JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu çalışma, insan mezenkimal kök hücrelerinin kendi kendine toplanmasına dayalı agregalar oluşturmak için bir yöntemi tanımlamakta ve kraniyal kemik defektlerinin rejeneratif tedavisi için morfolojik ve histolojik özellikleri tanımlamaktadır.

Özet

Kendini yenileme yetenekleri ve çok soylu farklılaşma potansiyelleri ile karakterize edilen mezenkimal kök hücreler (MSC'ler), çeşitli kaynaklardan elde edilebilir ve özellikle diş, kemik, kıkırdak ve cildin yenilenmesi için rejeneratif tıp için umut verici adaylar olarak ortaya çıkmaktadır. Özellikle gelişmekte olan mezenkimal yoğunlaşmayı taklit eden hücre kümeleri oluşturan MSC agregasyonunun kendi kendine bir araya getirilen yaklaşımı, korunmuş hücre-hücre etkileşimleri ve mikro çevre nişi olarak hücre dışı matris (ECM) ile birlikte yüksek yoğunluklu kök hücre dağıtımına izin verir. Bu yöntemin verimli hücre aşılamasını ve sağkalımını sağladığı, böylece doku mühendisliğinde eksojen MSC'lerin optimize edilmiş uygulamasını teşvik ettiği ve klinik organ rejenerasyonunu koruduğu gösterilmiştir. Bu makale, göbek kordonu mezenkimal kök hücrelerine (UCMSC'ler) dayalı olarak kendi kendine monte edilen agregaların yapımı ve karakterizasyonu için ayrıntılı bir protokol ve ayrıca kraniyal kemik rejeneratif uygulamasının bir örneğini sunmaktadır. Bu prosedürün uygulanması, doku mühendisliği ve rejeneratif tıp için verimli bir MSC transplantasyon stratejisinin oluşturulmasına rehberlik edecektir.

Giriş

Mezenkimal kök hücre (MSC) yoğunlaşması, erken organogenezde 1,2, özellikle kemik, kıkırdak, diş ve ciltoluşumunda vücudun normal büyümesini ve gelişmesini sağlamak için önemli bir aşamadır 1,3,4. Son birkaç on yılda, biyolojik olarak parçalanabilen iskelelerle birlikte kültürlenmiş postnatal MSC'leri kullanan doku mühendisliği tedavileri, osteojenik5 ve kıkırdak rejenerasyonunda6 önemli ilerlemeler kaydetmiştir. Bununla birlikte, iskele kullanımı, bağışıklık reddinin yanı sıra düşük hücresel afinite ve plastisite gibi bazı dezavantajlara sahip olabilir7. Bu bağlamda, yalnızca MSC'leri ve birikmiş hücre dışı matrisi (ECM) içeren, gelişmekte olan yoğuşma fenomenini taklit eden iskele içermeyen kendi kendine monte edilmiş agregalar sağlamak için bir küresel hücre kültürü yönteminin uygulanmasının fizibilitesini araştırdık8. Agregaların oluşumu, kusur şekline uyacak şekilde uygulanabilir plastisiteyi arttırır ve transplantasyon için MSC'leri hasat etmek için iskele implantasyonunu ve proteolitik enzimler tarafından sindirimi önler9.

