4 × 10 abgewinkelten Stichen und 4-0 Nähten.
6. Legen Sie die Tiere nach der Operation auf die Aufwärmdecke, bis sie aktiv sind, und setzen Sie sie dann wieder in den Käfig zurück.
   HINWEIS: Die Tiere dürfen nicht unbeaufsichtigt gelassen werden, bis sie wieder ausreichend bei Bewusstsein sind, um das Brustbein aufrecht zu erhalten. Die Tiere, die operiert wurden, werden erst dann wieder in die Gesellschaft anderer Tiere zurückgebracht, wenn sie sich vollständig erholt haben.

Ergebnisse

Aggregate können gemäß dem experimentellen Arbeitsablauf erfolgreich aus UCMSCs konstruiert werden (Abbildung 1). Die Qualität der Gesteinskörnungen muss vor der Verwendung durch morphologische Beobachtungen und histologische Analysen bewertet werden. Die gebildete lamellare Struktur sollte vollständig und dicht sein, wobei die Zellen durch mikroskopische Betrachtung zu einem gewebten Muster verflochten sind (Abbildung 2A<...

Diskussion

Mit den Fortschritten der Tissue-Engineering-Biotechnologie sind Strategien zur Konstruktion einer implantierbaren Struktur mit hoher Plastizität und mit langfristig überlebenden Zellen, die eine optimale Regeneration erreichen können, in den Fokus vieler Wissenschaftler gerückt. Es gibt eine Vielzahl von aktuellen Implantationsmethoden von MSCs, wie z.B. zelluläre Methoden, mit Zytokinen ergänzt Scaffolds ^6,24 oder die Kom...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA (1x)	Sigma	T4049	Cell passage
Automatic Dehydration Machine	LEICA	ASP200s	Dehydrate aggregate
Centrifuge	Eppendorf	5418R	Centrifugation
Centrifuge tube	Thermo Nunc	339650	Centrifugation
Culture dish	Thermo	150466	Culture of UCMSCs
Ethanol	SCR	10009218	Dehydrate aggregate
Fatal bovine serum	Sijiqing	11011-8611	Culture of UCMSCs
Forcep	JZ	JD1080	Harvest aggregate
Glutaraldehyde	Proandy	10217-1	Fixation of aggregate
Hematoxylin and Eosin Staining Kit	beyotime	C0105S	HE staining
Hexamethyldisilazane	SCR	80068416	Dry aggregate surface
Hoechst33342	Sigma	14533	Cell nuclei stain
L-glutamine	Sigma	G5792	Culture of UCMSCs
Live/dead Viability/Cytotoxicity Kit	Invitrogen	L3224	Live/dead cell stain
Masson's Staining Kit	ZHC	CD069	Masson Staining
Minimum Essential Medium Alpha basic (1x)	Gibco	C12571500BT	Culture of UCMSCs
Paraffin	Leica	39601006	Tissue embedding
Paraformaldehyde	Saint-Bio	D16013	Fixation of aggregate
PBS (1x)	Meilunbio	MA0015	Resuspend and purify UCMSCs
Penicillin/Streptomycin	Procell Life Science	PB180120	Culture of UCMSCs
Pentobarbital sodium	Sigma	P3761	Animal anesthesia
Polysporin	Pfizer		Prevent eye dry
Scanning Electron Microscope	Hitachi	s-4800	SEM observation
Scissor	JZ	Y00030	Animal surgical incision
Six-well plate	Thermo	140675	Culture of UCMSCs
Stitch	Jinhuan	F603	Close wounds
Suture	Xy	4-0	Close wounds
Thermostatic equipment	Grant	v-0001-0005	Water bath
UCMSCs	Bai'ao	UKK220201	Commercially UCMSCs
Vitamin C	Diyibio	DY40138-25g	Aggregate inducing
Xylene	SCR	10023418	Dehydrate aggregate