Construção, caracterização e aplicação regenerativa de agregados de células-tronco mesenquimais humanas automontadas

Resumo

Este estudo descreve um método para construir agregados baseado na automontagem de células-tronco mesenquimais humanas e identifica as características morfológicas e histológicas para o tratamento regenerativo de defeitos ósseos cranianos.

Resumo

As células-tronco mesenquimais (CTMs), caracterizadas por sua capacidade de autorrenovação e potencial de diferenciação de múltiplas linhagens, podem ser derivadas de várias fontes e estão emergindo como candidatas promissoras para a medicina regenerativa, especialmente para a regeneração do dente, osso, cartilagem e pele. A abordagem auto-montada de agregação de MSC, que constrói notavelmente aglomerados de células imitando a condensação mesenquimal em desenvolvimento, permite a entrega de células-tronco de alta densidade junto com interações célula-célula preservadas e matriz extracelular (ECM) como nicho de microambiente. Este método demonstrou permitir o enxerto e a sobrevivência de células eficientes, promovendo assim a aplicação otimizada de MSCs exógenas na engenharia de tecidos e protegendo a regeneração clínica de órgãos. Este artigo fornece um protocolo detalhado para a construção e caracterização de agregados auto-montados com base em células-tronco mesenquimais do cordão umbilical (UCMSCs), bem como um exemplo da aplicação regenerativa do osso craniano. A implementação deste procedimento ajudará a orientar o estabelecimento de uma estratégia eficiente de transplante de MSC para engenharia de tecidos e medicina regenerativa.

Introdução

A condensação de células-tronco mesenquimais (CTM) é uma etapa essencial para garantir o crescimento e desenvolvimento normal do corpo no início da organogênese ^1,2, especialmente na formação de ossos, cartilagens, dentes e pele ^1,3,4. Nas últimas décadas, as terapias de engenharia de tecidos usando MSCs pós-natais cultivadas combinadas com scaffolds biodegradáveis fizeram avanços importantes na regeneração osteogênica⁵ e cartilaginosa⁶. No entanto, o uso de scaffolds pode apresentar algumas desvantagens, como rejeição imunológica, bem como baixa afinidade celular e plasticidade⁷. Nesse sentido, investigamos a viabilidade de aplicar um método de cultura de células esferóides para fornecer agregados automontados sem andaimes, imitando o fenômeno de condensação em desenvolvimento, que contém apenas MSCs e a matriz extracelular depositada (ECM) ⁸ . A formação de agregados aumenta a plasticidade aplicativa para corresponder à forma do defeito e evita a implantação e digestão de andaimes por enzimas proteolíticas para colher MSCs para transplante⁹.

Os agregados de CTM têm sido amplamente utilizados para regeneração de ossos, polpa dentária, periodonto e^pele10, entre outros tecidos e órgãos. Muitos tipos diferentes de MSCs podem ser selecionados como candidatos a células-semente, incluindo, mas não se limitando a MSCs de medula óssea (BMMSCs), MSCs de cordão umbilical (UCMSCs), células estromais derivadas do tecido adiposo (ADSCs) e MSCs dentárias (por exemplo, células-tronco mesenquimais da polpa dentária [DPSCs], células-tronco mesenquimais dos dentes decíduos [SHED]¹¹ e células-tronco mesenquimais periodontais [PDLSCs])¹². Muitas tecnologias para aglomerados de células tridimensionais foram desenvolvidas na última década, incluindo agregação assistida e automontada. No entanto, as abordagens de agregação assistida são frequentemente fracas na produção de ECMs e na formação de agregados homogêneos e apertados e, portanto, não são adequadas para mimetizar condições fisiológicas 13,14,15. Além disso, alguns métodos de agregação assistida requerem interações célula-material para formar estruturas estáveis 16,17,18,19, enquanto esse método de agregação auto-montado está geralmente disponível para uma ampla gama de MSCs. Notavelmente, em nossos ensaios clínicos recentes, os agregados de MSC foram usados com sucesso para regenerar o complexo polpa-dentina e o periodonto após a implantação em dentes incisivos humanos lesionados, que alcançaram regeneração tecidual de novo com estrutura e função fisiológicas^20,21.