MSC agregaları, diğer doku ve organların yanı sıra kemik, diş pulpası, periodonsiyum ve cilt10'un rejenerasyonu için yaygın olarak kullanılmaktadır. Kemik iliği MSC'leri (BMMSC'ler), göbek kordonu MSC'leri (UCMSC'ler), yağ dokusu kaynaklı stromal hücreler (ADSC'ler) ve dental MSC'ler (örneğin, diş pulpası mezenkimal kök hücresi [DPSC'ler], süt dişlerinden mezenkimal kök hücreler [SHED]11 ve periodontal mezenkimal kök hücreler [PDLSC'ler]) dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere birçok farklı MSC türü tohum hücreleri için aday olarak seçilebilir12. Son on yılda, yardımlı ve kendi kendine monte edilen toplama dahil olmak üzere, üç boyutlu hücre kümeleri için birçok teknoloji geliştirilmiştir. Bununla birlikte, yardımlı agregasyon yaklaşımları, ECM'lerin üretilmesinde ve homojen ve sıkı agregaların oluşturulmasında genellikle zayıftır ve bu nedenle fizyolojik koşulları taklit etmek için uygun değildir 13,14,15. Ayrıca, bazı destekli agregasyon yöntemleri, stabil yapılar 16,17,18,19 oluşturmak için hücre-materyal etkileşimlerini gerektirirken, bu kendi kendine monte edilen agregasyon yöntemi genellikle çok çeşitli MSC'ler için mevcuttur. Özellikle, son klinik çalışmalarımızda, MSC agregatları, yaralı insan kesici dişlerine implantasyondan sonra pulpa-dentin kompleksini ve periodonsiyumu yeniden oluşturmak için başarıyla kullanılmıştır. fizyolojik yapı ve fonksiyon ile de novo doku yenilenmesini sağlamışolanlar 20,21.

Bu makale, MSC agrega yapımı ve karakterizasyonunun yanı sıra in vivo transplantasyon için kapsamlı bir prosedür sağlar. Bu yaklaşım, kök hücre uygulamalarına dayalı olarak diş, kemik, kıkırdak ve deri gibi dokulardaki kusurları onarmayı hedefleyen araştırmacıların dikkatini çekecektir. Bu yöntem basit, kullanışlı ve tamamen yoğun ve stabil agregalar elde etmek için uzun süre kültürlenebilen ek iskeleler içermeyen hücreler ve ECM'den oluşur22. Bu arada, bu şekilde kültürlenen agregalar, bu yüksek yoğunluklu hücreler için gelişen nişi taklit eden ve böylece doku yenilenmesini destekleyen ECM açısından zengindir23. İnşaat süreci iki aşamaya ayrılabilir: hücre hazırlama ve kültürü ve hücre agregalarının kendi kendine monte oluşumu ve hasadı. Agregaların karakterizasyonu, ters çevrilmiş bir optik mikroskop ve bir taramalı elektron mikroskobu (SEM) yoluyla morfolojik tanımlamayı ve hematoksilen ve eozin (HE) ve Masson boyaması yoluyla histolojik analizi içerir. Oluşan agregalar, kraniyal kemik defektini onarmak için rejeneratif implantasyon için gösterildi. Bu prosedürün uygulanması, doku mühendisliği ve rejeneratif tıp için verimli bir MSC transplantasyon stratejisinin oluşturulmasına rehberlik edecektir.

Protokol

NOT: Tüm hayvan prosedürleri, Dördüncü Askeri Tıp Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır ve Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için Ulusal Sağlık Enstitüleri Kılavuzu'na uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Bu çalışma için ticari bir kaynaktan elde edilen dondurularak korunmuş insan UCMSC'leri kullanılmıştır (bkz. İnsan hücrelerinin kullanımı, Dördüncü Askeri Tıp Üniversitesi Etik Kurulu tarafından onaylandı. Prosedürü tanımlamak için UCMSC'ler örnek olarak alınmıştır. Kraniyal defekt, implantasyon prosedürünü tanımlamak için onarım ihtiyacını göstermek için bir örnek olarak alındı. Tüm deneyler üç kez tekrarlandı.

