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요약

본 연구는 인간 중간엽 줄기세포의 자가조립을 기반으로 응집체를 구성하는 방법을 설명하고, 두개골 결손의 재생치료를 위한 형태학적, 조직학적 특성을 규명한다.

초록

중간엽줄기세포(MSC)는 자기재생 능력과 다계통 분화 가능성을 특징으로 하며 다양한 출처에서 유래할 수 있으며 특히 치아, 뼈, 연골 및 피부의 재생을 위한 재생 의학의 유망한 후보로 부상하고 있습니다. 특히 발달 중인 중간엽 축합을 모방한 세포 클러스터를 구축하는 MSC 응집의 자체 조립 접근 방식은 미세환경 틈새로서 보존된 세포-세포 상호 작용 및 세포외 기질(ECM)과 함께 고밀도 줄기세포 전달을 가능하게 합니다. 이 방법은 효율적인 세포 생착 및 생존을 가능하게 하여 조직 공학에서 외인성 MSC의 최적화된 적용을 촉진하고 임상 장기 재생을 보호하는 것으로 나타났습니다. 이 논문은 탯줄 중간엽 줄기세포(UCMSC)를 기반으로 하는 자가 조립 응집체의 구성 및 특성화를 위한 자세한 프로토콜과 두개골 재생 응용 사례의 예를 제공합니다. 이 절차의 구현은 조직 공학 및 재생 의학을 위한 효율적인 MSC 이식 전략을 수립하는 데 도움이 될 것입니다.

서문

중간엽 줄기세포(MSC) 응축은 초기 기관 형성 1,2, 특히 뼈, 연골, 치아 및 피부 형성에서 신체의 정상적인 성장과 발달을 보장하는 데 필수적인 단계입니다 1,3,4. 지난 수십 년 동안 생분해성 골격과 결합된 배양된 산후 MSC를 사용하는 조직 공학 요법은 골형성5 및 연골 재생6에서 중요한 진전을 이루었습니다. 그러나 골격을 사용하면 면역 거부 반응, 낮은 세포 친화도 및 가소성과 같은 몇 가지 단점이 있을 수 있습니다7. 이와 관련하여, MSC와 증착된 세포외 기질(ECM)8만 포함하는 전개 현상을 모방한 스캐폴드가 없는 자체 조립 응집체를 제공하기 위해 스페로이드 세포 배양 방법을 적용하는 타당성을 조사했습니다. 응집체의 형성은 결함 모양과 일치하도록 적용 가소성을 증가시키고 이식을 위한 MSC를 수확하기 위해 단백질 분해 효소에 의한 골격 이식 및 소화를 방지합니다9.

MSC 응집체는 다른 조직 및 기관 중에서도 뼈, 치아 치수, 치주 및 피부10의 재생에 널리 사용되어 왔습니다. 골수 MSC(BMMSC), 탯줄 MSC(UCMSC), 지방 조직 유래 기질 세포(ADSC) 및 치과 MSC(예: 치아 치수 중간엽 줄기세포[DPSC], 낙엽 치아의 중간엽 줄기세포[SHED]11 및 치주 중간엽 줄기세포[PDLSC])를 포함하되 이에 국한되지 않는 다양한 유형의 MSC를 종자 세포의 후보로 선택할 수 있습니다12. 지난 10년 동안 3차원 세포 클러스터를 위한 많은 기술이 개발되었으며, 여기에는 보조 및 자체 조립 응집이 포함됩니다. 그러나 보조 응집체 접근법은 ECM을 생성하고 균질하고 단단한 응집체를 형성하는 데 약한 경우가 많기 때문에 생리학적 조건을 모방하는 데 적합하지 않습니다 13,14,15. 더욱이, 일부 보조 응집 방법은 안정적인 구조를 형성하기 위해 세포-물질 상호 작용이 필요한 반면, 16,17,18,19 이 자체 조립 응집 방법은 일반적으로 광범위한 MSC에 사용할 수 있습니다.특히, 최근 임상 시험에서 MSC 응집체는 손상된 인간 앞니 치아에 이식한 후 치수-상아질 복합체와 치주를 재생하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 생리적 구조와 기능을 갖춘 새로운 조직 재생을 달성했습니다20,21.