Este artigo fornece um procedimento completo para a construção e caracterização de agregados MSC, bem como transplante in vivo . Essa abordagem atrairá a atenção dos pesquisadores quando eles pretendem reparar defeitos em tecidos, como dentes, ossos, cartilagens e pele, com base em aplicações de células-tronco. Este método é simples, conveniente e totalmente composto por células e ECM sem scaffolds adicionais, que podem ser cultivados por um longo tempo para obter agregados densos e estáveis²². Enquanto isso, os agregados cultivados dessa maneira são ricos em MEC, que mimetiza o nicho em desenvolvimento para essas células de alta densidade e, portanto, promove a regeneração tecidual²³. O processo de construção pode ser dividido em duas etapas: preparação e cultura de células, e formação e colheita auto-montadas de agregados celulares. A caracterização dos agregados inclui a identificação morfológica via microscópio óptico invertido e microscópio eletrônico de varredura (MEV), e análise histológica via hematoxilina e eosina (HE) e coloração de Masson. Os agregados formados foram demonstrados para implantação regenerativa para reparar o defeito ósseo craniano. A implementação deste procedimento ajudará a orientar o estabelecimento de uma estratégia eficiente de transplante de MSC para engenharia de tecidos e medicina regenerativa.

Protocolo

NOTA: Todos os procedimentos em animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Quarta Universidade Médica Militar e realizados de acordo com o Guia dos Institutos Nacionais de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. UCMSCs humanos criopreservados que foram obtidos de uma fonte comercial foram usados para o presente estudo (ver Tabela de Materiais). O uso de células humanas foi aprovado pelo Comitê de Ética da Quarta Universidade Médica Militar. As UCMSCs foram tomadas como exemplo para descrever o procedimento. O defeito craniano foi tomado como exemplo para mostrar a necessidade de reparo para descrever o procedimento de implantação. Todos os experimentos foram repetidos três vezes.

1. Construção de agregados UCMSC

1. Preparação e cultura de UCMSCs
   1. Adicione 10 mL de solução salina tamponada com fosfato pré-aquecido (PBS) em um novo tubo centrífugo de 15 mL em um gabinete de biossegurança estéril.
   2. Remova o tubo de congelamento contendo UCMSCs congelados do nitrogênio líquido e coloque-o rapidamente em um banho-maria a 37 °C. Agite o tubo suavemente para facilitar o descongelamento celular rápido e completo.
      CUIDADO: Todo o procedimento deve ser concluído em 1 min, pois o dimetilsulfóxido (DMSO) na solução de congelamento pode causar citotoxicidade.
   3. Suspenda ligeiramente as células no tubo de congelamento e transfira todo o conteúdo para o tubo de centrífuga contendo 10 mL de PBS (etapa 1.1.1). Centrifugue a amostra a 100 × g por 5 min. Descarte o sobrenadante e lave as células com 10 mL de PBS.
   4. Centrifugue a amostra a 100 × g por 5 min. Descarte o sobrenadante e ressuspenda suavemente as células com meio essencial alfa-mínimo completo (α-MEM) contendo 10% de soro fetal bovino (FBS), 1% de penicilina-estreptomicina e 584 mg / L de glutamina.
   5. Semear as células ressuspensas em placas de cultura de 10 cm (geralmente uma a duas placas para um tubo, dependendo da quantidade total de células após a centrifugação, a uma densidade de 5 × 10⁶ células por placa Adicione o meio α-MEM completo na loiça até um volume total de 10 ml.
   6. Agite suavemente os pratos para distribuir as células. Incubar os pratos a 37 °C com 5% de CO₂ em uma câmara umidificada. Após a incubação durante a noite, descarte o meio sobrenadante e adicione 5 mL de PBS 1-2x para remover as células não aderentes. Adicione 10 ml de meio α-MEM completo fresco. Troque os meios de cultura a cada 2 dias.
   7. Para a passagem celular, quando as células atingirem 80%-90% de confluência, descarte o sobrenadante e lave as células com 5 mL de PBS para remover completamente o meio. Incube as células em 2 mL de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) a 0,25% de tripsina-1 mM a 37 ° C por 2 min.
   8. Quando as células se tornarem redondas com junções intercelulares quebradas sob um microscópio, separe as células dos pratos sem muita interrupção da estrutura celular. Neutralize a tripsina adicionando 4 mL de meio α-MEM completo.
   9. Colete as células dos pratos repetidamente e com cuidado, pipetando em um novo tubo de centrífuga de 15 mL. Centrifugue a amostra a 100 × g por 5 min. Descarte o sobrenadante, ressuspenda as células com meio α-MEM completo e semeie-as em placas de cultura frescas ou placas de poço. Troque os meios de cultura a cada 2 dias.
      NOTA: De acordo com o tamanho da área do defeito, um defeito de^{25 mm 3} requer o uso de um poço de células de placa de 6 poços cultivadas para formar agregados.
2. Formação e colheita de agregados
   1. Prepare o meio indutor de agregados celulares adicionando 50 μg / mL de vitamina C em α-MEM com 10% de FBS, 1% de penicilina-estreptomicina e 584 mg / L de glutamina.
      CUIDADO: A exposição direta à luz deve ser evitada ao usar vitamina C, pois a vitamina C oxida quando exposta à luz e se torna ineficaz.
   2. Quando as células na etapa 1.1.12 atingirem 95% de confluência (Figura Suplementar S1), mude o meio para meio indutor de agregado celular; Troque o meio indutor de agregados celulares frescos a cada 2 dias.
   3. Após 7 a 10 dias de indução (a duração do tempo de indução depende dos tipos de células-tronco e geralmente é de ~ 7 dias para a borda das UCMSCs), procure agregados moldados ao microscópio, com bordas grossas separadas do fundo do prato.
   4. Descarte o meio de cultura e lave suavemente as células 2x com PBS. Empurre suavemente os agregados da borda para o meio usando uma pequena pinça estéril, dobrando os agregados.
   5. Em algumas ocasiões, as UCMSCs podem se enrolar espontaneamente em direção ao centro para formar uma condensação sólida. Esta estrutura é equivalente ao agregado obtido no passo 1.2.4.