1. UCMSC agregalarının inşası

  1. UCMSC'lerin hazırlanması ve kültürü
    1. Steril bir biyogüvenlik kabininde 15 mL'lik yeni bir santrifüj tüpe 10 mL önceden ısıtılmış fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyin.
    2. Donmuş UCMSC'ler içeren dondurma tüpünü sıvı nitrojenden çıkarın ve hızlı bir şekilde 37 °C'lik bir su banyosuna yerleştirin. Hücrenin hızlı ve kapsamlı bir şekilde çözülmesini kolaylaştırmak için tüpü hafifçe sallayın.
      DİKKAT: Dondurma çözeltisindeki dimetil sülfoksit (DMSO) sitotoksisiteye neden olabileceğinden, tüm prosedür 1 dakika içinde bitirilmelidir.
    3. Dondurma tüpündeki hücreleri hafifçe askıya alın ve tüm içeriği 10 mL PBS içeren santrifüj tüpüne aktarın (adım 1.1.1). Numuneyi 100 × g'da 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve hücreleri 10 mL PBS ile yıkayın.
    4. Numuneyi 100 × g'da 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve hücreleri% 10 fetal sığır serumu (FBS),% 1 penisilin-streptomisin ve% 584 mg / L glutamin içeren tam alfa-minimum esansiyel ortam (α-MEM) ile nazikçe yeniden süspanse edin.
    5. Yeniden süspanse edilmiş hücreleri 10 cm'lik kültür kaplarına tohumlayın (santrifüjlemeden sonraki toplam hücre miktarına bağlı olarak, tabak başına 5 × 106 hücre yoğunluğunda, genellikle bir tüp için bir ila iki tabak). Bulaşıklara toplam 10 mL hacme kadar tam α-MEM ortamı ekleyin.
    6. Hücreleri dağıtmak için bulaşıkları hafifçe sallayın. Bulaşıkları nemlendirilmiş bir odada% 5 CO2 ile 37 ° C'de inkübe edin. Gece boyunca inkübasyondan sonra, süpernatan ortamı atın ve yapışmayan hücreleri çıkarmak için 5 mL PBS 1-2x ekleyin. 10 mL taze tam α-MEM ortamı ekleyin. Kültür ortamını 2 günde bir değiştirin.
    7. Hücre geçişi için, hücreler% 80 -% 90 birleşmeye ulaştığında, süpernatanı atın ve ortamı iyice çıkarmak için hücreleri 5 mL PBS ile yıkayın. Hücreleri 2 mL% 0.25 tripsin-1 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) içinde 37 ° C'de 2 dakika inkübe edin.
    8. Hücreler mikroskop altında kırık hücreler arası bağlantılarla yuvarlak hale geldiğinde, hücre yapısını çok fazla bozmadan hücreleri çanaklardan ayırın. 4 mL tam α-MEM ortamı ekleyerek tripsini nötralize edin.
    9. 15 mL'lik yeni bir santrifüj tüpüne pipetleyerek hücreleri bulaşıklardan tekrar tekrar ve nazikçe toplayın. Numuneyi 100 × g'da 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın, hücreleri tam α-MEM ortamı ile yeniden süspanse edin ve bunları taze kültür kaplarına veya kuyu plakalarına tohumlayın. Kültür ortamını 2 günde bir değiştirin.
      NOT: Kusur alanının boyutuna göre, 25mm3'lük bir kusur, agregalar oluşturmak için kültürlenmiş 6 oyuklu plaka hücrelerinden oluşan bir kuyunun kullanılmasını gerektirir.
  2. Agregaların oluşumu ve hasadı
    1. %10 FBS, %1 penisilin-streptomisin ve 584 mg/L glutamin içeren α-MEM'e 50 μg/mL C vitamini ekleyerek hücre agregatını indükleyen ortamı hazırlayın.
      DİKKAT: C vitamini kullanırken doğrudan ışığa maruz kalmaktan kaçınılmalıdır, çünkü C vitamini ışığa maruz kaldığında oksitlenir ve etkisiz hale gelir.
    2. Adım 1.1.12'deki hücreler %95 birleşmeye ulaştığında (Ek Şekil S1), ortamı hücre agregasını indükleyen ortama değiştirin; Taze hücre agregasını indükleyen ortamı her 2 günde bir değiştirin.
    3. 7-10 günlük indüklemeden sonra (indükleme süresinin uzunluğu kök hücre tiplerine bağlıdır ve UCMSC'lerin kenarı için genellikle ~ 7 gündür), mikroskop altında, kalın kenarları çanak tabanından ayrılmış şekilli agregalar arayın.
    4. Kültür ortamını atın ve hücreleri 2x PBS ile nazikçe yıkayın. Agregaları katlayarak küçük steril forseps kullanarak agregaları kenardan ortaya doğru nazikçe itin.
    5. Bazı durumlarda, UCMSC'ler katı bir yoğuşma oluşturmak için kendiliğinden merkeze doğru kıvrılabilir. Bu yapı, adım 1.2.4'te elde edilen agregaya eşdeğerdir.