이 백서는 MSC 응집체 구성 및 특성화와 in vivo 이식에 대한 철저한 절차를 제공합니다. 이 접근 방식은 줄기 세포 응용 프로그램을 기반으로 치아, 뼈, 연골 및 피부와 같은 조직의 결함을 복구하는 것을 목표로 할 때 연구자의 관심을 끌 것입니다. 이 방법은 간단하고 편리하며 추가 골격 없이 세포와 ECM으로 완전히 구성되며, 장기간 배양하여 조밀하고 안정적인 응집체를 얻을 수 있습니다22. 한편, 이러한 방식으로 배양된 응집체는 ECM이 풍부하며, 이는 이러한 고밀도 세포의 발달 틈새를 모방하여 조직 재생을 촉진합니다23. 건설 과정은 세포 준비 및 배양, 세포 응집체의 자체 조립 형성 및 수확의 두 단계로 나눌 수 있습니다. 응집체의 특성화에는 도립 광학 현미경 및 주사 전자 현미경(SEM)을 통한 형태학적 식별, 헤마톡실린 및 에오신(HE) 및 Masson의 염색을 통한 조직학적 분석이 포함됩니다. 형성된 응집체는 두개골 결손을 복구하기 위한 재생 이식을 위해 입증되었습니다. 이 절차의 구현은 조직 공학 및 재생 의학을 위한 효율적인 MSC 이식 전략을 수립하는 데 도움이 될 것입니다.

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프로토콜

참고: 모든 동물 절차는 제4 군사 의과 대학의 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았으며 실험실 동물의 관리 및 사용을 위한 국립 보건원 가이드에 따라 수행되었습니다. 상업적 공급원에서 얻은 냉동 보존된 인간 UCMSC가 본 연구에 사용되었습니다( 재료 표 참조). 인간 세포의 사용은 제 4 군사 의과 대학의 윤리위원회에 의해 승인되었습니다. UCMSC는 절차를 설명하기 위한 예로 사용되었습니다. 두개골 결손은 이식 절차를 설명하기 위해 수리의 필요성을 보여주는 예로 사용되었습니다. 모든 실험은 세 번 반복되었습니다.

1. UCMSC 골재의 건설

  1. UCMSC의 준비 및 배양
    1. 10mL의 예열된 인산염 완충 식염수(PBS)를 멸균 생물 안전 작업대의 새로운 15mL 원심 튜브에 추가합니다.
    2. 액체 질소에서 얼어붙은 UCMSC가 들어 있는 동결 튜브를 제거하고 37°C 수조에 빠르게 넣습니다. 세포가 빠르고 철저하게 해동될 수 있도록 튜브를 부드럽게 흔듭니다.
      주의 : 동결 용액의 디메틸 설폭사이드(DMSO)는 세포 독성을 유발할 수 있으므로 전체 절차는 1분 이내에 완료되어야 합니다.
    3. 동결 튜브에 세포를 약간 현탁시키고 모든 내용물을 PBS 10mL가 들어 있는 원심분리 튜브로 옮깁니다(단계 1.1.1). 100 × g 에서 5분 동안 샘플을 원심분리합니다. 상등액을 버리고 PBS 10mL로 세포를 세척합니다.
    4. 100 × g 에서 5분 동안 샘플을 원심분리합니다. 상등액을 버리고 10% 소 태아 혈청(FBS), 1% 페니실린-스트렙토마이신 및 584mg/L 글루타민을 포함하는 완전한 알파 최소 필수 배지(α-MEM)로 세포를 부드럽게 재현탁합니다.
    5. 재현탁 세포를 10cm 배양 접시(원심분리 후 세포의 총량에 따라 접시당 5 × 106 세포의 밀도로 하나의 튜브에 종종 1-2개의 접시)에 파종합니다. 접시에 완전한 α-MEM 배지를 총 10mL의 부피에 추가합니다.
    6. 접시를 부드럽게 흔들어 세포를 분산시킵니다. 가습 챔버에서 37 ° C에서 5 % CO2 로 접시를 배양하십시오. 하룻밤 배양 후 상등액 배지를 버리고 PBS 1-2x 5mL를 첨가하여 비부착성 세포를 제거합니다. 10mL의 새로운 완전 α-MEM 배지를 추가합니다. 2일마다 배양 배지를 교체하십시오.
    7. 세포 계대 분석의 경우 세포가 80%-90% 합류점에 도달하면 상층액을 버리고 PBS 5mL로 세포를 세척하여 배지를 철저히 제거합니다. 2mL의 0.25% 트립신-1mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)을 37°C에서 2분 동안 배양합니다.
    8. 현미경으로 세포가 세포간 접합부가 끊어져 둥글게 되면 세포 구조를 너무 많이 파괴하지 않고 접시에서 세포를 분리하십시오. 완전한 α-MEM 배지 4mL를 첨가하여 트립신을 중화합니다.
    9. 새 15mL 원심분리 튜브에 피펫팅하여 접시에서 세포를 반복적이고 부드럽게 수집합니다. 샘플을 100 × g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 버리고 완전한 α-MEM 배지로 세포를 재현탁시킨 다음 신선한 배양 접시 또는 웰 플레이트에 파종합니다. 2일마다 배양 배지를 교체하십시오.
      참고: 결함 영역의 크기에 따라 25mm3 결함은 응집체를 형성하기 위해 배양된 6웰 플레이트 셀의 웰을 사용해야 합니다.
  2. 응집체의 형성 및 수확
    1. 10% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신 및 584mg/L 글루타민과 함께 α-MEM에 50μg/mL 비타민 C를 첨가하여 세포 응집체 유도 배지를 준비합니다.
      주의 : 비타민 C는 빛에 노출되면 산화되어 효과가 없으므로, 비타민 C를 사용할 때 직사광선 노출은 피해야 합니다.
    2. 1.1.12 단계의 세포가 95 % confluence에 도달하면(보충 그림 S1) 배지를 세포 응집체 유도 배지로 변경합니다. 2일마다 신선한 세포 응집체 유도 배지를 교체하십시오.
    3. 유도 후 7-10일 후(유도 시간은 줄기 세포 유형에 따라 다르며 UCMSC의 가장자리의 경우 종종 ~7일) 현미경으로 접시 바닥에서 두꺼운 가장자리가 분리된 모양의 응집체를 찾습니다.
    4. 배양 배지를 버리고 PBS로 세포를 2x 부드럽게 씻습니다. 작은 멸균 집게를 사용하여 응집체를 가장자리에서 가운데로 부드럽게 밀어 응집체를 접습니다.
    5. 경우에 따라 UCMSC는 중앙을 향해 자발적으로 말려 단단한 응축을 형성할 수 있습니다. 이 구조는 1.2.4단계에서 얻은 집계와 동일합니다.