2. Identificação morfológica dos agregados

1. Observação geral e microscópica
   1. Observe que os agregados são densos e integrados e não são facilmente danificados por forças mecânicas, como puxar durante o descolamento e o transplante.
   2. Sob um microscópio, procure uma estrutura semelhante a uma membrana de uma certa espessura com padrão tecido.
2. Coloração de células vivas/mortas
   1. Semeie as células em uma placa de 6 poços a uma densidade de 1 × 10⁶ células por poço.
   2. Preparar 2 μM de calceína AM e 4 μM de EthD-1 e utilizar PBS.
   3. Adicione 0,3% de tritão às células por 5 min, lave com PBS três vezes para induzir as células à morte, como controle da coloração.
   4. Lave as células, agregados e células indutoras de morte com PBS duas vezes.
   5. Adicione 100 μL de PBS e 100 μL de solução de coloração preparada na etapa 2.2.2 a cada poço.
   6. Incubar a amostra durante 30 min à RT. Lavar a amostra com PBS duas vezes.
   7. Adicione 200 μL de 10 μg/mL de Hoechst a cada poço e incube a amostra por 5 min em RT. Wah a amostra com PBS duas vezes.
   8. Observe sob um microscópio de fluorescência.
3. Observação de MEV
   1. Semear e induzir a célula os agregados obtidos nas etapas 1.2.4 ou 1.2.5. Lave as células com PBS após a formação dos agregados na etapa 1.2.4. ou 1.2.5.
   2. Fixe as células usando glutaraldeído por pelo menos 4 h.
   3. Lave as amostras com PBS e desidrate através de uma concentração gradiente de etanol de 30%, 50%, 70%, 80%, 90% a 100%, cada uma por 5 min. Trate 2x com etanol anidro.
   4. Mergulhe os agregados em 3 mL de hexametildisilazana por 30 min. Aspirar todo o líquido e secar naturalmente as amostras completamente.
      CUIDADO: Todo o processo precisa ser realizado em uma capela porque o hexametildisilazano é volátil e altamente tóxico.
   5. Cole as amostras secas na mesa de amostras com fita de carbono dupla face e cubra a superfície com metal. Armazene a amostra em temperatura ambiente (RT) por vários dias.
   6. Observe sob um SEM.
      1. Recoloque a amostra dentro da máquina. Ajuste a tensão da máquina para 5 k e a distância focal para ~12 mm. Ajuste a barra de foco até que uma imagem nítida apareça.
      2. Capture as imagens com baixa ampliação. Ajuste a ampliação e refoque para obter uma imagem com maior ampliação.
         CUIDADO: A superfície dos agregados não pode ser tocada antes da observação para evitar a destruição da morfologia da superfície.