2. Agregaların morfolojik tanımlanması

  1. Genel ve mikroskobik gözlem
    1. Agregaların yoğun ve entegre olduğunu ve ayrılma ve nakil sırasında çekme gibi mekanik kuvvetlerden kolayca zarar görmediğini gözlemleyin.
    2. Mikroskop altında, dokuma desenli belirli bir kalınlıkta zar benzeri bir yapı arayın.
  2. Canlı/ölü hücre boyama
    1. Hücreleri 6 oyuklu plakada oyuk başına 1 × 106 hücre yoğunluğunda tohumlayın.
    2. 2 μM kalsein ve 4 μM EthD-1 çalışma solüsyonu hazırlayın ve PBS kullanın.
    3. Hücrelere 5 dakika boyunca% 0.3 triton ekleyin, boyama kontrolü olarak hücreleri ölüme neden etmek için üç kez PBS ile yıkayın.
    4. Hücreleri, agregaları ve ölü indükleyici hücreleri PBS ile iki kez yıkayın.
    5. Her bir oyuğa adım 2.2.2'de 100 μL PBS ve 100 μL hazırlanmış boyama solüsyonu ekleyin.
    6. Numuneyi RT'de 30 dakika inkübe edin. Numuneyi PBS ile iki kez yıkayın.
    7. Her oyuğa 200 μL 10 μg / mL Hoechst ekleyin ve numuneyi RT'de 5 dakika inkübe edin.
    8. Floresan mikroskobu altında gözlemleyin.
  3. SEM gözlemi
    1. Adım 1.2.4 veya 1.2.5'te elde edilen agregaları tohumlayın ve indükleyin. Adım 1.2.4'te agregalar oluştuktan sonra hücreleri PBS ile yıkayın. veya 1.2.5.
    2. Hücreleri en az 4 saat boyunca glutaraldehit kullanarak sabitleyin.
    3. Numuneleri PBS ile yıkayın, ardından her biri 5 dakika boyunca %30, %50, %70, %80, %90 ila %100 arasında bir gradyan etanol konsantrasyonu ile kurutun. 2x'i susuz etanol ile muamele edin.
    4. Agregaları 30 dakika boyunca 3 mL heksametildisilazanan içine daldırın. Tüm sıvıyı aspire edin ve numuneleri doğal olarak iyice kurulayın.
      DİKKAT: Heksametildisilazan uçucu ve oldukça toksik olduğu için tüm işlemin bir davlumbazda yapılması gerekir.
    5. Kurutulmuş numuneleri çift taraflı karbon bant ile numune tablasına yapıştırın ve yüzeyi metal ile kaplayın. Numuneyi birkaç gün oda sıcaklığında (RT) saklayın.
    6. Bir SEM altında gözlemleyin.
      1. Makinenin içindeki numuneyi değiştirin. Makine voltajını 5 k'ye ve odak uzaklığını ~12 mm'ye ayarlayın. Net bir resim görünene kadar odak çubuğunu ayarlayın.
      2. Görüntüleri düşük büyütme oranıyla yakalayın. Daha yüksek büyütmeli bir görüntü elde etmek için büyütmeyi ayarlayın ve yeniden odaklayın.
        DİKKAT: Yüzey morfolojisinin tahrip olmasını önlemek için gözlemden önce agregaların yüzeyine dokunulamaz.