2. 응집체의 형태학적 식별

  1. 일반 및 현미경 관찰
    1. 응집체가 조밀하고 통합되어 있으며 분리 및 이식 중 당기는 것과 같은 기계적 힘에 의해 쉽게 손상되지 않는지 관찰하십시오.
    2. 현미경으로 짠 패턴이 있는 특정 두께의 멤브레인과 같은 구조를 찾으십시오.
  2. 살아있는/죽은 세포 염색
    1. 6-well 플레이트에 well당 1 × 106 cells의 밀도로 세포를 파종합니다.
    2. PBS를 사용하여 2μM calcein AM 및 4μM EthD-1 작업 용액을 준비합니다.
    3. 5 분 동안 세포에 0.3% 트리톤을 추가하고, 염색을 위한 통제물로 세포를 사멸로 유도하기 위하여 PBS로 3 번 세척하십시오.
    4. 세포, 응집체 및 사멸 유도 세포를 PBS로 두 번 세척합니다.
    5. 2.2.2단계에서 PBS 100μL와 준비된 염색 용액 100μL를 각 웰에 추가합니다.
    6. RT에서 30분 동안 샘플을 배양합니다. PBS로 샘플을 두 번 세척합니다.
    7. 각 웰에 200μL의 10μg/mL Hoechst를 추가하고 RT에서 5분 동안 샘플을 배양합니다. PBS로 샘플을 두 번 배양합니다.
    8. 형광 현미경으로 관찰하십시오.
  3. SEM 관찰
    1. 1.2.4 또는 1.2.5 단계에서 얻은 응집체를 시드하고 세포를 유도합니다. 1.2.4단계에서 응집체가 형성된 후 PBS로 세포를 세척합니다. 또는 1.2.5.
    2. 글루타르알데히드를 사용하여 최소 4시간 동안 세포를 고정합니다.
    3. PBS로 샘플을 세척한 다음 5분 동안 각각 30%, 50%, 70%, 80%, 90%에서 100%까지의 에탄올 구배 농도를 통해 탈수합니다. 무수 에탄올로 2x를 처리합니다.
    4. 응집체를 3mL의 헥사메틸디실라잔에 30분 동안 담급니다. 모든 유체를 흡입하고 샘플을 자연 건조시킵니다.
      주의 : 헥사메틸디실라잔은 휘발성이고 독성이 높기 때문에 전체 공정은 흄 후드에서 수행해야 합니다.
    5. 건조된 샘플을 양면 탄소 테이프로 샘플 테이블에 붙이고 표면을 금속으로 코팅합니다. 샘플을 실온(RT)에서 며칠 동안 보관하십시오.
    6. SEM에서 관찰합니다.
      1. 기계 내부의 샘플을 교체하십시오. 기계 전압을 5k로, 초점 거리를 ~12mm로 조정합니다. 선명한 사진이 나타날 때까지 초점 막대를 조정합니다.
      2. 저배율로 이미지를 캡처합니다. 배율을 조정하고 초점을 다시 맞추면 더 높은 배율 이미지를 얻을 수 있습니다.
        주의: 표면 형태의 파괴를 방지하기 위해 관찰 전에 응집체의 표면을 만질 수 없습니다.