3. Análise histológica de agregados

1. Fixação e seccionamento das amostras
   1. Fixar os agregados obtidos nas etapas 1.2.4 ou 1.2.5 com paraformaldeído a 4 % a 4 °C durante, pelo menos, 24 h. Após a fixação, lave com PBS e coloque a amostra em de embutir durante a noite para enxaguar com água corrente.
   2. Desidrate as amostras usando máquinas automáticas de desidratação através de etanol gradiente, xileno e parafina, seguindo as instruções do fabricante. Todo o processo é o seguinte: 85% de etanol por 2 h em RT, 95% de etanol por 2 h em RT, 95% de etanol por 2 h em RT, 100% de etanol por 2 h em RT, 100% de etanol por 1,5 h em RT, xileno por 45 min em RT, xileno por 45 min em RT, parafina por 30 min em RT, parafina por 1,5 h em RT e, finalmente, parafina por 2 h a 60 °C.
   3. Incorpore as amostras com parafina. Preparar secções de cerca de 5 μm de espessura, aderir às lâminas catiónicas e secar as lâminas durante 2 h a 45 °C.
   4. Desparafine sequencialmente através de xileno por 15 min, duas vezes e etanol a 100%, 90%, 80% e 70% (cada um por 5 min).
   5. Enxágue lentamente as lâminas 3x com água corrente por 5 min.
2. Coloração HE
   1. Manchar com hematoxilina por 3-5 min, enxaguar com água e remover cuidadosamente o excesso de líquido ao redor do tecido.
   2. Fracionar com etanol contendo ácido clorídrico a 1% por 3-5 s e enxaguar com água corrente, durante a qual a cor fica um pouco mais clara e azulada. Remova o excesso de água ao redor do tecido.
   3. Manchar com eosina por 1 min, enxaguar com água corrente e remover o excesso de líquido ao redor do tecido.
   4. Desidrate com etanol 70%, 80%, 90% e 100% por 10 s cada, xileno por 15 min, duas vezes, e seque naturalmente na capela antes de selar a chapa.
   5. Adicione gotas de resina neutra e sele as lâminas com lamínulas. Observe sob um microscópio de luz.
3. Coloração tricrômica de Masson
   1. Manchar com hematoxilina de ferro de Weigert por 5 min, enxaguar com água e enxugar.
   2. Fracionar com etanol contendo ácido clorídrico a 1% por 3-5 s e enxaguar com água corrente, durante a qual a cor fica um pouco mais clara e azulada. Seque a superfície.
   3. Manchar com solução de magenta ácido vermelho Lixin por 5-10 min e enxaguar rapidamente com água destilada.
   4. Trate com solução aquosa de ácido fosfomolíbdico por 3-5 min.
   5. Pinte novamente diretamente com solução de azul de anilina por 5 min sem lavar com água.
   6. Trate com ácido acético glacial a 1% por 1 min.
   7. Desidrate com etanol 70%, 80%, 90% e 100% por 10 s cada, xileno por 15 min, duas vezes, e seque naturalmente na capela antes de selar a chapa.
   8. Adicione gotas de resina neutra e sele as lâminas com lamínulas. Observe sob um microscópio de luz.