3. Agregaların histolojik analizi

  1. Numunelerin sabitlenmesi ve kesitlendirilmesi
    1. Adım 1.2.4 veya 1.2.5'te elde edilen agregaları %4 paraformaldehit ile 4 °C'de en az 24 saat sabitleyin. Fiksasyondan sonra, PBS ile yıkayın ve numuneyi akan su ile durulamak için gece boyunca gömme kasetlerine yerleştirin.
    2. Üreticinin talimatlarını izleyerek gradyan etanol, ksilen ve parafin yoluyla otomatik dehidrasyon makinelerini kullanarak numuneleri kurutun. Tüm süreç şu şekildedir: RT'de 2 saat boyunca% 85 etanol, RT'de 2 saat% 95 etanol, RT'de 2 saat% 95 etanol, RT'de 2 saat% 100 etanol, RT'de 1.5 saat% 100 etanol, RT'de 45 dakika ksilen, RT'de 45 dakika ksilen, RT'de 30 dakika parafin, RT'de 1,5 saat parafin ve son olarak 60 °C'de 2 saat parafin.
    3. Örnekleri parafin ile gömün. Yaklaşık 5 μm kalınlığında bölümler hazırlayın, bunları katyonik slaytlara yapıştırın ve slaytları 45 °C'de 2 saat kurutun.
    4. Ksilen ile sırayla 15 dakika, iki kez ve %100, %90, %80 ve %70 etanol (her biri 5 dakika) dewax edin.
    5. Slaytları 3x akan su ile 5 dakika yavaşça durulayın.
  2. HE boyama
    1. Hematoksilen ile 3-5 dakika boyayın, suyla durulayın ve doku etrafındaki fazla sıvıyı dikkatlice çıkarın.
    2. 3-5 saniye boyunca% 1 hidroklorik asit içeren etanol ile fraksiyonlayın ve akan su ile durulayın, bu sırada renk biraz daha açık ve mavi olur. Doku etrafındaki fazla suyu alın.
    3. 1 dakika boyunca eozin ile lekeleyin, akan su ile durulayın ve doku etrafındaki fazla sıvıyı alın.
    4. Her biri 10 saniye boyunca %70, %80, %90 ve %100 etanol, 15 dakika, iki kez ksilen ile dehidre edin ve levhayı kapatmadan önce çeker ocakta doğal olarak kurutun.
    5. Nötr reçine damlaları ekleyin ve slaytları lameller ile kapatın. Işık mikroskobu altında gözlemleyin.
  3. Masson'un trikrom boyaması
    1. Weigert demir hematoksilen ile 5 dakika boyayın, suyla durulayın ve kurulayın.
    2. 3-5 saniye boyunca% 1 hidroklorik asit içeren etanol ile fraksiyonlayın ve akan su ile durulayın, bu sırada renk biraz daha açık ve mavi olur. Yüzeyi kurulayın.
    3. Lixin kırmızı asidik macenta çözeltisi ile 5-10 dakika boyayın ve damıtılmış su ile hızlıca durulayın.
    4. 3-5 dakika boyunca fosfomolibdik asit sulu çözeltisi ile muamele edin.
    5. Su ile yıkamadan 5 dakika boyunca anilin mavisi solüsyonu ile doğrudan yeniden lekeleyin.
    6. 1 dakika boyunca% 1 buzlu asetik asit ile muamele edin.
    7. Her biri 10 saniye boyunca %70, %80, %90 ve %100 etanol, 15 dakika, iki kez ksilen ile dehidre edin ve levhayı kapatmadan önce çeker ocakta doğal olarak kurutun.
    8. Nötr reçine damlaları ekleyin ve slaytları lameller ile kapatın. Işık mikroskobu altında gözlemleyin.