3. 응집체의 조직학적 분석

  1. 샘플의 고정 및 절편
    1. 1.2.4 또는 1.2.5 단계에서 얻은 응집체를 4 ° C에서 4 ° C에서 최소 24 시간 동안 고정합니다. 고정 후 PBS로 세척하고 샘플을 임베딩 카세트에 밤새 넣어 흐르는 물로 헹굽니다.
    2. 자동 탈수 기계를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 그라디언트 에탄올, 자일렌 및 파라핀을 통해 샘플을 탈수합니다. 전체 과정은 다음과 같습니다 : RT에서 2 시간 동안 85 % 에탄올, RT에서 2 시간 동안 95 % 에탄올, RT에서 2 시간 동안 95 % 에탄올, RT에서 2 시간 동안 100 % 에탄올, RT에서 1.5 시간 동안 100 % 에탄올, RT에서 45 분 동안 크실렌, RT에서 45 분 동안 자일렌, RT에서 30 분 동안 파라핀, 파라핀은 RT에서 1.5 시간 동안 지속되고, 마지막으로 파라핀은 60 ° C에서 2 시간 동안 사용됩니다.
    3. 파라핀으로 샘플을 삽입합니다. 약 5μm 두께의 절편을 준비하여 양이온 슬라이드에 부착하고 45°C에서 2시간 동안 슬라이드를 건조합니다.
    4. 크실렌을 통해 15분, 2회, 100%, 90%, 80%, 70% 에탄올(각각 5분) 순차적으로 왁스를 제거합니다.
    5. 흐르는 물에 슬라이드를 3분 동안 5회 천천히 헹굽니다.
  2. HE 염색
    1. 헤마톡실린으로 3-5분 동안 염색하고 물로 헹구고 조직 주변의 과도한 액체를 조심스럽게 제거합니다.
    2. 1 % 염산을 함유 한 에탄올로 3-5 초 동안 분별하고 흐르는 물로 헹구면 색이 약간 연하고 파랗게 변합니다. 조직 주변의 과도한 수분을 제거하십시오.
    3. 에오신 1분 동안 염색한 후 흐르는 물로 헹구고 조직 주위의 과도한 체액을 제거합니다.
    4. 70%, 80%, 90%, 100% 에탄올로 각각 10초, 크실렌으로 15분 동안 두 번 탈수하고 시트를 밀봉하기 전에 흄 후드에서 자연 건조합니다.
    5. 중성 수지 방울을 추가하고 커버 슬립으로 슬라이드를 밀봉합니다. 광학 현미경으로 관찰하십시오.
  3. Masson의 트리크롬 염색
    1. Weigert의 철분 헤마톡실린으로 5분 동안 염색하고 물로 헹구고 말리십시오.
    2. 1 % 염산을 함유 한 에탄올로 3-5 초 동안 분별하고 흐르는 물로 헹구면 색이 약간 연하고 파랗게 변합니다. 표면을 닦으십시오.
    3. Lixin 적색 산성 마젠타 용액으로 5-10 분 동안 염색하고 증류수로 빠르게 헹굽니다.
    4. 포스포몰리브딕산 수용액으로 3-5분 동안 처리합니다.
    5. 물로 씻지 않고 아닐린 블루 용액으로 5분 동안 직접 다시 염색합니다.
    6. 1% 빙초산으로 1분 동안 처리합니다.
    7. 70%, 80%, 90%, 100% 에탄올로 각각 10초, 크실렌으로 15분 동안 두 번 탈수하고 시트를 밀봉하기 전에 흄 후드에서 자연 건조합니다.
    8. 중성 수지 방울을 추가하고 커버 슬립으로 슬라이드를 밀봉합니다. 광학 현미경으로 관찰하십시오.