4. Implantação

1. Anestesiar o rato nu com uma injeção intraperitoneal de 50 mg/kg de pentobarbital sódico.
   NOTA: Confirme se os camundongos estão devidamente anestesiados com base na ausência de reflexo da córnea e reação dos membros quando a almofada do pé é comprimida. Aplique pomada para os olhos para evitar o ressecamento.
2. Corte uma incisão transversal (~ 3-4 cm) na pele atrás das orelhas do camundongo nu com uma tesoura pequena estéril após a desinfecção com iodóforo.
3. Puxe a pele para a frente para expor o crânio. Desenhe levemente as bordas da área de defeito planejada com uma lâmina 11# e remova o fragmento ósseo. A área do defeito é uma área circular de aproximadamente 4 mm de diâmetro. Use solução salina para lavar a ferida e fornecer hemostasia adequada.
4. Mergulhar os agregados obtidos nas etapas 1.2.5 ou 1.2.6 com gaze estéril para absorver a umidade da superfície antes da implantação. Coloque os agregados na área e pressurize levemente para preencher o defeito.
5. Substitua a pele após puxar para garantir que o implante esteja fixado. Feche a incisão com pontos angulares 1/2, 4 × 10 e suturas 4-0.
6. Após a cirurgia, coloque os animais na manta de reaquecimento até que estejam ativos e depois devolva-os à gaiola.
   NOTA: Os animais não devem ser deixados sozinhos até que recuperem a consciência suficiente para manter a decúbito esternal. Os animais que foram submetidos a cirurgia não são devolvidos à companhia de outros animais até que estejam totalmente recuperados.

Resultados

Os agregados podem ser construídos com sucesso a partir de UCMSCs de acordo com o fluxo de trabalho experimental (Figura 1). A qualidade dos agregados deve ser avaliada antes do uso, por meio de observação morfológica e análise histológica. A estrutura lamelar formada deve ser completa e densa, com as células entrelaçadas para formar um padrão tecido por observação microscópica (Figura 2A). A ondulação da ...

Discussão

Com os avanços da biotecnologia de engenharia de tecidos, as estratégias para construir uma estrutura implantável com alta plasticidade e contendo células sobreviventes a longo prazo que possam alcançar a regeneração ideal têm sido o foco de muitos cientistas. Há uma variedade de métodos atuais de implantação de CTMs, como métodos somente celulares, scaffolds complementados com citocinas ^6,24 ou a combinação de cé...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA (1x)	Sigma	T4049	Cell passage
Automatic Dehydration Machine	LEICA	ASP200s	Dehydrate aggregate
Centrifuge	Eppendorf	5418R	Centrifugation
Centrifuge tube	Thermo Nunc	339650	Centrifugation
Culture dish	Thermo	150466	Culture of UCMSCs
Ethanol	SCR	10009218	Dehydrate aggregate
Fatal bovine serum	Sijiqing	11011-8611	Culture of UCMSCs
Forcep	JZ	JD1080	Harvest aggregate
Glutaraldehyde	Proandy	10217-1	Fixation of aggregate
Hematoxylin and Eosin Staining Kit	beyotime	C0105S	HE staining
Hexamethyldisilazane	SCR	80068416	Dry aggregate surface
Hoechst33342	Sigma	14533	Cell nuclei stain
L-glutamine	Sigma	G5792	Culture of UCMSCs
Live/dead Viability/Cytotoxicity Kit	Invitrogen	L3224	Live/dead cell stain
Masson's Staining Kit	ZHC	CD069	Masson Staining
Minimum Essential Medium Alpha basic (1x)	Gibco	C12571500BT	Culture of UCMSCs
Paraffin	Leica	39601006	Tissue embedding
Paraformaldehyde	Saint-Bio	D16013	Fixation of aggregate
PBS (1x)	Meilunbio	MA0015	Resuspend and purify UCMSCs
Penicillin/Streptomycin	Procell Life Science	PB180120	Culture of UCMSCs
Pentobarbital sodium	Sigma	P3761	Animal anesthesia
Polysporin	Pfizer		Prevent eye dry
Scanning Electron Microscope	Hitachi	s-4800	SEM observation
Scissor	JZ	Y00030	Animal surgical incision
Six-well plate	Thermo	140675	Culture of UCMSCs
Stitch	Jinhuan	F603	Close wounds
Suture	Xy	4-0	Close wounds
Thermostatic equipment	Grant	v-0001-0005	Water bath
UCMSCs	Bai'ao	UKK220201	Commercially UCMSCs
Vitamin C	Diyibio	DY40138-25g	Aggregate inducing
Xylene	SCR	10023418	Dehydrate aggregate