4. İmplantasyon

  1. Çıplak fareyi 50 mg / kg pentobarbital sodyum intraperitoneal enjeksiyonu ile uyuşturun.
    NOT: Ayak pedi sıkıştığında kornea refleksi ve uzuv reaksiyonu olmamasına bağlı olarak farelerin uygun şekilde uyuşturulduğunu onaylayın. Kuruluğu önlemek için göz merhemi sürün.
  2. İyodofor ile dezenfeksiyondan sonra steril küçük bir makasla çıplak farenin kulaklarının arkasındaki deride enine bir kesi (~ 3-4 cm) kesin.
  3. Kafatasını ortaya çıkarmak için cildi öne doğru çekin. Planlanan kusur alanının kenarlarını 11# bıçakla hafifçe çizin ve kemik parçasını çıkarın. Kusur alanı, yaklaşık 4 mm çapında dairesel bir alandır. Yarayı yıkamak ve yeterli hemostaz sağlamak için salin kullanın.
  4. Adım 1.2.5 veya 1.2.6'da elde edilen agregaları, implantasyondan önce yüzey nemini emmek için steril gazlı bezle batırın. Agregaları alana yerleştirin ve kusuru doldurmak için hafifçe bastırın.
  5. İmplantın sabitlendiğinden emin olmak için çektikten sonra cildi değiştirin. Kesi 1/2, 4 × 10 açılı dikiş ve 4-0 dikişlerle kapatın.
  6. Ameliyattan sonra, hayvanları aktif olana kadar yeniden ısıtma battaniyesinin üzerine koyun ve ardından kafese geri koyun.
    NOT: Hayvanlar, sternal yaslanmayı sürdürmek için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar gözetimsiz bırakılmamalıdır. Ameliyat geçiren hayvanlar, tamamen iyileşene kadar diğer hayvanların yanına iade edilmez.

Sonuçlar

Agregalar, deneysel iş akışına göre UCMSC'lerden başarıyla oluşturulabilir (Şekil 1). Agregaların kalitesi, kullanımdan önce morfolojik gözlem ve histolojik analiz yoluyla değerlendirilmelidir. Oluşan lameller yapı, mikroskobik gözlemle dokuma bir desen oluşturmak üzere hücreler birbirine geçecek şekilde tam ve yoğun olmalıdır (Şekil 2A). Kenar kıvırma, toplama sırasında keşfedilebilir; a?...

Tartışmalar

Doku mühendisliği biyoteknolojisindeki ilerlemelerle birlikte, yüksek plastisiteye sahip ve optimal rejenerasyonu sağlayabilen uzun süreli hayatta kalan hücreleri içeren implante edilebilir bir yapı oluşturma stratejileri birçok bilim insanının odak noktası olmuştur. MSC'lerin sadece hücre yöntemleri, sitokinlerle tamamlanan iskeleler 6,24 veya kök hücreler ve iskelelerin5 kombinasyonu gi...

Açıklamalar

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81930025, 82100969 ve 82071075) ve Çin Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı'ndan (2022YFA1104400 ve 2021YFA1100600) alınan hibelerle desteklenmiştir. Temel Tıp Ulusal Deneysel Öğretim Gösteri Merkezi'nin (AMFU) yardımı için minnettarız.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% Trypsin-EDTA (1x)SigmaT4049Cell passage
Automatic Dehydration MachineLEICAASP200sDehydrate aggregate
CentrifugeEppendorf5418RCentrifugation
Centrifuge tubeThermo Nunc339650Centrifugation
Culture dishThermo150466Culture of UCMSCs
EthanolSCR10009218Dehydrate aggregate
Fatal bovine serumSijiqing11011-8611Culture of UCMSCs
ForcepJZJD1080Harvest aggregate
GlutaraldehydeProandy10217-1Fixation of aggregate
Hematoxylin and Eosin Staining KitbeyotimeC0105SHE staining
HexamethyldisilazaneSCR80068416Dry aggregate surface
Hoechst33342Sigma14533Cell nuclei stain
L-glutamineSigmaG5792Culture of UCMSCs
Live/dead Viability/Cytotoxicity Kit InvitrogenL3224Live/dead cell stain
Masson's Staining KitZHCCD069Masson Staining
Minimum Essential Medium Alpha basic (1x)GibcoC12571500BTCulture of UCMSCs
ParaffinLeica39601006Tissue embedding
ParaformaldehydeSaint-BioD16013Fixation of aggregate
PBS (1x)MeilunbioMA0015Resuspend and purify UCMSCs
Penicillin/StreptomycinProcell Life SciencePB180120Culture of UCMSCs
Pentobarbital sodiumSigmaP3761Animal anesthesia
PolysporinPfizerPrevent eye dry
Scanning Electron MicroscopeHitachis-4800SEM observation
ScissorJZY00030Animal surgical incision
Six-well plateThermo140675Culture of UCMSCs
StitchJinhuanF603Close wounds
SutureXy4-0Close wounds
Thermostatic equipmentGrantv-0001-0005Water bath
UCMSCsBai'ao UKK220201Commercially UCMSCs
Vitamin CDiyibioDY40138-25gAggregate inducing
XyleneSCR10023418Dehydrate aggregate