4. 이식

  1. 50 mg/kg 펜토바르비탈 나트륨의 복강내 주사로 누드 마우스를 마취합니다.
    참고: 발판을 꼬집었을 때 각막 반사 및 사지 반응이 없는 경우 마우스가 제대로 마취되었는지 확인합니다. 건조를 방지하기 위해 안구를 바르십시오.
  2. 요오드로 소독한 후 멸균된 작은 가위로 누드 마우스의 귀 뒤쪽 피부의 가로 절개 (~ 3-4cm)를 잘라냅니다.
  3. 피부를 앞으로 당겨 두개골을 노출시킵니다. 11# 블레이드로 계획된 결함 부위의 가장자리를 가볍게 그리고 뼈 조각을 제거합니다. 결함 영역은 직경이 약 4mm인 원형 영역입니다. 식염수를 사용하여 상처를 씻어내고 적절한 지혈을 제공합니다.
  4. 1.2.5 또는 1.2.6 단계에서 얻은 응집체를 멸균 거즈로 담그어 이식 전에 표면 수분을 흡수합니다. 골재를 해당 부위에 놓고 약간 압력을 가하여 결함을 채웁니다.
  5. 당긴 후 피부를 교체하여 임플란트가 고정되었는지 확인하십시오. 절개 부위를 1/2, 4 × 10 각도 스티치와 4-0 봉합사로 봉합합니다.
  6. 수술 후, 동물들이 활동할 때까지 다시 데워워주는 담요 위에 동물을 눕힌 다음 우리로 되돌려 놓습니다.
    참고: 동물이 흉골 누운 자세를 유지할 수 있을 만큼 충분한 의식을 회복할 때까지 방치해서는 안 됩니다. 수술을 받은 동물은 완전히 회복될 때까지 다른 동물과 함께 돌려보내지 않습니다.

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결과

실험 워크플로우에 따라 UCMSC에서 응집체를 성공적으로 구성할 수 있습니다(그림 1). 응집체의 품질은 형태학적 관찰 및 조직학적 분석을 통해 사용하기 전에 평가해야 합니다. 형성된 얇은 판 구조는 완전하고 조밀해야 하며, 세포가 서로 얽혀 현미경 관찰에 의해 직조된 패턴을 형성해야 합니다(그림 2A). 엣지 컬링은 ?...

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토론

조직 공학 생명 공학의 발전으로 가소성이 높고 최적의 재생을 달성할 수 있는 장기 생존 세포를 포함하는 이식 가능한 구조를 구성하는 전략이 많은 과학자들의 초점이 되었습니다. 현재 MSC의 이식 방법은 세포 단독 방법, 사이토카인으로 보완된 골격 6,24 또는 줄기세포와 골격의 조합5과 같은 다양한 방법이...

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공개

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 말

이 연구는 중국 국가자연과학재단(81930025, 82100969, 82071075)과 중국 국가 핵심 연구 개발 프로그램(2022YFA1104400 및 2021YFA1100600)의 보조금으로 지원되었습니다. 우리는 기초 의학을 위한 국립 실험 교육 시범 센터(AMFU)의 도움에 감사드립니다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% Trypsin-EDTA (1x)SigmaT4049Cell passage
Automatic Dehydration MachineLEICAASP200sDehydrate aggregate
CentrifugeEppendorf5418RCentrifugation
Centrifuge tubeThermo Nunc339650Centrifugation
Culture dishThermo150466Culture of UCMSCs
EthanolSCR10009218Dehydrate aggregate
Fatal bovine serumSijiqing11011-8611Culture of UCMSCs
ForcepJZJD1080Harvest aggregate
GlutaraldehydeProandy10217-1Fixation of aggregate
Hematoxylin and Eosin Staining KitbeyotimeC0105SHE staining
HexamethyldisilazaneSCR80068416Dry aggregate surface
Hoechst33342Sigma14533Cell nuclei stain
L-glutamineSigmaG5792Culture of UCMSCs
Live/dead Viability/Cytotoxicity Kit InvitrogenL3224Live/dead cell stain
Masson's Staining KitZHCCD069Masson Staining
Minimum Essential Medium Alpha basic (1x)GibcoC12571500BTCulture of UCMSCs
ParaffinLeica39601006Tissue embedding
ParaformaldehydeSaint-BioD16013Fixation of aggregate
PBS (1x)MeilunbioMA0015Resuspend and purify UCMSCs
Penicillin/StreptomycinProcell Life SciencePB180120Culture of UCMSCs
Pentobarbital sodiumSigmaP3761Animal anesthesia
PolysporinPfizerPrevent eye dry
Scanning Electron MicroscopeHitachis-4800SEM observation
ScissorJZY00030Animal surgical incision
Six-well plateThermo140675Culture of UCMSCs
StitchJinhuanF603Close wounds
SutureXy4-0Close wounds
Thermostatic equipmentGrantv-0001-0005Water bath
UCMSCsBai'ao UKK220201Commercially UCMSCs
Vitamin CDiyibioDY40138-25gAggregate inducing
XyleneSCR10023418Dehydrate aggregate

참고문헌

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