Referanslar

  1. Hall, B. K., Miyake, T. Divide, accumulate, differentiate: cell condensation in skeletal development revisited. The International Journal of Developmental Biology. 39 (6), 881-893 (1995).
  2. Hall, B. K., Miyake, T. All for one and one for all: condensations and the initiation of skeletal development. Bioessays. 22 (2), 138-147 (2000).
  3. Salhotra, A., Shah, H. N., Levi, B., Longaker, M. T. Mechanisms of bone development and repair. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 21 (11), 696-711 (2020).
  4. Mammoto, T., et al. Mechanochemical control of mesenchymal condensation and embryonic tooth organ formation. Developmental Cell. 21 (4), 758-769 (2011).
  5. Khanarian, N. T., Jiang, J., Wan, L. Q., Mow, V. C., Lu, H. H. A hydrogel-mineral composite scaffold for osteochondral interface tissue engineering. Tissue Engineering. Part A. 18 (5-6), 533-545 (2012).
  6. Liu, M., et al. Injectable hydrogels for cartilage and bone tissue engineering. Bone Research. 5, 17014 (2017).
  7. Ai, C., et al. Osteochondral tissue engineering: Perspectives for clinical application and preclinical development. Journal of Orthopaedic Translatation. 30, 93-102 (2021).
  8. Huang, X., et al. Microenvironment influences odontogenic mesenchymal stem cells mediated dental pulp regeneration. Frontiers in Physiology. 12, 656588 (2021).
  9. Li, M., Ma, J., Gao, Y., Yang, L. Cell sheet technology: a promising strategy in regenerative medicine. Cytotherapy. 21 (1), 3-16 (2019).
  10. An, Y., et al. marrow mesenchymal stem cell aggregate: an optimal cell therapy for full-layer cutaneous wound vascularization and regeneration. Scientific Reports. 5, 17036 (2015).
  11. Miura, M., et al. SHED: stem cells from human exfoliated deciduous teeth. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (10), 5807-5812 (2003).
  12. Gronthos, S., et al. Stem cell properties of human dental pulp stem cells. Journal of Dental Research. 81 (8), 531-535 (2002).
  13. Chen, H., et al. Regeneration of pulpo-dentinal-like complex by a group of unique multipotent CD24a(+) stem cells. Science Advances. 6 (15), (2020).
  14. Yang, T., et al. hDPSC-laden GelMA microspheres fabricated using electrostatic microdroplet method for endodontic regeneration. Materials Science & Engineering. C: Materials for Biological Applications. 121, 111850 (2021).
  15. Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments. (51), 2720 (2011).
  16. Nakao, K., et al. The development of a bioengineered organ germ method. Nature Methods. 4 (3), 227-230 (2007).
  17. Hasani-Sadrabadi, M. M., et al. An engineered cell-laden adhesive hydrogel promotes craniofacial bone tissue regeneration in rats. Science Translational Medicine. 12 (534), (2020).
  18. Fan, L., et al. Gravitational sedimentation-based approach for ultra-simple and flexible cell patterning coculture on microfluidic device. Biofabrication. 12 (3), 035005 (2020).
  19. Singh, R., et al. Cell specificity of magnetic cell seeding approach to hydrogel colonization. Journal of Biomedical Materials Research: Part A. 105 (11), 2948-2957 (2017).
  20. Guo, H., et al. Odontogenesis-related developmental microenvironment facilitates deciduous dental pulp stem cell aggregates to revitalize an avulsed tooth. Biomaterials. 279, 121223 (2021).
  21. Xuan, K., et al. Deciduous autologous tooth stem cells regenerate dental pulp after implantation into injured teeth. Science Translational Medicine. 10 (455), (2018).
  22. Sui, B. D., et al. Stem cell-based bone regeneration in diseased microenvironments: Challenges and solutions. Biomaterials. 196, 18-30 (2019).
  23. Shang, F., et al. Human umbilical cord MSCs as new cell sources for promoting periodontal regeneration in inflammatory periodontal defect. Theranostics. 7 (18), 4370-4382 (2017).
  24. Arnold, A. M., Holt, B. D., Daneshmandi, L., Laurencin, C. T., Sydlik, S. A. Phosphate graphene as an intrinsically osteoinductive scaffold for stem cell-driven bone regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (11), 4855-4860 (2019).
  25. Wu, M., et al. SHED aggregate exosomes shuttled miR-26a promote angiogenesis in pulp regeneration via TGF-beta/SMAD2/3 signalling. Cell Proliferation. 54 (7), e13074 (2021).
  26. Li, Z., et al. Apoptotic vesicles activate autophagy in recipient cells to induce angiogenesis and dental pulp regeneration. Molecular Therapy. 30 (10), 3193-3208 (2022).
  27. Vogel, V. Unraveling the mechanobiology of extracellular matrix. Annual Review of Physiology. 80, 353-387 (2018).
  28. Huebsch, N., et al. Harnessing traction-mediated manipulation of the cell/matrix interface to control stem-cell fate. Nature Materials. 9 (6), 518-526 (2010).
  29. Shuai, Y., et al. Melatonin treatment improves mesenchymal stem cells therapy by preserving stemness during long-term in vitro expansion. Theranostics. 6 (11), 1899-1917 (2016).
  30. Sui, B. D., Zhu, B., Hu, C. H., Zhao, P., Jin, Y. Reconstruction of regenerative stem cell niche by cell aggregate engineering. Methods in Molecular Biology. 2002, 87-99 (2019).
  31. Wei, F., et al. Vitamin C treatment promotes mesenchymal stem cell sheet formation and tissue regeneration by elevating telomerase activity. Journal of Cellular Physiology. 227 (9), 3216-3224 (2012).
  32. de Clerck, Y. A., Jones, P. A. The effect of ascorbic acid on the nature and production of collagen and elastin by rat smooth-muscle cells. The Biochemical Journal. 186 (1), 217-225 (1980).
  33. Fujisawa, K., et al. Evaluation of the effects of ascorbic acid on metabolism of human mesenchymal stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 93 (2018).
  34. Wang, T., et al. The histone demethylases Jhdm1a/1b enhance somatic cell reprogramming in a vitamin-C-dependent manner. Cell Stem Cell. 9 (6), 575-587 (2011).
  35. Sun, J., et al. Osthole improves function of periodontitis periodontal ligament stem cells via epigenetic modification in cell sheets engineering. Scientific Reports. 7 (1), 5254 (2017).
  36. Wang, Y. J., et al. Resveratrol enhances the functionality and improves the regeneration of mesenchymal stem cell aggregates. Experimental and Molecular. 50 (6), 1-15 (2018).
  37. Shang, F., et al. The effect of licochalcone A on cell-aggregates ECM secretion and osteogenic differentiation during bone formation in metaphyseal defects in ovariectomized rats. Biomaterials. 35 (9), 2789-2797 (2014).
  38. Dissanayaka, W. L., Zhu, L., Hargreaves, K. M., Jin, L., Zhang, C. Scaffold-free prevascularized microtissue spheroids for pulp regeneration. Journal of Dental Research. 93 (12), 1296-1303 (2014).
  39. Dissanayaka, W. L., Zhu, L., Hargreaves, K. M., Jin, L., Zhang, C. In vitro analysis of scaffold-free prevascularized microtissue spheroids containing human dental pulp cells and endothelial cells. Journal of Endodontics. 41 (5), 663-670 (2015).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Mezenkimal K k H crelerMSC AgregasyonuKendinden Montajl AgregalarRejeneratif T pDi RejenerasyonuKemik RejenerasyonuK k rdak RejenerasyonuDeri RejenerasyonuH cre A lamasH cre D MatriksDoku M hendisli iUmbilikal Kord Mezenkimal K k H creleriKraniyal Kemik Uygulamas

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır